孫敬文，郝　靜

作者單位：(150060)中國黑龍江省哈爾濱市，中航工業(yè)哈爾濱242醫(yī)院眼科

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·實(shí)驗(yàn)論著·

番茄紅素對紫外線誘導(dǎo)人晶狀體上皮細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用

孫敬文，郝靜

作者單位：(150060)中國黑龍江省哈爾濱市，中航工業(yè)哈爾濱242醫(yī)院眼科

Citation:Sun JW, Hao J.Protective effect of lycopene for oxidative damage in human lens epithelial cells induced by UV.GuojiYankeZazhi(IntEyeSci) 2016;16(5):826-828

摘要

目的:探討番茄紅素對紫外線誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細(xì)胞(human lens epithelial cells，HLEC)氧化損傷的保護(hù)作用及可能機(jī)制。

方法:HLEC傳代培養(yǎng)，分為陰性對照組、氧化損傷組、番茄紅素低劑量組和番茄紅素高劑量組，MTT比色法檢測細(xì)胞存活率，電子顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，DCFH-DA熒光探針檢測胞內(nèi)ROS變化，分光光度計(jì)檢測上清液中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH)活性及丙二醛(malondialdehyde，MDA)的含量。

結(jié)果:番茄紅素能明顯抑制紫外線誘導(dǎo)的細(xì)胞活性的下降，減少紫外線所致HLEC內(nèi)ROS的生成，引起HLEC內(nèi)SOD和GSH-Px水平的升高及MDA水平的下降。

結(jié)論:番茄紅素通過提高細(xì)胞內(nèi)SOD和GSH-Px含量，降低細(xì)胞內(nèi)MDA含量，發(fā)揮其較強(qiáng)的抗氧化作用，從而為其用于白內(nèi)障防治提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：番茄紅素；紫外線；晶狀體上皮細(xì)胞；氧化損傷

引用：孫敬文，郝靜.番茄紅素對紫外線誘導(dǎo)人晶狀體上皮細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用.國際眼科雜志2016;16(5):826-828

0引言

白內(nèi)障是導(dǎo)致我國老年人致盲的首要因素，多種因素能夠引起晶狀體蛋白質(zhì)變性而形成白內(nèi)障，其中氧自由基損傷是首位危險(xiǎn)因素[1]。研究結(jié)果證實(shí)，在晶狀體發(fā)生混濁之前，就已經(jīng)出現(xiàn)了晶狀體組織及細(xì)胞的氧化損傷[2]。本實(shí)驗(yàn)?zāi)M白內(nèi)障的發(fā)生機(jī)制，體外建立紫外線誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細(xì)胞(human lens epithelial cells，HLEC)氧化損傷模型，分析不同濃度的番茄紅素干預(yù)HLEC后細(xì)胞活力以及相關(guān)因子表達(dá)的變化，并進(jìn)一步探討其細(xì)胞保護(hù)機(jī)制，為用于防治白內(nèi)障提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料和方法

1.1材料人HLEC(ATCC公司)，番茄紅素(Sigma公司，純度為95%)，DMEM培養(yǎng)基，胎牛血清(美國Hyclone公司)，MTT試劑盒(德國Roche公司)，DCFH-DA試劑盒(美國BD公司)，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH)及丙二醛(malondialdehyde，MDA)活力測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)，酶標(biāo)儀(上海精密科學(xué)儀器有限公司)，CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo Forma公司)，超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清，100U/mL青霉素及100μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，將HLEC置于37℃，體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，細(xì)胞生長至近融合狀態(tài)時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化、傳代。

表1番茄紅素對HLEC內(nèi)MDA和SOD及GSH-PX含量的影響

組別MDA(nmol/mL)SOD(U/mL)GSH-Px(U/mL)陰性對照組55.32±2.4367.62±3.44153.37±4.05氧化損傷組83.53±3.56b41.28±4.84b102.28±4.52b低濃度番茄紅素組80.67±3.7551.84±3.40114.18±3.62高濃度番茄紅素組57.28±4.32d69.76±3.30d147.74±4.47d

注：bP<0.01vs陰性對照組；dP<0.01vs氧化損傷組。

1.2.2細(xì)胞分組共分4組：(1)陰性對照組；(2)氧化損傷組；(3)低濃度番茄紅素組：1×10-6mol/L番茄紅素孵育24h；(4)高濃度番茄紅素組：1×10-4mol/L番茄紅素孵育24h。將氧化損傷組及番茄紅素組HLEC垂直放置于紫外線光源下方，撤去培養(yǎng)板蓋，照射強(qiáng)度為30mJ/cm2，照射30min；將陰性對照組置于同室同條件無紫外線照射下30min，然后進(jìn)行相關(guān)因子檢測。電子顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。

