張超 王英臣

摘 要：以吉林地區(qū)的錦燈籠皮為原料，利用微波輔助復(fù)合酶法對(duì)錦燈籠皮中果膠進(jìn)行工藝優(yōu)化研究。研究了微波輻射時(shí)間、加酶比例（m半纖維素：m纖維素）、復(fù)合酶用量（m半纖維素：m纖維素=1：1）、微波功率、料液比、酶解溫度、pH值、酶解時(shí)間對(duì)果膠提取的影響。采用Box-Behnken Design 響應(yīng)面優(yōu)化得到最佳工藝條件為微波輻射時(shí)間3.35min、加酶比例1：1.27、復(fù)合酶用量（1：1.27）7.78mg、微波功率399.39w。在此條件下驗(yàn)證果膠得率為9.368%，總半乳糖醛酸為63.02%，通過(guò)工藝優(yōu)化研究可知，實(shí)際果膠得率遠(yuǎn)小于預(yù)測(cè)果膠得率。

關(guān)鍵詞：錦燈籠皮；果膠；提取；響應(yīng)面分析；微波；復(fù)合酶

中圖分類(lèi)號(hào)：Q539.8 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.11974/nyyjs.20160431002

果膠是一種可溶性纖維，具有許多對(duì)人體有益的特性，對(duì)人體的健康起一定的作用。果膠是制作人類(lèi)食品和化妝品的天然成分，同時(shí)是食品添加劑聯(lián)合委員會(huì)推薦和公認(rèn)的安全、天然、新型、功能型食品添加劑。在食品領(lǐng)域中，果膠可以制作果凍，飲料，化妝品等產(chǎn)品。飲食中攝入果膠可促進(jìn)糞便中脂肪、中性類(lèi)固醇及膽汁的排泄[1]。

到目前為止，提取果膠的發(fā)法有很多，但絕大多數(shù)的果膠提取率都很低。酸法提取是目前應(yīng)用最廣泛的，但是對(duì)環(huán)境污染比較嚴(yán)重。采用酸法提取，果膠提取率低，所以尋求一種環(huán)保、高效的提取方法勢(shì)在必行。目前已有微波輔助法提取果膠的報(bào)道，例如微波提取橘皮果膠工藝研究進(jìn)展[2]，微波輔助提取西番蓮果皮中的果膠研究等[3]。本實(shí)驗(yàn)采用東北地區(qū)的錦燈籠為原料，采用微波輔助復(fù)合酶法對(duì)錦燈籠皮中果膠的提取進(jìn)行了優(yōu)化研究，并采用Box-Behnken Design實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)工藝進(jìn)行了優(yōu)化研究，通過(guò)本次的研究，獲得了一種環(huán)保高效的果膠提取方法，大大的提高了果膠得率。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

無(wú)水乙醇均為分析純；纖維素酶（40U/mg）、半纖維素酶（20U/mg） 上海北諾生物科技有限公司；檸檬酸、檸檬酸三鈉、錦燈籠皮產(chǎn)自東北[4]。

微波化學(xué)反應(yīng)器 MCR-3型鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 RE-300型上海亞榮生化儀器廠(chǎng)；低速離心機(jī) TDL-40B型上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)；精密電子天平 FA 2004型天津天馬恒基儀器有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱 DHG-9035A型上海一恒科技有限公司；水浴鍋DK-S28A型上海精宏有限公司；多功能粉碎機(jī)浙江省永康市紅太陽(yáng)機(jī)電有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 原料制備

稱(chēng)取100g錦燈籠皮，在沸水中煮10min，除去果皮中色素和殺死果膠當(dāng)中的酶，冷卻至室溫，放在50℃電熱鼓風(fēng)干燥箱中烘干。取出干燥的錦燈籠皮置于多功能粉碎機(jī)中粉碎，制粉，過(guò)60目篩，得錦燈籠皮干粉[5]。

