沈淑潔 郭春華 劉少磊 黃榮清 楊建云 肖炳坤

[摘要]失眠癥在當(dāng)今社會發(fā)生普遍，現(xiàn)代分子學(xué)已發(fā)現(xiàn)失眠癥可能與γ氨基丁酸A（GABAA）受體機(jī)制、細(xì)胞因子調(diào)節(jié)機(jī)制、興奮性氨基酸機(jī)制以及羥色胺（5HT）受體機(jī)制調(diào)節(jié)有關(guān)，但這些獨立的機(jī)制與病理表征之間的聯(lián)系仍不明確。而半夏厚樸湯作為治療失眠抑郁的名方，其治療機(jī)制尚不明確。為進(jìn)一步探索半夏厚樸湯在治療失眠過程中對已知或未知生物通路的作用，該研究采用基于1HNMR 技術(shù)的代謝組學(xué)研究方法，觀察給予半夏厚樸湯提取物后對戊巴比妥鈉誘導(dǎo)大鼠睡眠實驗中，大鼠體內(nèi)小分子代謝物的變化并對其機(jī)制進(jìn)行探討。通過采集大鼠尿液和血清進(jìn)行核磁數(shù)據(jù)檢測，利用主成分分析法（principal component analysis， PCA）對大鼠尿液和血清內(nèi)源性小分子代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析處理。并運用Simcap 170（Umetrics，Umea，Sweden）和Chenomx NMR Suite 71（Chenomx，Inc.，Edmonton，Alberta，Canada）軟件對核磁共振氫譜和相關(guān)代謝產(chǎn)物進(jìn)行鑒定和分類。 結(jié)果表明，半夏厚樸湯組和茚地普隆組與空白組區(qū)別明顯，載荷圖中顯示最大變異代謝物，發(fā)現(xiàn)10個代謝物質(zhì)在組間存在顯著性差異。實驗證明，半夏厚樸湯組和茚地普隆組均可延長戊巴比妥鈉誘導(dǎo)大鼠睡眠時間，且半夏厚樸湯與戊巴比妥鈉有協(xié)同作用。經(jīng)過代謝物差異性對比，推測半夏厚樸湯對戊巴比妥鈉誘導(dǎo)大鼠睡眠實驗機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)谷氨酰胺、磷酸肌酸、2酮戊二酸的含量，減輕腦內(nèi)神經(jīng)興奮性從而起到調(diào)節(jié)睡眠的作用。

[關(guān)鍵詞]代謝組學(xué)；半夏厚樸湯；1HNMR技術(shù)；鎮(zhèn)靜催眠

[Abstract]Insomnia was a common disease， which might be correlated with γaminobutyric acid A （GABAA） receptor mechanism， cytokine regulatory mechanism， excitatory amino acid mechanism and hydroxytryptamine （5HT） receptor mechanism， but the correlations between these independent mechanisms and pathological characterization were still unclear To further explore the effect of Banxia Houpo decoction on known or unknown biological pathways during treatment of insomnia， the metabonomics method based on 1HNMR was developed for detecting the significant changes in metabolomics after the administration with Banxia Houpo decoction in pentobarbital sodiuminduced rat sleeping experiment Serum and urine samples were analyzed by 1HNMR Principal component analysis （PCA） was carried out for endogenous small molecule metabolites in urine and serum HNMR spectroscopies and relevant metabolites were found and identified by Simcap 170 （Umetrics， Umea， Sweden） and Chenomx NMR Suite 71 （Chenomx， Inc， Edmonton， Alberta， Canada） software The result suggests that Banxia Houpo decoction group and indiplon group had significant differences The load diagram showed the biggest variation metabolites and intergroup significant differences among 10 metabolic substances According to the experiment， Banxia Houpo decoction group and indiplon group can prolonge the sleeping time of pentobarbital sodiuminduced spraguedawley rats， with a synergistic effect The significant changes of these biomarkers indicated that the Banxia Houpo decoction could aid sleep by adjusting the content of glutamine， creatine phosphate， 2oxoglutarate， and reducing the activity of brain nerves

[Key words]metabonomics； Banxia Houpo decoction； 1HNMR； sedative hypnotic

doi：10.4268/cjcmm20160824

代謝組學(xué)（metabonomics或metabolomics）為在特定時間內(nèi)系統(tǒng)性分析生物體液或生物組織中代謝物的差異性表達(dá)。代謝組學(xué)在中藥高通量篩選和全面技術(shù)研究方面應(yīng)用廣泛，其整合運用將會成為整合化學(xué)物質(zhì)組學(xué)的系統(tǒng)生物學(xué)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[12]，在其應(yīng)用分析技術(shù)中核磁共振技術(shù)以其高通量分析及樣品無損性分析的特點而被廣泛應(yīng)用[35]。

