劉談 呂朝耕 王升 楊婉珍 郭蘭萍

[摘要]對(duì)羥基苯甲酸香葉基轉(zhuǎn)移酶（PGT）在紫草素類(lèi)化合物的生物合成途徑中起重要作用。該文主要通過(guò)生物信息學(xué)的方法從新疆紫草轉(zhuǎn)錄組中獲得6個(gè)PGT基因，并預(yù)測(cè)其編碼蛋白的理化性質(zhì)，進(jìn)行相關(guān)基因的表達(dá)分析。結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，6個(gè)PGT蛋白序列均包含UbiA異戊烯基轉(zhuǎn)移酶家族保守結(jié)構(gòu)域及異戊烯焦磷酸結(jié)合位點(diǎn)NDxxDxxxD和可能的芳環(huán)的結(jié)合位點(diǎn)GX（K/Y）ST AL；系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析顯示PGT與同源的對(duì)羥基苯甲酸多異戊烯轉(zhuǎn)移酶（PPT）屬于2個(gè)不同的進(jìn)化枝；基因表達(dá)分析表明在紫草素類(lèi)化合物產(chǎn)量較高的新疆紫草紅色高產(chǎn)系懸浮細(xì)胞及植株的地下部分，其PGT基因的表達(dá)量明顯高于白色低產(chǎn)系及植株的地上部分，說(shuō)明新疆紫草PGT基因的表達(dá)量與紫草素類(lèi)化合物的合成呈正相關(guān)。該研究為進(jìn)一步了解對(duì)羥基苯甲酸香葉基轉(zhuǎn)移酶（PGT）的功能及特性奠定了基礎(chǔ)，并為紫草素類(lèi)化合物生物合成及代謝調(diào)控提供依據(jù)。

[關(guān)鍵詞]新疆紫草；對(duì)羥基苯甲酸香葉基轉(zhuǎn)移酶；生物信息學(xué)分析；實(shí)時(shí)熒光定量

[Abstract]The phydroxybenzoate geranyltransferases（PGT） play an important role in the biosynthesis pathways of shikonin derivatives Six PGTs were obtained from transcriptome datebase of Arnebia euchroma by using bioinformatics methods and the proteins'physiochemical properties they encoded were predicted The result of protein domain prediction showed all of the six protein sequences contained the conserved domain of Ubia prenyltransferase family and possessed the motif NDxxDxxxD for prenyldiphosphate binding and a GX（K/Y）STAL sequence for putative aromatic ring binding The phylogenetic tree showed that PGT and phydroxybenzoate polyprenyltransferase（PPT） belonged to two different clades The results of gene expression analyses showed that the expression levels in the red shikoninproficient line and the overground part of A euchroma that could produce shikonin derivatives was much higher than the white shikonindeficient line and the underground part， which suggested a positive correlation between the expression levels of PGT genes and shikonin production This study aims to lay a foudation for further understanding of the function and enzymatic properties of PGT and provide a basis for the biosynthesis pathways and metabolic regulation of shikonin derivatives

[Key words]Arnebia euchroma； phydroxybenzoate geranyl transferase gene； bioinformatics analysis； Realtime PCR

doi：10.4268/cjcmm20160809

紫草素及其衍生物是紫草科植物的重要次生代謝產(chǎn)物，屬于萘醌類(lèi)化合物，同時(shí)也是傳統(tǒng)中藥紫草的有效成分。該類(lèi)化合物主要來(lái)源于紫草科紫草屬紫草Lithospermum erythrorhizon Siebet Zucc、滇紫草屬滇紫草Onosma paniculatum Bur et Fr、假紫草屬新疆紫草Arnebia euchroma （Royle） Johnst和內(nèi)蒙古紫草A. guttata Bunge，具有抗炎[12]、抗氧化[3]、抗腫瘤[46]、保護(hù)肝臟[7]及抑制DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶[8]等生物學(xué)活性。以紫草素為主要成分的用于治療燒、燙傷藥紫草油劑及軟膏劑已在我國(guó)、日本、歐洲用于臨床，作為抗腫瘤藥也已進(jìn)入臨床研究[9]。除具有重要的藥用價(jià)值外，紫草素類(lèi)化合物還是良好的天然色素，已廣泛用于化妝品、食品和印染工業(yè)中。