1.2.3 MTT檢測細(xì)胞活力細(xì)胞接種于96孔板(細(xì)胞密度5×104/L，每孔120μL培養(yǎng)24h使細(xì)胞融合約80%～90%，將原培養(yǎng)液吸出，向各孔細(xì)胞中加入20μL終濃度為5g/L MTT無血清培養(yǎng)液，培養(yǎng)4h后棄去培養(yǎng)液，加入150μL的DMSO溶液，置搖床搖晃10min后用酶標(biāo)儀測定492nm的光密度值。

1.2.4熒光顯微鏡檢測細(xì)胞內(nèi)ROS表達(dá)HLEC接種于96孔板內(nèi)，用含10μmol/L DCFH-DA探針的培養(yǎng)液在37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20min，平衡鹽溶液沖洗2次后置于熒光顯微鏡下檢測細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度。

1.2.5氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測相應(yīng)干預(yù)后取各組細(xì)胞，裂解后1 200g離心15min取上清液，按試劑盒說明書，使用721D分光光度計(jì)測定細(xì)胞內(nèi)SOD和GSH-Px及MDA含量。

2結(jié)果

2.1番茄紅素對HLEC活性的影響氧化損傷組HLEC經(jīng)氧化損傷處理后，細(xì)胞活性明顯下降(41.40%±4.54%)，與陰性對照組(99.40%±3.43%)比較差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。用不同濃度番茄紅素處理后，HLEC活性分別提高到55.34%±4.01%和75.23%±3.97%，與氧化損傷組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖1)。

2.2不同處理因素下HLEC的形態(tài)學(xué)改變正常HLEC呈長梭形，貼壁生長，胞膜完整，細(xì)胞間界限清晰，氧化損傷組細(xì)胞體積縮小，呈圓形改變，細(xì)胞間可見絲線樣物質(zhì)相連，出現(xiàn)懸浮細(xì)胞(提示壞死細(xì)胞的出現(xiàn))。給予不同濃度的番茄紅素處理后，細(xì)胞形態(tài)逐漸得到改善(圖2)。

2.3番茄紅素對HLEC內(nèi)ROS含量變化的影響采用DCFH-DA熒光探針檢測胞內(nèi)ROS變化情況，氧化損傷組與陰性對照組相比，DCF熒光信號明顯增強(qiáng)，不同濃度番茄紅素干預(yù)后，熒光信號強(qiáng)度逐漸減弱(圖3)。

圖1番茄紅素對HLEC活性的影響aP<0.05vs陰性對照組；bP<0.01vs氧化損傷組。

2.4番茄紅素對HLEC內(nèi)MDA和SOD及GSH-PX含量的影響從表1中可知，氧化損傷組HLEC中MDA含量為83.53±3.56nmol/mL，與陰性對照組(55.32±2.43nmol/mL)比明顯升高，SOD(41.28±4.84U/mL)及GSH-Px(102.28±4.52U/mL)含量明顯下降。給予番茄紅素后，隨著作用劑量的升高，MDA含量有下降的趨勢，番茄紅素高劑量組(57.28±4.32nmol/mL)與氧化損傷組比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；同時(shí)番茄紅素促進(jìn)了SOD(69.76±3.30U/mL)及GSH-Px(147.74±4.47U/mL)含量的升高，番茄紅素高劑量組與氧化損傷組比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

3討論

已有研究證實(shí)，氧化損傷在白內(nèi)障的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用[3-4]。多種原因可引起晶狀體內(nèi)自由基的生成，如自由基的生成率大于其清除率，體內(nèi)活性氧類物質(zhì)蓄積，便會引起晶狀體蛋白質(zhì)和脂質(zhì)過氧化，HLEC受損，長時(shí)間的積累性氧化損傷導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[5-6]。生理狀態(tài)下，機(jī)體抗自由基損傷的酶如SOD和GSH-Px能有效地清除活性氧和自由基，使自由基的產(chǎn)生和清除處于平衡。因此，清除活性氧和修復(fù)氧化損傷被認(rèn)為是預(yù)防和治療白內(nèi)障行之有效的方法[7-8]。

