吳思　程妍　石健春　馮秋實(shí)　周穎　王小紅　李錦銓

摘要：利用大腸桿菌（Escherichia coli）構(gòu)建生鮮蔬菜消毒過程中水污染模型和蔬菜污染模型，使用傳統(tǒng)消毒方法單獨(dú)處理被污染的水或蔬菜，分別比較其滅菌效率，并探究在傳統(tǒng)消毒方法的基礎(chǔ)上加入噬菌體進(jìn)行輔助處理，分析其滅菌效率。結(jié)果表明，水污染模型中，0.004%硝酸銀的消毒效果最理想，滅菌率超過90%；6種不同殺菌方式對(duì)菠菜的殺菌效果最好，其次是生菜、香菜。蔬菜污染模型中，0.10%硝酸銀的消毒效果最理想，滅菌率超過85%，對(duì)生菜的殺菌效果最好，其次是香菜、菠菜。兩種不同的模型中，加入噬菌體M13K07輔助作用，均可以提高硝酸銀、次氯酸鈉和紫外照射單獨(dú)作用的滅菌率。

關(guān)鍵詞：生鮮蔬菜；消毒；大腸桿菌（Escherichia coli）；噬菌體

生鮮蔬菜是人體營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、維生素、膳食纖維的重要來源，在中國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占有重要地位。近年來，中國(guó)生鮮蔬菜生產(chǎn)、流通和銷售得到了長(zhǎng)足發(fā)展，己經(jīng)成為世界上第一大生鮮蔬菜生產(chǎn)國(guó)。蔬菜在生長(zhǎng)過程中，因使用農(nóng)藥和在摘取、包裝、運(yùn)輸、銷售過程中的損壞，往往會(huì)被污染，其污染程度與蔬菜的表皮是否破損有關(guān)。表皮破損的蔬菜，細(xì)菌污染率較高，消毒不徹底易導(dǎo)致腸道傳染病的發(fā)生。如何消除蔬菜表面的病原菌，在保證生鮮蔬菜的食用安全性下最大限度地保持蔬菜的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

凈菜也稱新鮮消毒蔬菜，即用新采摘的蔬菜，經(jīng)過整理（去掉不可食部分、切分等）、洗滌、消毒等加工操作，在無菌環(huán)境中，真空包裝而制成的一種產(chǎn)品。凈菜在生產(chǎn)過程中，常使用的消毒方法是紫外照射和化學(xué)試劑處理，但是紫外線的滅菌作用只在其輻照期間有效，凈菜被處理后容易遭受二次污染。化學(xué)物質(zhì)雖然可以達(dá)到持續(xù)消毒的目的，但在一些產(chǎn)業(yè)中，如水產(chǎn)養(yǎng)殖和食品工業(yè)等，不需要化學(xué)消毒劑的持續(xù)消毒。有研究報(bào)道，一些蔬菜經(jīng)次氯酸鈉消毒處理后，有高濃度三氯甲烷生成，產(chǎn)生食品安全隱患。

噬菌體是一類感染其他病毒或細(xì)菌細(xì)胞的病毒總稱，其遺傳結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，生命周期短，并且都以蛋白質(zhì)外殼包裹的DNA或RNA為遺傳物質(zhì)，可從污水等自然環(huán)境或者食品原料中提取到，其特異性強(qiáng)、自我增殖快，具有專一性、裂解性，即將成為新一代天然、綠色、安全抗菌制劑。近年來，有關(guān)于應(yīng)用噬菌體制劑對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等各種細(xì)菌性感染治療的報(bào)道，其成功率均很高。美國(guó)食品和藥物管理局已經(jīng)同意將噬菌體用于肉類食品的儲(chǔ)備。然而中國(guó)關(guān)于噬菌體的研究應(yīng)用較少。

因此，本試驗(yàn)構(gòu)建生鮮蔬菜消毒過程中水污染模型和蔬菜污染模型，使用傳統(tǒng)消毒方法單獨(dú)處理被污染的水或蔬菜，分別比較滅菌效率，并探究在傳統(tǒng)方法的基礎(chǔ)上加入噬菌體進(jìn)行輔助處理，比較其滅菌效率，以期為生鮮蔬菜消毒，減少由病原菌引發(fā)的食源性疾病提供參考依據(jù)。