通常認(rèn)為，紫草素類(lèi)化合物是通過(guò)苯丙氨酸（phenylpropanoid，PP）途徑甲羥戊酸（mevalonate，MVA）途徑/去氧木酮糖還原（2CmethylDerythritol4phosphate，MEP）途徑的復(fù)合途徑而合成（圖1）。在對(duì)羥基苯甲酸香葉基轉(zhuǎn)移酶（phydroxybenzoate geranyltransferase，PGT）的作用下，MVA/MEP途徑形成的焦磷酸香葉酯（geranyl pyrophosphate，GPP）的香葉烯基轉(zhuǎn)移到來(lái)自PP途徑代謝產(chǎn)物對(duì)羥基苯甲酸（phydroxybenzoate acid，PHB）上，形成香葉基對(duì)羥基苯甲酸（3geranyl4hydroxybenzoic acid，GHB），該化合物是生成紫草素及其衍生物的前幾步反應(yīng)中的重要前提[10]。然而，迄今為止，已報(bào)道的PGT基因僅有3個(gè)，即Yazaki[11]與Singh[12]等先后從硬紫草及新疆紫草中分離得到的LePGT1，LePGT2，AePGT。三者的異戊烯基供體底物均只有1種，即GPP，且都有2個(gè)明顯的親水環(huán)NDxxDxxxD和GX（K/Y） ST AL，前者為異戊烯焦磷酸結(jié)合位點(diǎn)，后者為可能的芳環(huán)結(jié)合位點(diǎn)[13]。此外，研究發(fā)現(xiàn)暗培養(yǎng)、寡糖和茉莉酸甲酯能同時(shí)增加培養(yǎng)基中紫草細(xì)胞PGT基因表達(dá)、PGT的酶活性以及紫草素類(lèi)化合物的形成，而光照、銨離子和2，4D卻起相反的作用，這充分證明了PGT基因的表達(dá)與紫草素類(lèi)化合物的合成直接相關(guān)。為此，充分挖掘及克隆對(duì)羥基苯甲酸香葉基轉(zhuǎn)移酶（PGT）基因，進(jìn)行外源表達(dá)以及構(gòu)建工程微生物，可為紫草素類(lèi)化合物的合成提供全新的方法。本實(shí)驗(yàn)以新疆紫草轉(zhuǎn)錄組為材料所構(gòu)建的本地?cái)?shù)據(jù)庫(kù)為基礎(chǔ)，運(yùn)用生物信息學(xué)方法篩選獲得6個(gè)新疆紫草PGT基因，并分析了其核苷酸及編碼蛋白的特性，比較了其在新疆紫草紅色懸浮細(xì)胞系和白色懸浮細(xì)胞系、植物地上和地下部分的表達(dá)水平差異，為進(jìn)一步解析新疆紫草中PGT功能及生物特性并進(jìn)行外源表達(dá)奠定基礎(chǔ)。

1材料

本研究所用的新疆紫草A euchroma PGT基因序列來(lái)源于實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)。新疆紫草轉(zhuǎn)錄組測(cè)序樣品取自細(xì)胞生長(zhǎng)平頂期，采用Illumina HiSeq 2000測(cè)序，并使用SOAdenovo對(duì)轉(zhuǎn)錄組做從頭組裝。LePGT1，LePGT2，AePGT的信息來(lái)自NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//wwwncbinlmnihgov/）。