番茄紅素廣泛存在于紅色水果與蔬菜中，抗氧化劑是一種重要的不含氧的類胡蘿卜素，其中尤以番茄中的含量最高。有報(bào)道顯示，其清除單線態(tài)氧的能力是β-胡蘿卜素的2倍，維生素E的100倍[9-10]。番茄紅素分子中含有開鏈不飽和雙鍵的長鏈結(jié)構(gòu)，具有淬滅單線態(tài)氧、清除自由基的能力[11]。國內(nèi)外大量研究已經(jīng)證實(shí)，番茄紅素在預(yù)防胸腺癌和前列腺癌、抗動脈粥樣硬化、抗老化、保護(hù)皮膚、預(yù)防和治療神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病、抗炎方面有一定作用[12]。但是對于HLEC氧化損傷的保護(hù)作用鮮有報(bào)道。

圖2不同處理因素下晶狀體上皮細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變(×100)A：陰性對照組；B：氧化損傷組；C：低濃度番茄紅素組；D：高濃度番茄紅素組。

圖3番茄紅素對HLEC內(nèi)ROS含量變化的影響(×100)A：陰性對照組；B：氧化損傷組；C：低濃度番茄紅素組；D：高濃度番茄紅素組。

HLEC對氧化應(yīng)激損傷較為敏感，我們以傳代培養(yǎng)的HLEC為研究對象，利用紫外線建立細(xì)胞氧化損傷模型，觀察番茄紅素對該細(xì)胞的保護(hù)作用。MTT檢測結(jié)果顯示番茄紅素能夠抑制氧化損傷致HLEC活力的下降，其保護(hù)作用呈劑量依賴性；此外，番茄紅素還能夠有效抑制細(xì)胞內(nèi)ROS的生成；ROS和MDA是氧化應(yīng)激的主要產(chǎn)物，其水平的高低反映了細(xì)胞受自由基損傷和攻擊的程度。用番茄紅素干預(yù)后，HLEC中SOD和GSH-Px活性較氧化損傷組顯著升高，MDA含量顯著降低，提示番茄紅素可能通過提高細(xì)胞內(nèi)SOD和GSH-Px含量，降低細(xì)胞內(nèi)MDA含量發(fā)揮其較強(qiáng)的抗氧化作用。

本研究結(jié)果提示，番茄紅素在白內(nèi)障防治方面的運(yùn)用潛力，對紫外線誘導(dǎo)的HLEC的氧化損傷具有一定的抑制作用，抑制效應(yīng)與藥物濃度正相關(guān)，希望通過對白內(nèi)障發(fā)病機(jī)制更深入的研究，為白內(nèi)障的臨床防治提供新的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

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Protective effect of lycopene for oxidative damage in human lens epithelial cells induced by UV

Jing-Wen Sun，Jing Hao

Department of Ophthalmology, China Aviation Industry 242 Hospital of Harbin, Harbin 150060, Heilongjiang Province, China

Correspondence to:Jing-Wen Sun. Department of Ophthalmology, China Aviation Industry 242 Hospital of Harbin, Harbin 150060, Heilongjiang Province, China. 3051136639@qq.com

Received：2016-01-17Accepted：2016-04-13

Abstract

?AIM:To investigate the protective effect and possible mechanisms of lycopene for oxidative damage induced by ultraviolet in cultured human lens epithelial cells (HLEC).

?METHODS:HLEC was subcultured and divided into negative control group, oxidative injury group, lycopene low dose group and lycopene high dose group. Cell viability was assayed by MTT colorimetric. Cell morphological changes were detected by electron microscope. Reactive oxygen species (ROS) levels were detected with DCFH-DA fluorescent probe. Content of superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GSH) and malondialdehyde (MDA) in supernatants were detected by spectrophotometer.

?RESULTS:Lycopene could obviously inhibited UV-induced decline in cell activity, reduce UV-induced ROS generation within HLEC, cause SOD, GSH-Px levels increased and MDA levels decreased.

?CONCLUSION:Lycopene plays its strong antioxidant role in increasing the intracellular SOD and GSH-Px content levels and decreasing MDA levels, which provide reliable experimental basis for prevent and treatment of cataracts.

KEYWORDS:?lycopene;ultraviolet;human lens epithelial cell;oxidative damage

DOI:10.3980/j.issn.1672-5123.2016.5.08

收稿日期：2016-01-17 修回日期： 2016-04-13

通訊作者：孫敬文. 3051136639@qq.com

作者簡介：孫敬文，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：晶狀體病。