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        高產纖維素酶菌株的篩選

        2016-05-17 20:04:37周成徐磊肖新謝越汪建飛馬忠友
        安徽農學通報 2016年8期

        周成+徐磊+肖新+謝越+汪建飛+馬忠友

        摘 要:該研究從農田土壤中分離得到67株細菌,并從中選出一株高產纖維素酶菌株。將這些菌株接種到纖維素培養(yǎng)基上,在pH 5.5和28℃的條件下,利用剛果紅染色溶液進行染色后,測其水解透明圈與菌落的比值的大小,進行初步篩選。將這些初篩的菌株接種到培養(yǎng)基中進行搖床培養(yǎng)后,制得粗酶液,并分析羧甲基纖維素酶(CMC)活力測定和濾紙酶(FP)活力及β-葡萄糖苷酶(BG)。在不同溫度的條件下,對纖維素酶活力測定,最終篩選出曲霉A25(Aspergillus sp.)這一株菌株,最適酶活溫度為50℃。產纖維素酶酶活力分別為:CMC酶活達2 340.92 U/mL;FP酶活達2.66U/mL;BG酶活達164.72U/mL。

        關鍵詞:羧甲基纖維素酶;濾紙酶;β-葡萄糖苷酶;曲霉A25

        中圖分類號 S154 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731(2016)08-22-04

        Abstract:67 strains of soil bacteria were isolated form farmland,from which a high-yielding cellulase strain was screened.These strains were inoculated on the cellulose medium,and a preliminary screening was conducted,in which we measured hydrolysis transparent circle and the ratio of the size of the colony under pH5.5 and 28℃ conditions by using the Congo Red staining.Furthermore,these selected strains were cultured,and a crude enzyme liquid was extracted for analyzing the activities of carboxymethyl cellulose(CMC),filter paper enzyme(FP)and β-glucosidase(BG).Under different temperature conditions,the activity of cellulase was determined,and ultimately this one strain of Aspergillus A25 was obtained.Its great activity is under the condition of optimum temperature for 50 ℃.Producing cellulose enzyme activity was as following:CMC amounted to 2 340.92 U/mL,FP activity amounted to 2.66 U/mL,and BG activity amounted to 164.72 U/mL.

        Key words:Cerboxymethl cellulose;Filter paper enzyme;β- glucosidase;Aspergillus A25

        纖維素物質是地球上含量最豐富的碳水化合物[1],而目前人類對纖維素的開發(fā)與利用還非常有限,因此如何更有效地開發(fā)和利用纖維素資源已成為當今世界的熱門課題之一。目前,對纖維素的降解利用主要是用酸堿處理等化學手段,以及汽爆及蒸汽加熱等物理手段[2]。生物法由于對設備要求低,分解后的產物易回收利用,以及對環(huán)境污染較小等特點而備受重視。纖維素是一個復雜酶系,根據其功能的不同可分為3類:作用于纖維素非結晶區(qū)的內切葡聚糖酶(CMC);作用于無定型區(qū)切割糖苷鍵的外切葡聚糖酶(FP);以及作用于纖維二糖的β-葡萄糖苷酶(BG)[3-5]。協(xié)同作用才能將結構復雜的天然纖維降解。纖維素酶在食品、洗滌、紡織、飼料、造紙等方面具有廣泛的應用和發(fā)展前景[5]。通過對本實驗室保存的67株菌株進行初篩和復篩,A25這一株菌株是本次實驗所篩選的,具有較高降解纖維素活力的菌株,本文對其纖維素酶的生產培養(yǎng)特性進行研究,對于了解其降解機制以及實際應用都有重要意義。

        1 材料與方法

        1.1 材料 從農田土壤中分離得到67株土壤細菌。

        1.2 實驗方法

        1.2.1 DNS法標準曲線的制備 稱0.05g經105℃烘干至恒重的葡萄糖溶于少量蒸餾水中,用蒸餾水定溶至500mL配制成濃度為50μg/mL的葡萄糖溶液。取0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL和1.2mL葡萄糖溶液再加入蒸餾水將體積配制至10mL。再分別從中取2mL,再加蒸餾水1.0mL再加DNS試劑2.0mL搖勻,置于沸水中煮沸5min,取出置與冷水中冷卻到室溫,測其OD530值。根據OD值,以葡萄糖濃度為縱坐標,吸光值為橫坐標,列出直線回歸方程(Y=aX+b)。

        1.2.2 產纖維素酶菌株的培養(yǎng) 在無菌條件下,將67株菌株接種到纖維素培養(yǎng)基中,放在培養(yǎng)箱里溫度為28℃,培養(yǎng)48h。