新疆紫草愈傷細(xì)胞紅色高產(chǎn)系和白色低產(chǎn)系是由新疆紫草胚軸誘導(dǎo)并人工篩選獲得，取自中國(guó)科學(xué)院植物研究所葉和春研究員處，并由本實(shí)驗(yàn)室保存并繼代為懸浮細(xì)胞。

2方法

21新疆紫草PGT基因的獲得

從NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢得到紫草對(duì)羥基苯甲酸香葉基轉(zhuǎn)移酶（PGT）序列LePGT1，LePGT2及新疆紫草中已報(bào)道的PGT序列AePGT，并分別以它們?yōu)閝uery sequence，通過(guò)Blast軟件在新疆紫草轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中搜尋同源序列，識(shí)別標(biāo)準(zhǔn)為e≤1e-15，Score≥100，匹配數(shù)b=1；然后在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的ORF Finder（http：//www ncbinlmnihgov/gorf/orfigcgi）中查找開(kāi)放閱讀框，推導(dǎo)編碼氨基酸的基因序列。根據(jù)開(kāi)放閱讀框所編碼的氨基酸序列，利用Bioedit軟件進(jìn)一步從中挑選出同時(shí)包含異戊烯焦磷酸結(jié)合位點(diǎn)NDxxDxxxD[14]和可能的芳環(huán)的結(jié)合位點(diǎn)GX（K/Y） ST AL[11]的轉(zhuǎn)錄本作為最終候選基因。

22生物信息學(xué)分析

借助ExPASy數(shù)據(jù)庫(kù)的Protparam在線工具（Physicochemical parameters of protein sequence， http：//wwwexpasyorg/tools/protparamhtml）對(duì)基因編碼蛋白序列進(jìn)行基本理化性質(zhì)分析，包括氨基酸數(shù)目、理論等電點(diǎn)、分子式、脂溶指數(shù)、蛋白質(zhì)疏水性、不穩(wěn)定系數(shù)等；通過(guò)NCBI的CDD（Conserved Domain Datebase）數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//wwwncbinlmnihgov/ Structure/cdd/ wrpsbcgi）及ExPASy的PROSITE（http：//prosite expasy org/）對(duì)蛋白進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析；采用ExPaSy SOPMA（SelfOptimized Prediction Method with Aligment， https：// npsaprabi ibcpfr/cgibin/secpred_sopmapl）進(jìn)行蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析。采用在線蛋白分析軟件Psortb（http：// wwwpsortorg/psortb/）預(yù)測(cè)蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位；利用TMHMM Server v 20（http：//wwwcbsdtudk/services/TMHMM/）進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域分析；利用SignalP41 Serve（http：//wwwcbsdtudk/ services/SignalP/）及TargetP 11 Server（http：//wwwcbsdtudk/services/TargetP/）進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)。

在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中通過(guò)Blastx檢索與蛋白同源的其他植物序列，運(yùn)用Bioedit軟件進(jìn)行相似性分析。采用MEGA 60軟件，運(yùn)用ClustalW進(jìn)行多重序列比對(duì)，然后采用鄰接法neighjoining method構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，Bootstrap分析重復(fù)數(shù)設(shè)為1 000。

23熒光定量 PCR檢測(cè)基因表達(dá)量

231RNA提取和cDNA合成用Trizol總RNA提取試劑（美國(guó)Invtrogen公司）提取新疆紫草紅色高產(chǎn)系懸浮細(xì)胞、白色低產(chǎn)系懸浮細(xì)胞、植物地上部分樣品及地下部分樣品總RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳確定RNA完整性，紫外分光光度儀測(cè)定總RNA的A260和A280的值，選擇A260/A280為18～20的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按照cDNA合成試劑盒（TaKaRa公司）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