失眠癥在當(dāng)今社會發(fā)生普遍，長期失眠易使人產(chǎn)生焦慮、煩躁、抑郁等精神癥狀。如今國內(nèi)、外常用鎮(zhèn)靜催眠藥物治療失眠癥容易產(chǎn)生副作用和依賴性，然而中藥治療失眠的副作用小，無成癮性，因此有較大的發(fā)展空間[68]。半夏厚樸湯始載于《金匱要略》，為治療梅核氣的名方，由半夏、厚樸、茯苓、蘇葉、生姜5味藥組成，臨床多用于情志不遂、肝氣郁結(jié)導(dǎo)致的痰凝。然而，此癥病人由于情志不暢，氣滯痰阻，常伴有心煩、失眠等癥[910]。關(guān)于半夏厚樸湯鎮(zhèn)靜催眠的藥理作用已有相關(guān)實驗報道得到驗證[11]。本實驗以代謝組學(xué)為研究方法，通過研究半夏厚樸湯對SD大鼠注射戊巴比妥鈉誘導(dǎo)催眠模型的觀察，并對不同組別大鼠的尿液和血清進(jìn)行1HNMR分析，通過比較各組代謝物的差異，探討半夏厚樸湯對戊巴比妥鈉誘導(dǎo)大鼠鎮(zhèn)靜催眠的作用和機(jī)制。

1材料與方法

11藥材半夏厚樸湯全方（半夏130 g，厚樸45 g，茯苓60 g，紫蘇30 g，生姜75 g），加10倍量水浸泡過夜后，煎煮1 h，用紗布過濾，第2次和第3次煎煮加8倍量水，煮沸回流1 h，合并3次濾液，抽濾，減壓濃縮至浸膏狀，減壓濃縮至305 mL藥液，濃縮液和藥材之比為656∶1（相當(dāng)于1 mL含生藥655 g）， 將實驗所得浸膏置4 ℃冰箱中備用。

12試劑與儀器茚地普隆，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所制；生理鹽水，石家莊四藥有限公司；戊巴比妥鈉，北京化學(xué)試劑公司（德國進(jìn)口分裝）；疊氮化鈉（NaN3），英國Alfa Aesar 化工有限公司；磷酸二氫鈉（NaH2PO4，純度≥990%）和磷酸氫二鈉（Na2HPO4，純度≥990%），美國Sigma化工有限公司；重水（D2O，光譜純），美國CIL有限公司；3（三甲基硅基）氘代丙酸鈉（TSP），加拿大默克公司。

恒佳DT1001A電子天平，常熟佳衡天平儀器有限公司；大鼠不銹鋼代謝籠，北京龍東?？蒲性O(shè)備制造有限公司；Finnpipette微量移液器，芬蘭雷勃（集團(tuán)）有限公司；臺式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠，JEOL ECA 400 MHz磁共振譜儀，日本JEOL電子公司。

13動物與分組選取雄性SD大鼠為實驗動物，體重（180±20） g，購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心，合格證號SCXK（軍）20120004。適應(yīng)5 d后，將實驗動物隨機(jī)分為3組。所有大鼠均單代謝籠飼養(yǎng)。溫度（23±1）℃、相對濕度保持50%～60%，12 h光/暗循環(huán)（光照時間 8：00～20：00），自由進(jìn)食飲水。在實驗開始前每天給予連續(xù)5 min的撫摸適應(yīng)，3 d后大鼠隨機(jī)分組，每組6只，共18只。每組分別為空白組（生理鹽水，5 mL），陽性對照組（茚地普隆，5 mg·kg-1）、半夏厚樸湯組（500 mg·kg-1），浸膏干粉加生理鹽水配成溶液，每天灌胃給藥1次（各組給藥體積相同），共14 d。

14實驗數(shù)據(jù)采集與處理在最后一次給藥后30 min，于大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉40 mg·kg-1，并將大鼠腹部朝上放在溫暖（37 ℃）的墊塊上，以翻正反射消失為入睡時間，翻正反射消失至恢復(fù)的時間為睡眠持續(xù)時間（大鼠翻正反射消失1 min以上則為發(fā)生睡眠），記錄各組大鼠的睡眠時間[1213]。誘導(dǎo)催眠實驗結(jié)束后，用代謝籠法收集最后一次給藥后各組大鼠的尿液（24 h），集尿于EP 管中，并置于生物冰袋中，每10 mL加05 mL 01%NaN3溶液防腐。收集到的尿樣3 000 r·min-1離心10 min，取上清液，實驗前于-80 ℃ 冰箱儲存。實驗結(jié)束后注射2%戊巴比妥鈉（40 mg·kg-1）麻醉，解剖大鼠并于下腔靜脈取血，放置10 min，4 ℃ 離心（12 000 r·min-1，15 min），取上清液，于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。NMR實驗前，將血清和尿樣于4 ℃環(huán)境解凍，以D2O稀釋，02 mol磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)pH，加入5 mmol TSP內(nèi)標(biāo)溶液。將混合溶液于4 ℃ 12 000 r·min-1離心10 min， 取500 μL上清液于5 mm NMR管中，進(jìn)行NMR數(shù)據(jù)采集。