        1.2.3 剛果紅染色 把培養(yǎng)好的霉菌用剛果紅染色劑覆蓋培養(yǎng)皿一層進行染色30min。然后用0.9%生理鹽水沖洗2~3次,觀察其透明圈的大小,并計算出H/C的比值即酶活,(酶活性=透明圈直徑的值與菌落直徑的比值)。根據比值的大小進行初步篩選。

        1.2.4 粗纖維酶液的制備 在無菌操作下,將初步篩選的7株霉菌分別接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中,搖瓶培養(yǎng)3~4d,溫度為28℃,轉速為160r。

        1.2.5 纖維素酶發(fā)酵液的處理 纖維素酶霉菌搖瓶培養(yǎng)好后,用循環(huán)水式抽濾機進行抽濾。將濾液轉入到原三角燒瓶中,放入冰箱備用。

        1.2.6 酶活力的測定 采用DNS法(3,5-二硝基水楊酸比色法)[6-7]。

        1.2.7 羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)酶活力測定 以2.0mL 20%(w/v)羧甲基纖維素鈉溶液為底物,用pH5.0檸檬酸緩沖液配制)。加1mL稀釋酶液于50℃,恒溫水浴反應30min,然后加入2mL DNS顯色液,終止反應,煮沸5min,再放入冰水中冷卻至室溫。用722S分光光度計在530nm處測定光密度OD值,同時相同條件作空白樣調零。

        1.2.8 濾紙(FP)酶活力測定 精確吸取4.0mL稀釋酶液和1.0mL pH4.6的乙酸-乙酸鈉緩沖液,置于試管中,加入新華5號濾紙條(1×3cm)一條,滴入甲苯2~3滴防腐。40℃反應24h。吸取上述濾紙酶液2.0mL加入蒸餾水1.0mL,2.0mL DNS顯色液,終止反應。沸水煮沸5min,然后再放入冷水中冷卻至室溫。在530nm處測定光密度OD值,同時相同條件下作空白調零。

        1.2.9 β-葡萄糖酶(BG)活法測定 取1.0mL稀釋酶液加2.0mL pH4.6乙酸-乙酸鈉緩沖液配制的1%的水楊酸溶液,50℃酶解30min,加入2.0mL DNS顯色液,終止反應,于沸水中水浴5min,用冷水冷卻至室溫,在530nm處測定其OD值,同時相同條件下作空白調零。

        1.4 濾紙崩潰實驗 取稀釋酶液4.0mL和1.0mL pH4.6的乙酸-乙酸鈉緩沖液置于試管中。(15×50cm)加入新華5號濾紙條(1×3cm)一條,滴入甲苯2~3滴(防腐),于恒溫箱內40℃保溫24h。觀察濾紙崩潰情況,觀測標準如下:+++表示濾紙完全沉在底部,搖動試管后濾紙呈糊狀;++表示濾紙完全下沉,搖后呈小片狀;+表示濾紙沿底部呈毛狀,搖后部分溶化;-表示濾紙直立完整無缺,搖后不溶化。

        1.5 還原糖含量的測定 采用DNS法[9]測還原糖。

        2 結果與分析

        2.1 高產纖維素酶菌株的初篩 將67株菌株接種到羧甲基固體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)48h,用剛果紅染色靜止30min后測其H/C的比值,結果見表2。

        從本實驗室保存的67株菌株中,將各菌株分別采用纖維素固體培養(yǎng)基進行富集培養(yǎng)并進行篩選,從中篩選出高產纖維素酶菌株。從表2這些菌株的透明圈的直徑與菌落的直徑比值大小可以看出,A25、A5、O7、O8O9、D2、H7、HD的H/C比值較高,這7株產纖維素酶能力較強,紅色水解透明圈較明顯、較大,具有較高的纖維素酶活力。H/C是透明圈與菌落的比值,比值越大酶活越強。根據紅色水解透明圈出現的快慢、大小可大致得出該菌株的產纖維素酶情況,這可作為初次判斷的依據。通過表2的結果說明A25、A5、O7、O8O9、D2、H7、HD7株菌株具有較高的酶活力。

        2.2 葡萄糖標準曲線的繪制 參照1.2.1所描述的方法制備出標準葡萄糖曲線(圖1),根據標準葡萄糖曲線求出直線回歸方程y=0.003 4x-0.505,R2=0.996 8(y:葡萄糖濃度,x:OD530的值),通過直線回歸方程可以計算纖維素酶酶促反應中產生葡萄糖的濃度,從而根據酶活力單位定義算出酶活。