1.2.2 果膠提取

取一定量錦燈籠皮干粉，在一定的pH下，配制成一定料液比溶液，再向其中加入一定量的復(fù)合酶與檸檬酸緩沖溶液，置于水浴鍋中在特定的溫度下處理一段時(shí)間，取出放在微波化學(xué)反應(yīng)器中，調(diào)節(jié)微波化學(xué)反應(yīng)器在一定功率下對(duì)混合溶液進(jìn)行微波輻射，處理一段時(shí)間后，取出置于90℃水浴鍋中滅酶15min后，開(kāi)始離心，離心參數(shù)為5000r/min，離心3min，重復(fù)3次，取上清液，提取液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至1/3后，用1.5倍90%乙醇洗出，靜置沉淀30min后進(jìn)行抽濾，并用80%乙醇洗滌3次，置于50～60℃干燥箱中烘干，得粗果膠成品[6]。

1.2.3 單因素試驗(yàn)

利用單因素的試驗(yàn)方法確定最佳的復(fù)合酶比例，微波輻射時(shí)間，復(fù)合酶用量，料液比，pH，酶解溫度，微波功率、酶解時(shí)間。固定實(shí)驗(yàn)條件為微波輻射時(shí)間為3min、半纖維素酶：纖維素酶=1：1、酶解時(shí)間為65min、復(fù)合酶用量5mg、料液比1：25、pH4.8、酶解溫度50℃、微波功率400w。分別測(cè)定各單因素微波輻射時(shí)間（1min、2min、3min、4min、5min）加酶比例（1：3、1：2、1：1、2：1、3：1）、酶解時(shí)間（45min、55min、65min、75min、85min）、復(fù)合酶用量（2.5mg、5.0mg、7.5mg、10.0mg、12.5mg）、pH（4.4、4.6、4.8、5.0、5.2）、料液比（1：15、1：20、1：25、1：30、1：35）、微波功率（240w、320w、400w、480w、560w）、酶解溫度（30℃、40℃、50℃、60℃、70℃）對(duì)錦燈籠皮果膠提取率的影響。

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)采用Design-Expert 8.0.6 軟件[7]在不同單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，對(duì)錦燈籠皮中果膠的提取進(jìn)行工藝優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)Box-Behnken Design實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表1。

2 結(jié)果分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 微波輻射時(shí)間對(duì)錦燈籠皮中果膠得率的影響

從圖1可以看出，不同的微波輻射時(shí)間對(duì)錦燈籠皮中果膠提取率影響不同，微波輻射時(shí)間的不斷增加提取率不斷增加，當(dāng)輻射時(shí)間為3min時(shí)候，提取率最大，之后下降。這種變化情況可能是因?yàn)楣ぜ?xì)胞壁被打破，果膠增多，但隨著微波輻射不斷延長(zhǎng)，錦燈籠皮中果膠的1，4-糖苷鍵被破壞，果膠結(jié)構(gòu)被破碎成許多小分子果膠，所以錦燈籠皮果膠提取率有所下降。

2.1.2 不同復(fù)合酶比例對(duì)果膠得率的影響

復(fù)合酶比例直接影響了錦燈籠皮中果膠的得率，隨著復(fù)合酶比例的不斷增加，錦燈籠皮果膠提取率不斷增加，增加到一定比例后，果膠提取率開(kāi)始下降。圖2顯示，最適復(fù)合酶比例應(yīng)選擇為1：1。

2.1.3 不同加酶量對(duì)果膠得率的影響

在底物濃度一定時(shí)，錦燈籠皮果膠提取率隨加酶量的增加而升高，由圖3可知加酶量達(dá)到一定程度時(shí)果膠提取率明顯減緩，故選擇復(fù)合酶量的添加量為7.5mg。