在核磁共振儀上采集數(shù)據(jù)參數(shù)如下：譜寬4 800 Hz，混合時間03 s，馳豫延遲時間12 s，溫度25 ℃，采樣點數(shù)64 k，累加次數(shù)64次；在馳豫延遲期間采用多脈沖梯度場回波（multiple pulse field gradient echo，MPFGE）脈沖序列抑制水峰，譜儀偏置設(shè)置在水峰的位置。自由感應(yīng)衰減（free induction decays，F(xiàn)ID）信號經(jīng)過傅立葉變換轉(zhuǎn)換為NMR圖譜。進(jìn)行一維核磁共振1HNMR實驗數(shù)據(jù)采集[14]。將各組的圖譜利用MestReNova 602軟件進(jìn)行相位校正與基線校正后，將譜圖以所有信號按峰面積歸一化為1，以TSP為化學(xué)位移參考峰，定為000。并對1HNMR 譜圖進(jìn)行分段積分（尿樣為δ 002，血清為δ 001），并且排除溶劑峰和尿素峰（δ 520～460）積分區(qū)段[14]。數(shù)據(jù)處理后導(dǎo)入Excel。通過Simcap軟件進(jìn)行主成分分析，結(jié)果以得分圖和載荷圖表示。

2結(jié)果

21實驗數(shù)據(jù)分析與處理所有數(shù)據(jù)，包括睡眠時間，1HNMR數(shù)據(jù)等，均使用SPSS 170 （Umetrics，Umea，Sweden） 進(jìn)行定性分析，各實驗組灌胃給藥后對戊巴比妥鈉誘導(dǎo)大鼠睡眠時間和1HNMR數(shù)據(jù)采用單因素方差分析。實驗組與對照組的差異顯著性分析采用成對樣本t檢驗，結(jié)果見表1。

經(jīng)統(tǒng)計分析可得，半夏厚樸湯組與生理鹽水組有顯著性差異（P<001），和茚地普隆組無顯著性差異。即半夏厚樸湯組與茚地普隆組的催眠作用相差不大，與戊巴比妥鈉有協(xié)同催眠作用。

22血清和尿液1HNMR檢測將實驗所得的核磁圖譜借助軟件Chenomx NMR Suite 71（Chenomx，Inc.，Edmonton，Alberta，Canada）中代謝產(chǎn)物的自動解析功能，初步分析得到10個差異性代謝物。將這些差異性代謝物結(jié)合HMDB和Metlin標(biāo)準(zhǔn)代謝物譜圖庫對尿樣和血清中的代謝物進(jìn)行指認(rèn)。將1HNMR譜圖中代謝物與代謝物數(shù)據(jù)庫生物代謝標(biāo)準(zhǔn)物圖譜進(jìn)行比對歸屬。根據(jù)NMR譜圖中化合物的化學(xué)位移、峰形、半峰寬、耦合裂分等情況進(jìn)行調(diào)整校準(zhǔn)，將標(biāo)準(zhǔn)化合物和生物體液樣本的特征信號逐一匹配，能夠鑒定出尿樣和血清樣本中共10個代謝物。

大鼠血清和尿樣的PCA得分圖見圖1。血清PCA圖上看出，半夏厚樸湯組與第1組成分相關(guān)性較大，3組數(shù)據(jù)點能很好的分開。說明3組之間血清代謝物有明顯差異，半夏厚樸湯和茚地普隆均影響了大鼠體內(nèi)血清代謝物的成分含量。尿液PCA圖中可以看出，半夏厚樸湯組和茚地普隆組與第1主成分相關(guān)性大，且2組相距較近，與空白組之間差異性較大，能夠與其明顯區(qū)分開來。結(jié)果說明半夏厚樸湯組與茚地普隆組差異不明顯，這一結(jié)果與本催眠實驗行為學(xué)水平與報道的實驗研究相一致。

通過Simcap軟件進(jìn)行主成分分析，從PCA荷載圖和VIP值（variable importance in projection）圖得到差異性較大的代謝產(chǎn)物（VIP>1的位移點可能為差異性顯著的物質(zhì)），結(jié)合chenomox軟件自動解析得到體內(nèi)小分子代謝物的變化，發(fā)現(xiàn)供能物質(zhì)葡萄糖水平升高，見表2。葡萄糖有氧氧化被抑制，ATP生成減少，于是細(xì)胞進(jìn)行無氧酵解以代償能量不足，以致產(chǎn)生更多的乳酸和丙酮酸。對照組和實驗組代謝物中葡萄糖均升高，說明半夏厚樸湯影響到大鼠體內(nèi)糖異生的代謝。