1.材料與方法

1.1材料

試驗(yàn)菌株為大腸桿菌地方分離菌株1、大腸桿菌地方分離菌株2、大腸桿菌噬菌體M13K07，購(gòu)于北京寶科維食安生物技術(shù)有限公司。

1.2試劑與儀器

安琪胰蛋白胨、安琪酵母浸粉購(gòu)自安琪酵母股份有限公司，瓊脂粉購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限公司，NaCl等其他試劑購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

紫外燈（254 nm，15 W，Philips TUVl5 W G15T8）、打孔器（直徑0.7 cm）、生物分光光度計(jì)（Eppendorf AG 22331 Hamburg）均購(gòu)自艾本德中國(guó)有限公司。

1.3方法

1.3.1噬菌體生物學(xué)特性

1）噬菌體效價(jià)：取500ul對(duì)數(shù)期大腸桿菌菌液（OD為1.0），以及100ul噬菌體稀釋液（稀釋倍數(shù)為10^-6～10^-9），充分混勻，37℃120 r/min振蕩培養(yǎng)30 min。然后加入3 mL溶解好的42℃的2xYTTopAgar，振蕩均勻，立刻倒平板，37℃培養(yǎng)過夜，計(jì)算噬菌斑的數(shù)目。

噬菌體效價(jià)（PFU/mL）=噬菌斑數(shù)×稀釋倍數(shù)x10

2）噬菌體pH穩(wěn)定性試驗(yàn)：取EP管，分別加入不同pH（4、5、6、7、8、9、10）的2xYT培養(yǎng)基100μL，然后將EP管置于37℃恒溫水浴中：待溫度平衡后加入100μL的噬菌體稀釋液（10⁹PFU/mL），恒溫保存2 h。待作用時(shí)間結(jié)束后取樣，測(cè)定處理后的噬菌體效價(jià)。

3）噬菌體紫外耐受性試驗(yàn)：取噬菌體稀釋液（10⁹PFU/mL）10mL于培養(yǎng)皿中，距離培養(yǎng)皿35 cm處，采用紫外燈照射，間隔15 min取樣，測(cè)定噬菌體效價(jià)，共取樣4次。

1.3.2消毒劑單獨(dú)作用對(duì)生鮮蔬菜的影響 取大腸桿菌菌液稀釋液（10⁴CFU/mL），分別進(jìn)行如下處理：①1 mL菌液分別加入2、5、10μL濃度為2%的AgN03溶液，作用10 min；②1 mL菌液分別加入10、20、40μL濃度為5%的NaCl0溶液，作用10 min；③30 mL菌液置于培養(yǎng)皿中，距離培養(yǎng)皿35 cm處，采用紫外燈照射，間隔5 min取樣，取樣時(shí)間分別為0、5、10、15、20、25、30 min。然后分別加入生菜、菠菜和香菜各兩片，搖床（120 r/min，37℃）作用30 min后，取出葉片，研磨充分，加入500 μL2xYT培養(yǎng)基，取100μL涂平板計(jì)數(shù)。

1.3.3凈菜生產(chǎn)過程中處理被污染水的消毒方法取大腸桿菌菌液稀釋液（10⁴CFU/mL），對(duì)污水進(jìn)行以下6種不同的消毒處理：①1mL菌液加入2μL2%AgNO₃作用10min；②1 mL菌液加入5μL噬菌體（10⁴PFU/mL）作用30 min，再加入2μL2%AgNO₃作用10min；③1mL菌液加入20μL 5%NaCl0作用10min；④1 mL菌液加入5μL噬菌體（10⁴PFU/mL）作用30min，再加入20μL 5%NaCl0作用10min；⑤取10 mL菌液，距離35 cm用紫外燈處照射，作用30min；⑥取10mL菌液，距離35 cm用紫外燈照射，作用30 min后，取1 mL菌液加入5μL噬菌體（104 PFU/mL）作用30 min。對(duì)照組不做任何處理。待作用時(shí)間結(jié)束后，每種處理方式分別加入生菜、菠菜、香菜，搖床（120 r/min，37℃）作用30 min后，取出葉片充分研磨，加入500μL2xYT培養(yǎng)基，取100μL涂平板計(jì)數(shù)。

