陳欣 陳光英 陳文豪 韓長日 宋小平 吳燕

摘 要 采用水蒸氣蒸餾法提取海南黃芩揮發(fā)油，用GC-MS對(duì)其化學(xué)成分進(jìn)行分離鑒定；采用微量稀釋法對(duì)揮發(fā)油進(jìn)行抗菌活性測(cè)試和MTT比色法進(jìn)行抗腫瘤活性測(cè)試。結(jié)果從海南黃芩揮發(fā)油中分離得到71個(gè)峰，鑒定了其中的54個(gè)成分，占揮發(fā)油總量的90.42%，其主要成分為：10S，11S-雪松醛-3（12），4-二烯（15.3%）、石竹烯（7.92%）、鄰苯二甲酸單乙基己基酯（6.99%）和4-乙烯基-2-甲氧基苯酚（6.54%）。藥理活性研究表明，海南黃芩揮發(fā)油對(duì)白色葡萄球菌等7種菌株未顯示抑制活性，而對(duì)宮頸癌（Hela）細(xì)胞和肺腺癌（A549）細(xì)胞具有較好的抑制活性，其IC50值分別為36.56和29.21 μg/mL。海南黃芩揮發(fā)油具有豐富的化學(xué)成分，藥理活性表明，海南黃芩具有較好的抗腫瘤活性。

關(guān)鍵詞 海南黃芩 ；揮發(fā)油 ；化學(xué)成分 ；抗腫瘤活性

中圖分類號(hào) TS201.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.05.019

Abstract The essential oil is extracted by steam distillation and the chemical composition of oil is separated and identified by GC-MS. The antibacterial and antitumor activities of volatile oils are tested by microdilution methods and the MTT assay， respectively. 71 chromatographic peaks are detected and 54 compounds are identified， which accounted for 90.42% of the total essential oil. The main components were 10S， 11S-himachala-3（12），4-diene （15.3%）， caryophyllene （7.92%）， monoethyl hexylphthalate （6.99%） and 2-methoxy-4-vinylpheno （6.54%）. The analysis of pharmacological activity shows that the essential oil has no inhibitory activity agaist Staphylococcus albus， but has inhibitory activity agaist Hela and A549. The IC50 values were 36.56 and 29.01 μg/mL， respectively. The Hainan Scutellaria's volatile oil have abundant types of chemical constituents， its antitumor activity is strong.

Keywords Scutellaria hainanensis ； essential oil ； chemical constituent ； anti-tumor activity

唇形科黃芩屬（Scutellaria）植物廣泛分布于溫帶和熱帶山脈地區(qū)，遍及歐洲、北美和東亞，約有360多個(gè)物種。在我國明確記載的有102種，50個(gè)變種，多為藥用。2010年版《中國藥典》中收錄了2種：黃芩（S. baicalensis）和半枝蓮（S. barbata D）[1]?，F(xiàn)代研究表明，黃芩屬植物具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、抗驚厥、抗菌、抗病毒和保肝等作用。其中，黃酮和萜類化合物是黃芩屬植物的特征成分，黃酮如黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素具有抗腫瘤、抗HIV、抗菌、抗炎和抗驚厥活性；而萜類化合物Jodrellin A、Jodrellin B、scutalbin A和scutecyprol B表現(xiàn)出很好的抗拒食活性[2]。海南黃芩為唇形科黃芩屬植物，為多年生草本，長于石山上，是海南特有物種[3]。目前尚未見關(guān)于海南黃芩化學(xué)成分與藥理活性的文獻(xiàn)報(bào)道。本文采用水蒸氣蒸餾的方法提取海南黃芩的揮發(fā)油，并且采用GC-MS聯(lián)用技術(shù)對(duì)其揮發(fā)油進(jìn)行成分分析，同時(shí)采用紙片瓊脂擴(kuò)散法和MTT比色法分別研究其抗菌和抗腫瘤活性。本研究對(duì)海南黃芩揮發(fā)油的化學(xué)成分及其抗菌抗腫瘤活性進(jìn)行了研究，以期為海南黃芩的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

海南黃芩（Scutellaria hainanensis），2014年9月采自海南省昌江黎族自治縣，經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所海南分所李蓉濤研究員鑒定，標(biāo)本存放于海南師范大學(xué)熱帶藥用植物化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