3討論與結(jié)論

?；撬崾呛虬被岬拇x產(chǎn)物，它的抗氧化活性可以保護(hù)細(xì)胞膜和其他細(xì)胞成分， 在半夏厚樸湯組與茚地普隆組中?；撬岷烤鶞p少，這與含硫氨基酸分解代謝異常有關(guān)。膽堿在哺乳動物體內(nèi)被氧化成甜菜堿。甜菜堿參與磷脂酞膽堿的合成，可提高肌肉中肉堿的含量，促進(jìn)脂肪酸β氧化，保護(hù)機(jī)

肌酸和磷酸肌酸代謝產(chǎn)物之一為肌酸酐，肌酸酐和磷酸肌酸濃度減少是引起疲勞的重要因素[16]。半夏厚樸湯組較生理鹽水組磷酸肌酸增加，增強(qiáng)了機(jī)體能量的轉(zhuǎn)移，增加了能量代謝。2酮戊二酸、延胡索酸為三羧酸循環(huán)（TCA）的中間產(chǎn)物，在能量代謝過程中扮演著重要角色，它們在機(jī)體含量出現(xiàn)異常，便可能引起 TCA 功能缺失或紊亂。同時，2酮戊二酸是體內(nèi)多種轉(zhuǎn)氨酶的受體，可以與體內(nèi)代謝產(chǎn)生氨結(jié)合，在哺乳動物體內(nèi)，過量氨會影響大腦代謝，改變神經(jīng)遞質(zhì)水平。因此半夏厚樸湯組和茚地普隆組2酮戊二酸、延胡索酸水平升高，可能是大鼠體內(nèi)氨水平所致，氨極易通過血腦屏障，使得腦細(xì)胞中 2酮戊二酸水平變化，TCA增強(qiáng)，能量生成增加，從而緩解機(jī)體出現(xiàn)疲勞怠倦的癥狀[1719]。

谷氨酸是興奮性氨基酸，在中樞內(nèi)分布極為廣泛，以大腦皮層和髓背側(cè)部分水平相對較高，是主要興奮性遞質(zhì)，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)所有神經(jīng)元均起興奮作用，使神經(jīng)元放電，其釋放量的增加與睡眠質(zhì)量呈負(fù)相關(guān)，在失眠中起重要作用[20]。谷氨酰胺是體內(nèi)最豐富的游離氨基酸之一，是淋巴細(xì)胞分泌、增殖及其功能維持所必需的物質(zhì)。在半夏厚樸湯組相比于生理鹽水組變化中發(fā)現(xiàn)，谷氨酸的含量降低，可推測其治療失眠的機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)谷氨酸含量來減輕腦內(nèi)興奮神經(jīng)性，起到了保護(hù)腦神經(jīng)元的作用，從而起到催眠的作用。與傳統(tǒng)實驗研究相比，本實驗在證實半夏厚樸湯具有鎮(zhèn)靜催眠的基礎(chǔ)上還進(jìn)一步探索了半夏厚樸湯對失眠癥治療的可能作用機(jī)制。另外，根據(jù)文章報道，失眠抑郁癥狀還可能與5HT含量不足有關(guān)，能夠升高突觸間5HT含量的藥物可緩解此類癥狀[2122]。

此外，作為陽性對照組的茚地普隆是臨床用于鎮(zhèn)靜催眠的代表藥物，其主要作用機(jī)制為選擇性作用于人體中樞 GABAA 受體[23]。從各組代謝物差異分析得出，茚地普隆組與半夏厚樸湯組雖行為學(xué)有相似的作用，但與代謝物相比卻有不同，可能是作用機(jī)制不同所致。因此關(guān)于半夏厚樸湯對戊巴比妥鈉誘導(dǎo)大鼠睡眠尚需進(jìn)一步探索證明。

半夏厚樸湯的實驗研究雖有報道，但多數(shù)集中于對其作用的驗證方面，對其作用機(jī)制則研究較少。本實驗首先從代謝組學(xué)的角度探究半夏厚樸湯的鎮(zhèn)靜催眠作用，通過將實驗大鼠的血清和尿液進(jìn)行核磁分析并結(jié)合行為學(xué)水平，從2個層面探求半夏厚樸湯的作用機(jī)制。實驗結(jié)果表明，半夏厚樸湯與戊巴比妥鈉具有鎮(zhèn)靜催眠的作用，同時推斷半夏厚樸湯在大鼠體內(nèi)通過調(diào)節(jié)谷氨酰胺、磷酸肌酸、2酮戊二酸的含量以減輕腦內(nèi)神經(jīng)興奮性從而起到誘導(dǎo)睡眠的作用。

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[責(zé)任編輯曹陽陽]