朱鳳珠 魯梅 譚劉剛 孔正杰 黃慶華 黃艷艷 楊少華 張秀美 崔言順 許傳田

摘要：為了探究NP蛋白T細(xì)胞表位多肽NP67-74-KLH對(duì)流感通用疫苗4M2e-MAP免疫效果的影響，本研究將多肽NP67-74-KLH和4M2e-MAP添加完全弗氏佐劑和不完全弗氏佐劑后免疫BALB/c小鼠，通過攻毒保護(hù)試驗(yàn)來評(píng)價(jià)免疫效果。攻毒以后小鼠體重變化曲線說明，聯(lián)合免疫多肽疫苗NP67-74-KLH和4M2e-MAP的試驗(yàn)組小鼠體重變化趨勢(shì)比單一免疫4M2e-MAP合成肽疫苗更加趨于平穩(wěn)，并且聯(lián)合免疫試驗(yàn)組小鼠體重恢復(fù)較快。熒光定量和肺部組織病理切片結(jié)果均表明，復(fù)合多肽（NP67-74-KLH和4M2e-MAP）能在一定程度上干擾流感病毒在臟器肺中的復(fù)制并能夠降低病毒對(duì)肺部的損傷程度，在抵抗病毒過程中可以產(chǎn)生有效保護(hù)。該研究為多肽疫苗聯(lián)合應(yīng)用以抵抗流感研發(fā)提供了較好思路。

關(guān)鍵詞：禽流感；多肽疫苗；免疫效果

中圖分類號(hào)：S852.4文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2016）06-0105-04

由禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）各種亞型引起的禽類疾病綜合征就構(gòu)成了禽流感（Avian influenza，AI），幾乎所有的野生和家養(yǎng)禽類都能感染[1]。AIV是引發(fā)流感爆發(fā)的主要病原，高變異性是該病毒的特性。從理論上講，該病毒大約有 256 個(gè)血清亞型，而這些亞型之間又可進(jìn)行重新組合，進(jìn)而導(dǎo)致病毒的不斷變異與宿主改變。二十一世紀(jì)初，對(duì)于盛行的禽流感，WHO已經(jīng)向全世界提出了警示，大多數(shù)國家和地區(qū)也已經(jīng)將禽流感作為第一監(jiān)視對(duì)象，在我國為 A 類動(dòng)物疫病。AI 對(duì)全世界養(yǎng)禽業(yè)的危害日益嚴(yán)重，香港在1997年首次從1名三歲兒童體內(nèi)分離到一株 H5N1亞型禽流感病毒，表明 AI不僅可以感染禽類，還正在不斷獲得感染人的能力[2]。因此當(dāng)前面臨的艱巨任務(wù)是減少該病出現(xiàn)。解決這項(xiàng)艱巨任務(wù)最有用、最現(xiàn)實(shí)、最實(shí)惠的手段之一就是疫苗的研發(fā)與應(yīng)用。疫苗的理想狀態(tài)應(yīng)是，在安全性良好的條件下，不但能激發(fā)機(jī)體的體液免疫，產(chǎn)生和病毒中和的抗體，更能充分激發(fā)機(jī)體的細(xì)胞免疫而使病毒清除機(jī)制得到有效發(fā)揮。禽流感預(yù)防控制的關(guān)鍵措施之一是疫苗的免疫使用，使用疫苗防治HPAIV最早的的國家就是中國[3]。

