張東向　焦戰(zhàn)戰(zhàn)　張令昂　李升林　孟慶偉　劉麗潔

摘要：以黃芩懸浮細(xì)胞為材料，研究其生長(zhǎng)過程中過氧化物酶（POD）活性變化規(guī)律及其與黃芩苷次生合成之間的關(guān)系。結(jié)果表明，在黃芩懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)周期（21 d）內(nèi)，POD活性與黃芩苷的積累呈正相關(guān)。在黃芩懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)周期的前6 d，懸浮細(xì)胞處于適應(yīng)期，POD低水平表達(dá)，黃芩苷合成緩慢；6～15 d，懸浮細(xì)胞處于增長(zhǎng)期，POD高水平表達(dá)，并到達(dá)最大值，期間黃芩苷迅速合成；15～21 d，懸浮細(xì)胞進(jìn)入飽和期，此時(shí)POD活性降低，黃芩苷合成幾乎停止。采用L9（3）正交表優(yōu)化培養(yǎng)基中6-BA，碳源、氮源、pH的配比，篩選POD活性表達(dá)最優(yōu)的培養(yǎng)條件為：6-BA 3 mg/L、碳源15g/L蔗糖+15 g/L葡萄糖、氮源（NH4+）30 mmol/L、pH 5.6。

關(guān)鍵詞：黃芩（Scutellaria baicalensis Georgi）；懸浮細(xì)胞；黃芩苷；過氧化物酶活性；正交設(shè)計(jì)

中藥黃芩為唇形科植物黃芩的干燥根，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血安胎等功效。其主要成分黃芩苷（Baicalin）具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗變態(tài)反應(yīng)、抗氧化、清除氧自由基、抗癌、抗腫瘤、抗凝、抗血栓形成和保護(hù)肝臟、心腦血管、神經(jīng)元等作用。黃芩苷是黃芩細(xì)胞次生代謝的一種，它本身就可以代表細(xì)胞次生代謝的旺盛程度。植物次生代謝途徑研究方面也已取得了不少進(jìn)展，但是關(guān)于次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)生機(jī)理的研究并不多。次生代謝過程是各種酶促反應(yīng)的過程，受關(guān)鍵酶與限速酶的調(diào)控，關(guān)鍵酶的表達(dá)決定代謝途徑的啟動(dòng)及相關(guān)特定物質(zhì)的合成。黃芩體內(nèi)過氧化物酶（POD）能夠催化黃芩有效成分黃芩苷與過氧化氫反應(yīng)生成黃芩素，還可以清除脂類氫過氧化物，減輕有機(jī)氫過氧化物對(duì)機(jī)體的損傷，防御活性氧等自由基對(duì)細(xì)胞膜的損傷，有一定的抗衰老作用。任振興等研究表明，黃芩愈傷組織中多酚氧化酶活性與黃芩苷合成有相關(guān)性。本試驗(yàn)研究了黃芩懸浮細(xì)胞中黃芩苷與過氧化物酶活性相關(guān)性，通過對(duì)黃芩懸浮細(xì)胞增長(zhǎng)量、黃芩苷的含量、過氧化物酶活性的測(cè)定及分析結(jié)果，討論三者之間的相關(guān)性。

1.材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

黃芩懸浮細(xì)胞，來(lái)源于本試驗(yàn)室誘導(dǎo)的黃芩愈傷組織，培養(yǎng)基為液體SM培養(yǎng)基（去除瓊脂MS培養(yǎng)基）。

試驗(yàn)儀器有YPL-1全溫?fù)u瓶柜、T6新世紀(jì)型紫外可見分光光度計(jì)、GTR16-2型高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1黃芩懸浮細(xì)胞鮮重、干重增長(zhǎng)曲線和黃芩苷、過氧化物酶活性變化曲線將2 g黃芩愈傷組織研磨成細(xì)胞狀接種于80 mL/250 mL三角瓶液體培養(yǎng)基中，置于（25±1）℃、轉(zhuǎn)速110-130 r/min的搖瓶柜中暗培養(yǎng)，培養(yǎng)周期21 d。從第3天起，每隔3 d取樣，測(cè)定黃芩懸浮細(xì)胞鮮重和干重的增長(zhǎng)量以及黃芩苷的含量和過氧化物酶活性（各測(cè)6組樣品，平均值為最終結(jié)果）。4條變化趨勢(shì)曲線橫坐標(biāo)均為生長(zhǎng)時(shí)間，縱坐標(biāo)分別為黃芩懸浮細(xì)胞鮮重和干重的增長(zhǎng)量以及黃芩苷的含量和過氧化物酶活性。