1.3.4凈菜生產(chǎn)過程中處理被污染蔬菜的消毒方法 將一定數(shù)量的蔬菜葉片浸入大腸桿菌菌液稀釋液（10⁴CFU/mL）中，搖床120 r/min（37℃）作用30 min。之后分別取出被污染的生菜、菠菜、香菜葉片進(jìn)行以下6種不同的消毒處理：①1 mL 2xYT培養(yǎng)基加入5 uL2%AgN03作用10min；②1 mL2xYT培養(yǎng)基加入5uL噬菌體（10⁴PFU/mL）作用30 min，再加入5uL2%AgNO₃作用10 min；③1 mL 2xYT培養(yǎng)基加入40 μL 5%NaCl0作用10 min；④1 mL2xYT培養(yǎng)基加入5μL噬菌體（10⁴PFU/mL）作用30 min，再加入40 μL 5%NaCl0作用10 min；⑤取生菜（4片）、菠菜（2片）、香菜（2片）距離紫外燈35 cm處照射，作用30 min；⑥取生菜（4片）、菠菜（2片）、香菜（2片）距離紫外燈35 cm處照射30 min后，取出葉片加入1 mL 2xYT培養(yǎng)基和5 μL噬菌體（10⁴PFU/mL）作用30 min。對(duì)照組不做任何處理。待作用時(shí)間結(jié)束后，取出葉片，研磨充分，加入500 μL2xYT培養(yǎng)基，取100 μL涂平板計(jì)數(shù)。滅菌率=（對(duì)照組菌落數(shù)-處理組菌落數(shù)）/對(duì)照組菌落數(shù)×100%。

1.4數(shù)據(jù)分析

采用GraphPad Prism5軟件分析數(shù)據(jù)并繪制圖表。

2.結(jié)果與分析

2.1噬菌體基本生物學(xué)特性

2.1.1噬菌體效價(jià) 噬菌體基本生物學(xué)特性如圖1所示，噬菌體效價(jià)如圖1A所示。由圖1A可知，空斑平均數(shù)為496個(gè)，菌落數(shù)計(jì)數(shù)平板的稀釋倍數(shù)為10^-9，故噬菌體效價(jià)為4.96×10¹²PFU/mL。

2.1.2噬菌體pH穩(wěn)定性 噬菌體對(duì)于pH的穩(wěn)定性結(jié)果如圖1B所示。由圖1B可知，噬菌體在pH為7-8時(shí)穩(wěn)定性較好，在酸性及堿性條件下，其效價(jià)逐步下降：在pH小于5或大于10時(shí)，其效價(jià)下降明顯。

2.1.3噬菌體紫外耐受性 噬菌體的紫外耐受性試驗(yàn)結(jié)果如圖1c所示。由圖1c可知，紫外照射60min使噬菌體的效價(jià)下降一個(gè)數(shù)量級(jí)，并且隨著照射時(shí)間的增加，噬菌體的效價(jià)逐步下降。因此，在后面的消毒方法中，先用紫外照射，然后加入噬菌體進(jìn)行處理。

2.2不同消毒方法單獨(dú)作用對(duì)生鮮蔬菜的影響

2.2.1不同濃度的硝酸銀對(duì)生鮮蔬菜的影響 消毒劑單獨(dú)作用對(duì)生鮮蔬菜的影響如圖2所示，不同濃度的硝酸銀對(duì)生鮮蔬菜的處理結(jié)果如圖2A所示。由圖2A可知，硝酸銀濃度越高，滅菌效果越好：同一濃度的硝酸銀對(duì)于生菜的滅菌效果最為理想，菠菜次之，香菜最差。

2.2.2不同濃度的次氯酸鈉對(duì)生鮮蔬菜的影響不同濃度的次氯酸鈉對(duì)生鮮蔬菜的處理結(jié)果如圖2B所示。由圖2B可知，次氯酸鈉濃度越高，滅菌效果越好：0.20%次氯酸鈉對(duì)于香菜的滅菌效果最為理想，中、高濃度的次氯酸鈉對(duì)于生菜的滅菌效果較為理想。