供試菌種及腫瘤細(xì)胞：白色葡萄球菌（Staphylococcus）、蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、大腸桿菌（Escherichia coli）、四聯(lián)球菌（Pediococcus） 和藤黃八疊球菌（Micrococcus luteus）均購于中國科學(xué)院微生物研究所；宮頸癌（Hela）、肺腺癌（A549）為中科院上海生物所提供。

1.1.2 儀器與試劑

5975B/6890N 型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國安捷倫公司）、Elx800型酶標(biāo)儀（美國寶特公司）、智能恒溫恒濕箱（寧波海曙賽福實(shí)驗(yàn)儀器廠）、高壓滅菌鍋（日本森展企業(yè)有限公司）、ELx808吸收光酶標(biāo)儀（美國伯騰儀器有限公司）、超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備廠）、可調(diào)式移液器（BRAND公司）、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（Pore公司）、電子天平（Sartious公司）、二甲基亞砜（DMSO）（天津市化學(xué)試劑二廠）、RPMI 1640培養(yǎng)液（Gibco公司）、胰酶（Gibco公司）、四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）（Sigma公司）、胎牛血清（杭州四季青生物科技有限公司）。實(shí)驗(yàn)所用試劑均為市售分析純，水為蒸餾水。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)條件

GC-MS分析色譜條件：石英毛細(xì)管柱HP-FFAP（250 m×30 m×0.25 m），初始溫度50℃，保持1 min，以2℃/min速率升溫到70℃保持2 min，以5℃/min升溫速率到280℃保持至完成分析，載氣為He（99.99%），柱流量1.0 mL/min，進(jìn)樣口溫度250℃，分流比50∶1。質(zhì)譜條件：電離方式為EI電子源，電子能量為70 eV，離子源溫度為230℃，四級(jí)桿溫度為150℃，溶劑延遲為2.5 min，全掃描（Scan）采集模式，質(zhì)量范圍m/z 38～698，掃描間隔0.50 s，EM電壓1 400 V。

1.2.2 揮發(fā)油的提取

海南黃芩揮發(fā)油的提?。簩敫稍锏暮Ｄ宵S芩總重量230 g，剪碎，分2次用水蒸氣蒸餾法[5]提取揮發(fā)油，再用無水乙醚萃取3次，萃取液加無水硫酸鈉干燥，30℃水浴蒸餾回收乙醚，最后得到具有芳香性氣味，淡黃色油狀液體，重量為1.296 g，得油率為0.56%。

1.2.3 體外抗菌實(shí)驗(yàn)

采用微量稀釋法，對(duì)以下7種致病菌菌株進(jìn)行抗菌測(cè)試：藤黃八疊球菌（Micrococcus luteus）ATCC 11001，大腸桿菌（Escherichia coli）ATCC 25922，金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC 27154，白色葡萄球菌（Staphylococcus albus）ATCC 8799，蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）ACCC 11077，四聯(lián)球菌（Micrococcus tetragenus）ATCC 13623和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）ACCC 11060。將一定量的海南黃芩揮發(fā)油溶于1 mL的DMSO中，得到儲(chǔ)備溶液。菌種在37℃條件下，接種于營養(yǎng)肉湯中震蕩過夜，使用時(shí)稀釋至106 cfu/mL。營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基作空白對(duì)照，DMSO用作陰性對(duì)照，環(huán)丙沙星作陽性對(duì)照。

1.2.4 體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)

揮發(fā)油抗腫瘤活性測(cè)試：用含10%胎牛血清的培養(yǎng)液（DMEM）配成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔5 000個(gè)細(xì)胞接種到96孔板，每孔體積100 μL，貼壁細(xì)胞提前12 h接種培養(yǎng)。加入待測(cè)樣品溶液（固定濃度40 μg/mL初篩，在該濃度對(duì)腫瘤細(xì)胞生長抑制在50%附近的化合物設(shè)5個(gè)濃度進(jìn)入梯度復(fù)篩）100 μL，每孔終體積100 μL，每種處理均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。37℃培養(yǎng)48 h后，每孔加MTT溶液20 L。繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加150 L的DMSO溶液，使結(jié)晶物充分溶解。選擇490 nm波長，酶標(biāo)儀（BioTek ELx800）讀取各孔光吸收值，記錄結(jié)果。計(jì)算化合物的IC50值[6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 海南黃芩揮發(fā)油成分