232Realtime PCR利用Primer Primer 50設(shè)計(jì)AePGT和新獲得6個(gè)AePGTs基因?qū)崟r(shí)熒光定量引物，擴(kuò)增長(zhǎng)度在100～150 bp，內(nèi)參基因?yàn)?8S RNA（引物序列見(jiàn)表1）。所用定量PCR儀為ABI公司7500型熒光定量PCR儀，PCR反應(yīng)體系：5 μL power SYBR GreenPCR Master Mix（Applied Biosystems）、上下游引物（10 μmol·L1）各05，1 μL模板、3 μL ddH2O，合計(jì)10 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃復(fù)性1 min，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)反應(yīng)做3個(gè)平行試驗(yàn)，結(jié)束后進(jìn)行熔解曲線分析。各基因表達(dá)量以內(nèi)參基因18S RNA作為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行相對(duì)定量，相對(duì)定量方法采用2ΔΔCt法。

3結(jié)果與分析

31新疆紫草6個(gè)AePGTs基因的核苷酸特性分析

從NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢得到LePGT1，LePGT2，AePGT序列（序列號(hào)分別為18389306，18389308，158957517），并分別以三者為探針，通過(guò)Blast軟件在新疆紫草轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中搜尋同源序列，并結(jié)合Nr，Nt，Swissprot，COG，KEGG及GO的注釋結(jié)果，共獲得44條可能同源序列。而利用Biodit軟件對(duì)候選基因進(jìn)行進(jìn)一步篩選時(shí)，發(fā)現(xiàn)其中只有6條PGT的蛋白序列同時(shí)含有NDxxDxxxD，GX（K/Y）STAL親水環(huán)。將此6條序列分別命名為AePGT1，AePGT2，AePGT3，AePGT4，AePGT5，AePGT6。ORF Finder 預(yù)測(cè)表明AePGT1全長(zhǎng)為1 170 bp；AePGT2全長(zhǎng)為741 bp；AePGT3全長(zhǎng)為771 bp；AePGT4全長(zhǎng)為924 bp；AePGT5全長(zhǎng)為735 bp；AePGT6全長(zhǎng)為924 bp。將所獲得的6個(gè)新疆紫草PGT基因提交GenBank核酸序列庫(kù)，GenBank號(hào)依次為KT991519，KT991520，KT991521，KT991522，KT991523，KT991524。

32新疆紫草6個(gè)AePGTs基因編碼蛋白特性分析

利用Protparam在線工具對(duì)本實(shí)驗(yàn)獲得的6個(gè)AePGTs基因的編碼蛋白序列進(jìn)行基本理化性質(zhì)預(yù)測(cè)（表2）。利用CDD數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)構(gòu)域，結(jié)果表明6個(gè)AePGTs均具有UbiA異戊烯基轉(zhuǎn)移酶家族保守結(jié)構(gòu)域，該家族蛋白主要功能是將異戊烯供體轉(zhuǎn)移到芳香化合物受體被活化的C原子上，參與泛醌、甲萘醌、質(zhì)體醌等化合物的生物合成。PROSITE分析結(jié)果進(jìn)一步表明6個(gè)AePGTs中均具有UbiA異戊烯基轉(zhuǎn)移酶家族標(biāo)簽（圖2），此標(biāo)簽序列中包含膜結(jié)合型芳香族異戊烯基轉(zhuǎn)移酶所具有的異戊烯焦磷酸結(jié)合區(qū)（N/D）DxxDxxxD。Psortb預(yù)測(cè)結(jié)果顯示6個(gè)AePGTs均定位在細(xì)胞質(zhì)膜上（cytoplasmic membrane），同時(shí)SignalP41 Server和TargetP 11 Server軟件分析結(jié)果顯示6個(gè)AePGTs均無(wú)線粒體信號(hào)肽，而這既是它們與已知的3個(gè)PGTs，LePGT1，LePGT2以及AePGT的共性，同時(shí)也是PGT有別于其他植物來(lái)源的的對(duì)羥基苯甲酸多異戊烯轉(zhuǎn)移酶（phydroxybenzoate polyprenyltransferase，PPT）的地方[14]，故推測(cè)PGTs與PPTs基因?qū)儆诓煌M(jìn)化枝。利用TMHMM Server v 20進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)，結(jié)果表明AePGT3，AePGT5，AePGT6具有6個(gè)跨膜螺旋，AePGT1有7個(gè)跨膜螺旋，AePGT2有8個(gè)跨膜螺旋，AePGT4則有5個(gè)跨膜螺旋。