2.2.3不同時(shí)間的紫外照射對(duì)生鮮蔬菜的影響不同時(shí)間的紫外照射對(duì)生鮮蔬菜的處理結(jié)果如圖2c所示。由圖2c可知，紫外照射時(shí)間越長(zhǎng)，滅菌效果越理想。

2.3不同處理方法對(duì)被污染水及蔬菜的消毒效果比較

不同處理方式對(duì)被污染水及蔬菜消毒效果的比較如圖3所示。將被污染水進(jìn)行6種不同方式的消毒處理，比較結(jié)果如圖3A所示。由圖3A可知，0.004%硝酸銀處理10 min和0.5%噬菌體消毒30min+0.004%硝酸銀消毒10 min的消毒效果較理想，滅菌率均超過90%：其次是0.10%次氯酸鈉消毒10 min和0.5%噬菌體消毒30 min+0.10%次氯酸消毒10 min，紫外燈處理的消毒效果相對(duì)較低，但滅菌率也超過80%。6種不同處理方式對(duì)菠菜的滅菌效果最理想，其次為生菜、香菜。另外，加入噬菌體M13K07輔助作用，可以適當(dāng)提高硝酸銀、次氯酸鈉和紫外照射單獨(dú)作用的滅菌率，對(duì)3種生鮮蔬菜平均提高率分別為2.1、1.9、1.7個(gè)百分點(diǎn)。

2.4不同的處理方法對(duì)被污染蔬菜消毒效果的比較

將被污染蔬菜進(jìn)行6種不同方式的消毒處理，比較結(jié)果如圖3B。由圖3B可知，0.10%硝酸銀處理10 min和0.5%噬菌體消毒30 min+0.010%硝酸銀消毒10 min的消毒效果較理想，滅菌率超過85%：其次是0.20%次氯酸鈉消毒10 min和0.5%噬菌體消毒30 min+0.20%次氯酸消毒10 min，滅菌率也超過85%，紫外燈處理的消毒效果相對(duì)較低，滅菌率超過80%。6種不同處理方式對(duì)生菜的滅菌效果最理想，其次為香菜、菠菜。另外，加入噬菌體M13K07可起到輔助作用，可以提高硝酸銀、次氯酸鈉和紫外照射單獨(dú)作用的滅菌率，分別提高2.4、2.3、2.9個(gè)百分點(diǎn)。

3.小結(jié)與討論

本試驗(yàn)分析了噬菌體的基本生物學(xué)特性，并利用大腸桿菌構(gòu)建生鮮蔬菜消毒過程中水污染模型和蔬菜污染模型，使用傳統(tǒng)消毒方法單獨(dú)處理被污染的水或蔬菜，分別比較其滅菌率，并探究在傳統(tǒng)消毒方法的基礎(chǔ)上加入噬菌體進(jìn)行輔助處理，能否提高其滅菌效率。結(jié)果表明，水污染模型中，0.004%硝酸銀處理10 min的消毒效果最理想，滅菌率超過90%：6種不同處理方式對(duì)于菠菜的滅菌效果最理想，依次為生菜、香菜。蔬菜污染模型中，0.10%硝酸銀處理10 min的消毒效果最理想，滅菌率超過85%：6種不同處理方式對(duì)于生菜的滅菌效果最理想，依次為香菜、菠菜。另外，兩種不同的模型中，加入噬菌體M13K07可以提高硝酸銀、次氯酸鈉和紫外照射滅菌率約2個(gè)百分點(diǎn)，并且蔬菜污染模型中提高的幅度略高于水污染模型。

大腸桿菌對(duì)凈菜生產(chǎn)過程以及廣大消費(fèi)者均存在不可忽視的潛在威脅，因此，應(yīng)當(dāng)建立完善的消毒體系。在凈菜生產(chǎn)過程中，可以選用0.004%硝酸銀處理10 min，并加入0.5%噬菌體處理30 min，滅菌效果最為理想。同時(shí)，可以將0.10%硝酸銀與0.5%噬菌體制成混合噴霧劑，用于家庭式對(duì)生鮮蔬菜的消毒。