目前流感疫苗的保護(hù)效率大大被疫苗株和抗原變異所限制。流感病毒亞型眾多，尋找一種具有交叉保護(hù)作用的疫苗仍然是抗流感的關(guān)鍵。

流感病毒的跨膜蛋白是M2 基質(zhì)蛋白， 24 個(gè)氨基酸組成了該蛋白的胞外功能區(qū)（M2 ectodomain，M2e），該片段在不同亞型之間具有高保守性[5]。1933 年，初次分離到人流感病毒，在將近一個(gè)世紀(jì)內(nèi)， M2e 在 A 型人流感病毒中只出現(xiàn)兩個(gè)氨基酸位點(diǎn)的改變[6]。M2e疫苗誘導(dǎo)的保護(hù)性免疫應(yīng)答主要是由抗體介導(dǎo)，但是理想的抗原應(yīng)該同時(shí)具備激發(fā)體液免疫和細(xì)胞免疫的能力。NP蛋白由AIV基因組中的節(jié)段 5 編碼，它同時(shí)擁有種群和型的特異性，在不同亞型病毒之間有高度保守性，該蛋白是誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞（CTL） 反應(yīng)的主要抗原，并且至少包括 3 個(gè)獨(dú)立的抗原位點(diǎn)。NP蛋白上含有大量的 CD8+T 細(xì)胞識(shí)別的表位，誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫可抵御不同亞型流感病毒的感染[4]。保護(hù)機(jī)體免受病毒攻擊的主要機(jī)制是誘導(dǎo)機(jī)體的細(xì)胞免疫反應(yīng)[7]。因此本研究旨在通過添加T細(xì)胞表位多肽NP67-74-KLH來增強(qiáng)抗原激發(fā)體液免疫和細(xì)胞免疫的能力，研究NP67-74-KLH+4M2e聯(lián)合免疫的效果，為更深層次的流感病毒疫苗研究奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)毒株和動(dòng)物

H9N2禽流感攻毒株（A/chicken/Henan/A1/08），由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。6～8 周齡 BALB/c 雌性小鼠，購自山東大學(xué)動(dòng)物醫(yī)院。

1.2主要試劑

弗氏完全佐劑（Freunds Complete Adjuavant， FCA） 和弗氏不完全佐劑（Freunds Incomplete Adjuavant， FIA），購自 SIGMA 公司；其余試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。4M2e分支肽（4M2e-MAP）與多肽NP67-74-KLH，由上海生爾吉化生物技術(shù)公司合成，純度為90%。引物序列：M2e（F1：5′-gtgcgcggatcc-3′；F2：5′-ctcgagttatcaagatct-3′）。

1.3攻毒試驗(yàn)

將40只6～8 周齡健康雌性 BALB/c小鼠隨機(jī)分成4組，即：一組小鼠免疫4M2e-MAP合成肽，一組同時(shí)免疫4M2e-MAP合成肽和多肽NP67-74-KLH，其余兩組小鼠作為對(duì)照組，分別免疫相同體積的弗氏佐劑和PBS。采用皮下接種的方式對(duì)小鼠進(jìn)行免疫，共免疫2次，間隔2周。首免和二免劑量均為200 μL/只，且除PBS對(duì)照組外，其它三組首免輔以完全弗氏佐劑，二免輔以不完全弗氏佐劑。二免后兩周進(jìn)行攻毒，攻毒方式為滴鼻，免疫劑量為106.8 EID50/只。PBS免疫對(duì)照組的小鼠不進(jìn)行攻毒。攻毒前一天對(duì)小鼠進(jìn)行稱重記錄，攻毒后每天同一時(shí)間稱取各組小鼠體重，比較體重變化，并在攻毒后觀察記錄小鼠的精神狀態(tài)和計(jì)算存活率。

1.4Q-PCR檢測(cè)肺臟病毒含量

攻毒的H9N2禽流感攻毒株是弱毒，對(duì)小鼠不產(chǎn)生致死，攻毒后3 d每組隨機(jī)取3只小鼠用干冰麻醉處死，于無菌條件下取其肺臟組織放入500 μL 含有雙抗的 PBS 中，同時(shí)加入無菌鋼珠經(jīng)碾磨機(jī)振蕩碾碎，離心后取其上清。其中400 μL用于提取RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA 后采用引物進(jìn)行Real-Time PCR 檢測(cè)?？偡磻?yīng)體系20 μL：cDNA模板1 μL、SYBR Premix Ex TaqTM 10 μL、上下游引物（10 μmol·L-1）各0.5 μL、去離子水8 μL，混和均勻后在熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2 min；95℃，10 s；55℃，15 s；72℃，20 s；擴(kuò)增45個(gè)循環(huán)；72℃延伸時(shí)采集熒光信號(hào)。以鼠β-actin基因作為內(nèi)參基因校正試驗(yàn)的誤差。每組樣品的M2e基因 mRNA的精確拷貝數(shù)由熒光曲線的Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算獲得。