2.1.4 微波功率對(duì)錦燈籠皮中果膠得率的影響

微波功率對(duì)錦燈籠皮果膠得率的影響，果膠的得率呈現(xiàn)出先升高后下降的趨勢(shì)，原因在于微波功率在一定范圍內(nèi)與酶產(chǎn)生協(xié)同作用提高果膠得率，微波功率過(guò)大果膠長(zhǎng)鏈打斷，小分子果膠增多，果膠得率下降。圖4顯示，最適微波功率應(yīng)選擇為400w。

2.1.5 不同料液比對(duì)果膠得率的影響

錦燈籠皮果膠提取率隨料液比的增加而升高，達(dá)到一定料液比時(shí)，果膠提取率增加明顯緩慢直至平穩(wěn)，原因在于底物質(zhì)量一定時(shí)，加入過(guò)多的溶液進(jìn)行調(diào)配，果膠提取率變化不明顯，同時(shí)為了節(jié)約能源，所以由圖5可知，料液比最適為1：30。

2.1.6 不同pH對(duì)果膠得率的影響

pH直接影響了果膠的得率，果膠的得率呈現(xiàn)出先升高后下降的趨勢(shì)，原因是酶的最適pH一定，隨著pH逐漸增大酶的活性增加，果膠得率增加，pH達(dá)到一定時(shí)繼續(xù)增加，酶的活性降低，果膠得率下降。圖6顯示，最適pH應(yīng)選擇為4.8。

2.17 酶解溫度對(duì)果膠得率的影響

酶解溫度影響了果膠的得率，果膠的得率呈現(xiàn)出先升高后下降的趨勢(shì)，原因是溫度升高提高酶的活性，果膠提取率增加，當(dāng)溫度過(guò)高時(shí)，酶活力下降，提取率下降。圖7顯示，最適水浴溫度應(yīng)選擇為50℃。

水浴時(shí)間影響了果膠的得率，果膠的得率呈現(xiàn)出先升高后下降的趨勢(shì)，原因是酶解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)酶活性下降，果膠提取率下降。圖8顯示，最適酶解時(shí)間應(yīng)選擇為75min。

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與分析

2.2.1 Box-Behnken 工藝優(yōu)化設(shè)計(jì)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果如表2所示。

2.2.2 回歸方程與方差分析

根據(jù)響應(yīng)面軟件分析得到回歸方程如下：Y=9.31+0.40A-0.17B+0.099C+0.066D+0.013AB+0.043AC+0.078AD-0.015BC+0.055BD-0.040CD-0.85A2-0.31B2-0.33C2-0.11D2

得到如表3所示的響應(yīng)面回歸模型和方差分析表，由表可知微波輻射時(shí)間、復(fù)合酶比例、復(fù)合酶用量、微波功率對(duì)果膠提取率都有極顯著影響，每個(gè)決定系數(shù)都在可以接受范圍之內(nèi)，由回歸方程和方差分析表可知，響應(yīng)面的優(yōu)化，可以較好地對(duì)錦燈籠皮果膠提取率進(jìn)行預(yù)測(cè)[8]。經(jīng)實(shí)驗(yàn)可知微波輻射時(shí)間、復(fù)合酶比例、復(fù)合酶用量、微波功率對(duì)果膠提取率影響較大，料液比、pH、酶解時(shí)間、酶解溫度影響較小[9]。

各交互因素響應(yīng)面見(jiàn)表3，由表可知 ：微波輻射時(shí)間、復(fù)合酶比例、復(fù)合酶用量、微波功率對(duì)錦燈籠皮果膠提取率影響較明顯，微波輻射時(shí)間直接影響果膠得率。