1.2.2正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 為了研究在黃芩懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)周期中過氧化物酶活性的表達(dá)情況，試驗(yàn)采用L（3）正交表設(shè)計(jì)培養(yǎng)基中6-BA、碳源、氮源、pH的配比（表1）。在不同培養(yǎng)條件下，黃芩懸浮細(xì)胞中過氧化物酶的表達(dá)情況不同，通過篩選可以得出過氧化物酶表達(dá)的最佳培養(yǎng)條件。

1.3項(xiàng)目測(cè)定

1.3.1黃芩懸浮細(xì)胞黃芩苷含量測(cè)定 采用紫外分光光度法。培養(yǎng)懸浮細(xì)胞中總黃芩苷含量=培養(yǎng)液中黃芩苷含量+細(xì)胞中的黃芩苷含量。量取2 mL的懸浮細(xì)胞液，通過抽濾將培養(yǎng)細(xì)胞與培養(yǎng)液分離。培養(yǎng)液中黃芩苷含量的測(cè)定：將培養(yǎng)液置于60℃烘箱內(nèi)烘干，加入50%的乙醇10 mL，置于50℃水浴箱內(nèi)溫浴5～6 h，冷卻后用50%的乙醇定容。用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定278 nm處的OD值。細(xì)胞中黃芩苷含量的測(cè)定：將細(xì)胞培養(yǎng)物置于60℃烘箱內(nèi)烘至恒重，研成粉末，用50目篩網(wǎng)過篩，稱取適量粉末，加入50%的乙醇10 mL，置于50℃水浴箱內(nèi)溫浴5～6 h，冷卻后用50%的乙醇定容，用蒸餾水稀釋、搖勻，作為待檢樣。用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定278 nm處的OD值。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程（圖1）計(jì)算黃芩苷濃度C。

2.結(jié)果與分析

2.1黃芩懸浮細(xì)胞的增長(zhǎng)曲線和黃芩苷的變化曲線

圖2和圖3顯示，黃芩懸浮細(xì)胞的增長(zhǎng)曲線呈典型的“s”形，0-6 d為潛伏期，6-18 d為快速合成期，18-21 d為穩(wěn)定期，黃芩懸浮細(xì)胞增長(zhǎng)變緩，鮮重最大值達(dá)到15.430 6 g，干重最大值達(dá)到0.843 7 g。由圖4可以看出，黃芩苷在前6d合成比較緩慢，但從培養(yǎng)6 d后合成速率增加，9-15 d為黃芩苷的快速合成期，到18 d時(shí)，黃芩苷的積累量達(dá)到最大值73.496 2 mg/g。由圖2、圖3、圖4不難發(fā)現(xiàn)，黃芩懸浮細(xì)胞的增長(zhǎng)和黃芩苷合成積累基本上同步，即邊增長(zhǎng)邊合成。

2.2黃芩懸浮細(xì)胞中過氧化物酶活性的變化規(guī)律

圖5顯示，在黃芩懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)周期的前6 d，POD低水平表達(dá)，活性在低于0.327 U/（g·min）的范圍；6-15 d高水平表達(dá)，12 d左右POD活性達(dá)到最高值1.346 U/（g·min），15-21 d POD低水平表達(dá)。

結(jié)合圖2、圖3、圖4可以看出，活性變化規(guī)律與黃芩懸浮細(xì)胞增長(zhǎng)和黃芩苷積累量的關(guān)系為：在黃芩懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)周期的前6 d，懸浮細(xì)胞主要是適應(yīng)從固體培養(yǎng)到液體培養(yǎng)的環(huán)境，這一時(shí)期細(xì)胞的增長(zhǎng)量、黃芩苷合成量和POD活性都不明顯：6～15 d，隨著細(xì)胞適應(yīng)液體培養(yǎng)的環(huán)境，細(xì)胞的增長(zhǎng)量、黃芩苷合成量和POD活性都迅速增加：15-21 d，由于液體培養(yǎng)基成分的逐漸消耗，所以這一時(shí)期細(xì)胞的增長(zhǎng)量和黃芩苷的合成量開始變得不明顯，達(dá)到一種穩(wěn)定的狀態(tài)，而這時(shí)期的POD活性也低水平表達(dá)。