本實(shí)驗(yàn)利用水蒸氣蒸餾法制備海南黃芩揮發(fā)油得到特殊香氣的淺黃色油狀物。用毛細(xì)管色譜法對(duì)揮發(fā)油樣品進(jìn)行測(cè)定，GC共分析出71個(gè)峰，通過色譜峰面積歸一化法測(cè)得揮發(fā)油中各組分的相對(duì)百分含量[4]，根據(jù)GC-MS聯(lián)用所得的質(zhì)譜信息，經(jīng)用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜檢索庫計(jì)算機(jī)檢索，共鑒定出54個(gè)化學(xué)成分，占揮發(fā)油總質(zhì)量的90.42%。其主要成分為10S，11S-雪松醛-3（12），4-二烯（15.3%）、石竹烯（7.92%）、鄰苯二甲酸單乙基己基酯（6.99%）和4-乙烯基-2-甲氧基苯酚（6.54%）（表1）。

2.2 海南黃芩揮發(fā)油抗菌結(jié)果與分析

目前，針對(duì)黃芩屬植物揮發(fā)油抗菌活性研究較少，但均表現(xiàn)出很好的抑制活性。如：Charu C. Pant等[7]對(duì)Scutellaria grossa的揮發(fā)油進(jìn)行抗菌活性測(cè)試，發(fā)現(xiàn)其對(duì)革蘭氏陽性菌、枯草芽孢桿菌、糞腸球菌、革蘭氏陰性菌、肺炎克雷伯菌和沙門氏菌有顯著的抑制活性；Anan d B. Melkani等[8]對(duì)Scutellaria repens進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其揮發(fā)油對(duì)大腸桿菌、糞腸球菌、肺炎克雷伯菌有顯著的抑制活性。因此，本實(shí)驗(yàn)利用微量稀釋法對(duì)海南黃芩揮發(fā)油抑菌活性進(jìn)行研究，然而，發(fā)現(xiàn)其對(duì)白色葡萄球菌、蠟狀芽孢桿菌等7種細(xì)菌未顯示抑制活性，MIC值均大于20 μg/mL。測(cè)試結(jié)果見表2。

2.3 海南黃芩揮發(fā)油抗腫瘤結(jié)果與分析

目前，鮮見關(guān)于黃芩屬植物揮發(fā)油的抗腫瘤活性測(cè)試的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用MTT比色法對(duì)揮發(fā)油進(jìn)行抗腫瘤活性研究，發(fā)現(xiàn)其對(duì)宮頸癌（Hela）和肺腺癌（A549）2種細(xì)胞株具有較好的抑制活性，IC50值分別為36.56和29.21 μg/mL 。

3 討論與結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)海南黃芩的揮發(fā)油成分進(jìn)行研究，分析出71個(gè)峰，并鑒別出了其中的54個(gè)成分，占揮發(fā)油總量的90.42%。其中主要成分為10S，11S-雪松醛-3（12），4-二烯（15.30%）、石竹烯（7.92%）、鄰苯二酸單乙基己基酯（6.99%）和4-乙烯基-2-甲氧基苯酚（6.54%）等。藥理活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，海南黃芩揮發(fā)油未顯示抗菌活性，而對(duì)宮頸癌（Hela）和肺腺癌（A549）2種細(xì)胞株有較好的抑制活性，IC50值分別為36.56和29.21 μg/mL。

在海南黃芩的揮發(fā)油的主要成分中，石竹烯（含量為7.92%）對(duì)皮膚炎癥及消化系統(tǒng)潰瘍有較好的療效，具有抗氧化作用[9]，廣泛應(yīng)用于香料、食品工業(yè)、和藥物合成中間體等領(lǐng)域。因此，可以考慮將海南黃芩揮發(fā)油作為食品的抗氧化劑，當(dāng)然其在食品貯藏期間的穩(wěn)定性有待進(jìn)一步研究。將海南黃芩揮發(fā)油與張福維等[10]報(bào)道的黃芩地上部分揮發(fā)性物質(zhì)成分和鞏江等[11]報(bào)道的半枝蓮揮發(fā)性成分進(jìn)行比較，同屬的3種植物揮發(fā)性物質(zhì)的組成和含量有較大的差異。本實(shí)驗(yàn)為黃芩、半枝蓮和海南黃芩3種藥用植物的中藥標(biāo)準(zhǔn)提供了理論依據(jù)。

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