2.3 最佳工藝條件的確定與驗(yàn)證

利用Design-Expert 8.0.6軟件分析模型方程，獲得最佳工藝條件為微波輻射時(shí)間3.35min、復(fù)合酶比例1：1.27、復(fù)合酶用量（1：1.27）7.78mg、微波功率399.39w，在此工藝條件下模型的預(yù)測(cè)值為9.368%。由于最佳工藝條件操作起來(lái)困難，所以將條件調(diào)整為：微波輻射時(shí)間3.4min、復(fù)合酶比例1：1.2、復(fù)合酶用量7.8mg、微波功率400w、料液比1：30、pH4.8、酶解溫度50℃、酶解時(shí)間75min，在此條件下，進(jìn)行平行試驗(yàn)，得到錦燈籠皮果膠的平均提取率為9.35%，比模型的預(yù)測(cè)值小，說(shuō)明在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，存在一定的環(huán)境干擾因素。

2.4 半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制

2.4.1 果膠測(cè)量方法依據(jù)

利用半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品作為對(duì)照品，利用分光光度計(jì)繪制出標(biāo)注曲線(xiàn)，測(cè)定錦燈籠外皮提取物中果膠含量[10]。

2.4.2 配制半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液

稱(chēng)取0.1000g半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品，加超純水溶解，轉(zhuǎn)移到100mL容量瓶中，定容。取上述溶液1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL、6.00mL分別加入6個(gè)100mL容量瓶中，定容，即得到濃度分別為10ug/mL、20ug/mL、30ug/mL、40ug/mL、50ug/mL、60ug/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液[10]。

2.4.3 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

分別移取6mL濃硫酸與6個(gè)比色皿中（2～7號(hào)，1號(hào)比色皿中加入超純水作為空白對(duì)照），分別緩慢加入10ug/mL、20ug/mL、30ug/mL、40ug/mL、50ug/mL、60ug/mL的半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液1mL，將所配的半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液置于沸水水浴鍋中一段時(shí)間后取出，降到室溫加入0.15%咔唑乙醇溶液0.5mL。利用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)為530nm測(cè)定吸光值，結(jié)果如表4，繪制出標(biāo)注曲線(xiàn)如圖15，計(jì)算得其線(xiàn)性回歸方程為：y=0.0076x+0.0126

2.4.4 測(cè)定錦燈籠皮果膠粗產(chǎn)品中半乳糖醛酸的含量

稱(chēng)取果膠粗產(chǎn)品0.2500g，用50mL無(wú)水乙醇充分拌勻，在90℃時(shí)恒溫水浴鍋中水浴30min，取出冷卻到室溫，再用抽濾機(jī)對(duì)所配溶液進(jìn)行抽濾，將所得物質(zhì)用無(wú)水乙醇洗滌轉(zhuǎn)移到燒杯當(dāng)中，加入100mL鹽酸使果膠粗產(chǎn)品進(jìn)行水解，再將上述溶液轉(zhuǎn)移至250mL容量瓶中，開(kāi)始定容，將溶液稀釋20倍，待測(cè)。利用分光光度計(jì)對(duì)所得溶液進(jìn)行吸光度的測(cè)量，測(cè)定出特定濃度溶液的吸光度值，利用y=0.0076x+0.0126 R=0.9978計(jì)算出錦燈籠

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)表明在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制時(shí)，在530nm處吸光度值最大，利用分光光度計(jì)測(cè)定不同濃度半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光度值，計(jì)算出其線(xiàn)性回歸方程為：y=0.0076x+0.0126，R= 0.9978。

用東北地區(qū)所產(chǎn)的錦燈籠提取果膠時(shí)，提取率約為9.368%，其中果膠含量約為 63.02%，RSD為5.15%，表明回收率高，結(jié)果較準(zhǔn)確。

采用微波輔助復(fù)合酶法提取錦燈籠果皮中果膠能有效的提高提取率，利用響應(yīng)面法對(duì)工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，果膠得率進(jìn)一步提高。

微波輔助復(fù)合酶提取錦燈籠皮果膠的工藝優(yōu)化研究發(fā)現(xiàn)了一種高效、環(huán)保提取錦燈籠皮果膠的方法，大大提高了果膠得率。

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