通過SPSS Statistics對(duì)POD活性與黃芩苷含量的相關(guān)性進(jìn)行分析，得出在黃芩懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)周期前12 d，POD活性與黃岑苷含量的相關(guān)系數(shù)為0.997，P=0.03<0.01，極顯著相關(guān)。由此可見，在黃芩愈傷組織生長(zhǎng)周期的前12 d，POD活性與黃芩苷的積累相關(guān)。

在黃芩懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)周期前12 d，POD的活性與黃芩苷的積累呈正相關(guān)性。以POD活性為自變量，黃芩苷含量為因變量，做回歸分析?；貧w方程為y=0.442 1 x+0.868 9，回歸系數(shù)R2=0.994 3。對(duì)回歸方程進(jìn)行方差分析，顯著性檢測(cè)結(jié)果見表2。從表2可以看出，概率值P=0.002 832<0.01，說明方程回歸極顯著。

2.3正交試驗(yàn)結(jié)果

從表3可知，最優(yōu)的培養(yǎng)條件為：MS附加6-BA3 mg/L，碳源15 g/L蔗糖+15 g/L葡萄糖，氮源（NH4+）30 mmol/L，pH 5.6。極差分析結(jié)果顯示4種不同因素對(duì)POD表達(dá)都有不同程度的影響，而6-BA在黃芩懸浮細(xì)胞培養(yǎng)過程中對(duì)黃芩懸浮細(xì)胞POD表達(dá)有較顯著的影響。

3.小結(jié)與討論

植物體中含有大量POD，是活性較高的一種酶。它與呼吸作用、光合作用及生長(zhǎng)素的氧化等都有關(guān)系，在植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中它的活性不斷發(fā)生變化。次生代謝過程是各種酶促反應(yīng)的過程，受酶的調(diào)控，酶的表達(dá)決定代謝途徑的啟動(dòng)及相關(guān)特定物質(zhì)的合成。黃芩苷是細(xì)胞次生代謝的產(chǎn)物，它本身可以表征次生代謝的旺盛程度。在本試驗(yàn)中，黃芩懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)周期前6 d為緩沖期，黃芩苷的含量較低，同時(shí)POD低水平表達(dá)；6-15 d，POD有高水平表達(dá)，并達(dá)到最高值，而此時(shí)也是黃芩苷快速合成期：15～21 d，POD低水平表達(dá)，黃芩苷含量的積累變得緩慢，達(dá)到一個(gè)穩(wěn)定值。由此可以看出，在黃芩懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)周期（21 d）內(nèi)，POD活性高低與黃芩苷的積累呈正相關(guān)。

結(jié)合圖4和圖5可以看出，POD活性高低與黃芩苷合成的快慢在黃芩懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)周期表現(xiàn)出了同步性，黃芩苷合成速率最快時(shí)，POD表達(dá)水平也最高。同時(shí)，POD活性與細(xì)胞的衰老也密不可分，POD活性越強(qiáng)，細(xì)胞衰老的速度也就越快，即POD活性也是細(xì)胞生長(zhǎng)周期長(zhǎng)短的一個(gè)制約因素。次生代謝產(chǎn)物的積累主要在植物生命的后期。可以看出POD是影響黃芩懸浮細(xì)胞成長(zhǎng)和黃芩苷積累的一個(gè)重要因素，因此POD的活性對(duì)黃芩懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)和黃芩苷積累有著重要意義。影響植物次生代謝產(chǎn)物積累的因素很多，既有內(nèi)因又有外因。通過對(duì)影響POD積累因子的研究，初步掌握了一些影響植物次生代謝產(chǎn)物積累的規(guī)律，對(duì)生產(chǎn)實(shí)踐有一定的指導(dǎo)作用，但這些規(guī)律又因具體植物的不同而有差異。因此，如何將這些規(guī)律進(jìn)行推廣還需要深入研究。