        2.3 高產纖維素酶菌株的復篩 挑選上述試驗中濾紙酶活性較高的7個菌株進行進一步試驗,將所獲得的菌株A25、A5、O7、0809、D2、H7、HD菌株接到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中進行搖床發(fā)酵培養(yǎng)后,在獲得發(fā)酵液的基礎上制得粗酶液。測定其濾紙酶活、CMC酶活和β-葡萄糖苷酶活。各菌株均設3個處理,取其平均值,如表3。

        2.4 溫度對酶促反應的影響 溫度對酶促反影響的原因主要有以下2個方面,一是溫度對酶蛋白穩(wěn)定性的影響,即對酶熱變性失活作用,二是溫度對酶促反應本身的影響,其中可能包括影響酶和底物的結合,影響Vmax,影響酶和底物分子解離基團的pK,影響酶與抑制劑、激活劑或輔酶的結合等[8]。吸粗酶液2mL和2mL DNS和1mL蒸餾水加入試管分別于40℃、50℃、60℃、70℃和80℃不同水浴鍋中處理30min后,對菌體的酶活進行檢測,其結果見圖2。由圖2可見,反應溫度對菌株A25的酶活有顯著影響,其最適酶活溫度為50℃,當水浴處理溫度高于50℃或低于50℃時,該菌株A25酶活減弱,但是培養(yǎng)液仍具有較高的纖維素酶活力;同時也表明該菌株所產的纖維素酶具有較高熱穩(wěn)定性??梢姡?0℃所測得的酶活力最高,即此酶的最適酶活溫度為50℃。

        3 討論

        3.1 高產纖維素酶菌株的初篩 纖維素在纖維素酶的作用下水解成纖維二糖和葡萄糖,水解后的糖類與剛果紅染料形成紅色沉淀,使產酶菌株的菌落周圍出現清晰的紅色水解圈,根據水解圈的大小可粗略的估計菌株產酶的情況,然后選取透明圈較大的菌株進行接種。剛果紅是對纖維素酶進行初步篩選的試驗方法,實驗方法比較簡單。通過它可以使纖維素固體培養(yǎng)基上的菌種的代謝產物形成淺紅色水解透明圈。用剛果紅染液覆蓋培養(yǎng)皿一層靜止染色30min,纖維素酶菌株產纖維素酶越多,產生的紅色水解透明圈越大,產纖維素酶速度越快,淺紅色水解透明圈出現的越早。雖然水解透明圈H/C的比值大小直接反映了酶活水平的高低,但不能完全代表菌株產酶能力,不能定量說明該菌株產纖維素酶的能力。也有研究表明液體樣品的酶濃度與透明圈的直徑(下轉127頁)(上接24頁)成線性關系,可以對酶活進行初步定量[10]。

        3.2 高產纖維素酶菌株的復篩 已知纖維素酶的作用方式:CO酶是使天然纖維素晶體分鏈,起一個分離和水合作用,從而使天然纖維素裂解成為直鏈纖維素;而C0酶雖不能水解天然纖維素,但能水解直鏈纖維素的β-l,4-葡萄糖苷鍵生成纖維二糖,纖維二糖再經β-葡萄糖苷酶水解成為葡萄糖。前人研究認為,纖維素的降解關鍵是濾紙酶活的高低,再結合β-葡萄糖苷酶活,而CMC酶活只作參考。通過對7個菌株發(fā)酵液的濾紙酶活、CMC酶活、β-葡萄糖苷酶活進行測定,初步篩選出產纖維素酶活力較高的A25菌株。初步試驗表明,在50℃反應時間30min,pH5.5時A25菌株產生的纖維素酶的活性有較大提高。建議對A25進行進一步的優(yōu)化試驗,以探明其最適的產酶條件,或對其進行進一步的誘變,以提高其酶活性應用于生產實踐。

        3.3 溫度對纖維素酶活性的影響 從粗酶液中吸粗酶液2mL和2mL DNS和1mL蒸餾水加入試管中,在不同的水浴溫度下水浴處理30min后,對菌體的產酶量進行檢測。為了確定酶活的最適溫度,通過測40~80℃不同溫度下的實驗確定酶活,不同培養(yǎng)溫度對纖維素酶有不同的影響,結果表明,曲霉A25水浴處理在40℃時酶活力表現較低,50℃時酶活力達到最大值,水浴處理溫度超出50℃時酶活力逐漸變小。對于纖維素酶活的最適溫度為50℃,即纖維素酶產量的最適溫度在50℃。

        參考文獻

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        (責編:張宏民)

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