1.5肺組織病理學(xué)觀察

于攻毒后第3 d每組隨機(jī)取3只小鼠，無菌條件下取其肺臟，在10%甲醛溶液中進(jìn)行固定，之后制作HE染色切片，在顯微鏡下觀察組織切片病理變化。

2結(jié)果與分析

2.1小鼠體重變化

攻毒后觀察小鼠的精神狀態(tài)，每組差別不是很明顯，都也沒有出現(xiàn)死亡情況。小鼠體重變化如圖1，在攻毒后的第4～6 d，除PBS對(duì)照組以外，每組小鼠體重均有下降，之后小鼠體重開始回升并逐漸趨于穩(wěn)定狀態(tài)，NP67-74-KLH+4M2e組小鼠體重回升趨勢(shì)較4M2e組要快。

2.2肺臟病毒含量的測(cè)定

將反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA 按實(shí)驗(yàn)室建立的實(shí)時(shí)熒光定量 PCR方法進(jìn)行檢測(cè)。公式計(jì)算待測(cè)組目的基因相對(duì)于空白對(duì)照組的表達(dá)差異倍數(shù)（圖2）顯示，佐劑攻毒組、4M2e組和NP67-74-KLH+4M2e組樣品表達(dá)差異倍數(shù)分別為0.6783、0.4263、0.1233，佐劑攻毒組與4M2e組樣品表達(dá)差異倍數(shù)顯著高于NP67-74-KLH+4M2e組樣品（P<0.05）。表明，佐劑攻毒組的肺臟病毒含量最高，4M2e組病毒含量次之，NP67-74-KLH+4M2e組含量最低，說明免疫多肽NP67-74-KLH+4M2e組的效果優(yōu)于單獨(dú)免疫4M2e組，NP-KLH能提高4M2e的免疫效果。

2.3肺組織病理學(xué)觀察

在佐劑攻毒組中，小鼠肺臟結(jié)構(gòu)被中度破壞，左上部肺泡充血，右下部肺泡炎性細(xì)胞增多，支氣管周圍有大量的淋巴細(xì)胞浸潤，小血管周圍炎性細(xì)胞浸潤，見圖 3A； NP67-74-KLH+4M2e 組小鼠的肺泡間充血并且伴隨少量的炎性細(xì)胞浸潤，見圖 3B；4M2e組小鼠肺泡充血，肺泡腔中有散在紅細(xì)胞以及纖維素樣物質(zhì)滲出，見圖 3C。該結(jié)果表明，NP67-74-KLH+4M2e組小鼠能在一定程度上抵抗病毒感染。

3討論與結(jié)論

本研究實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)病毒含量結(jié)果表明，肺臟病毒含量佐劑攻毒組>4M2e組>NP67-74-KLH+4M2e組，說明免疫多肽NP67-74-KLH+4M2e組的效果優(yōu)于單獨(dú)免疫4M2e組，NP67-74-KLH能提高4M2e的免疫效果。該方法較有效控制了擴(kuò)增產(chǎn)物污染所致的假陽性，是由于試驗(yàn)中只有加樣品時(shí)的一次開蓋，完全閉管操作；肉眼分析結(jié)果被檢測(cè)用的熒光值所代替，這就有效避免了人為因素干擾；定量結(jié)果由計(jì)算機(jī)軟件自動(dòng)化生成，其靈敏度比常規(guī)方法提高了2～3個(gè)數(shù)量級(jí)，達(dá)到了精準(zhǔn)定量檢測(cè)，易于檢測(cè)的精確化。本方法檢測(cè)cDNA，更靈敏地反映了AIV的感染情況和排毒情況。它具有靈敏性高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便、快速高效等優(yōu)點(diǎn)，還可以進(jìn)行多重?cái)U(kuò)增[8]。

熒光定量檢測(cè)和肺部組織的病理切片結(jié)果均表明，各免疫組小鼠肺臟結(jié)構(gòu)基本保持完整，NP67-74-KLH+4M2e組小鼠的肺泡間充血并且伴隨少量的炎性細(xì)胞浸潤，4M2e組小鼠肺泡充血，肺泡腔中有散在紅細(xì)胞以及有纖維素樣物質(zhì)滲出。說明復(fù)合多肽（NP67-74-KLH和4M2e-MAP）能在一定程度上干擾流感病毒在臟器肺中的復(fù)制并能夠降低病毒對(duì)肺部的損傷程度，在抵抗病毒過程中可以產(chǎn)生有效的保護(hù)。該研究為多肽疫苗的聯(lián)合應(yīng)用以抵抗流感的研發(fā)提供了較好的思路。

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