33新疆紫草6個(gè)AePGTs基因編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

采用ExPaSy SOPMA在線軟件對(duì)6個(gè)AePGTs蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)（表3）。

34系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中分別查找得到與6個(gè)AePGTs同源的紫草、擬南芥、野生大豆、可可、玉米、毛霉菌、綠藻等物種序列，這些序列多為對(duì)羥基苯甲酸多異戊烯轉(zhuǎn)移酶（phydroxybenzoate polyprenyltransferase，PPT）。PPT與PGT同為膜結(jié)合型芳香族異戊烯基轉(zhuǎn)移酶，且都特異的以對(duì)羥基苯甲酸（PHB）作為異戊烯基的受體。不同的是，PPT的異戊烯基供體底物通常不止一種，而PGT則特異的以GPP作為異戊烯基的供體[13]。應(yīng)用Bioedit對(duì)以上序列進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)分析，其中來(lái)源于紫草科已知的3個(gè)PGTs：LePGT1，LePGT2和 AePGT與本實(shí)驗(yàn)獲得的6個(gè)AePGTs的同源性見(jiàn)表2?？梢?jiàn)，AePGT1與三者的同源性較其余5個(gè)AePGTs明顯偏低，而AePGT4，AePGT5與三者的同源性最高。LePGT1，LePGT2， AePGT與本實(shí)驗(yàn)獲得的6個(gè)新疆紫草PGTs比對(duì)結(jié)果可見(jiàn)，6個(gè)AePGTs與LePGT1，LePGT2，AePGT序列在保守區(qū)域的同源性很高，但在序列的N端卻存在較大差異。其中AePGT1較AePGT多出84 aa， AePGT2，AePGT3，AePGT5與AePGT相比則分別短缺61，51，63 aa，而AePGT4，AePGT6與AePGT在序列長(zhǎng)度上幾無(wú)差異。這一特點(diǎn)不僅有利于解釋6個(gè)AePGTs功能上可能存在的差異，而且為PGTs的結(jié)構(gòu)功能域確定提供了便利（圖3）。

應(yīng)用MEGA 60軟件對(duì)16種植物對(duì)羥基苯甲酸異戊烯轉(zhuǎn)移酶氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析（圖4）。24條序列可分為4大類(lèi)：8個(gè)雙子葉植物，野生大豆、蒺藜苜蓿、川桑、可可樹(shù)、木本棉、擬南芥、薺菜、琴葉擬南芥和3個(gè)單子葉植物，玉米、山羊草、圖小麥聚為一類(lèi)，都是高等植物中的種子植物；毛霉菌、膠球藻和綠藻聚為一類(lèi)，都是低等植物；AePGT，AePGT2，AePGT3，AePGT4，AePGT5，AePGT6，LePGT1，LePGT2聚為一類(lèi)；而AePGT1自成一類(lèi)。尤為值得關(guān)注的是，來(lái)源于紫草科的9個(gè)PGTs與其他植物來(lái)源的PPTs的確分屬于2個(gè)不同的進(jìn)化枝，這為解釋紫草科對(duì)羥基苯甲酸香葉基轉(zhuǎn)移酶（PGT）功能的特殊性，即僅以GPP作為異戊烯基的供體提供了重要依據(jù)。

35基因表達(dá)分析

本實(shí)驗(yàn)室前期的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)紅色高產(chǎn)系細(xì)胞紫草素類(lèi)化合物含量可達(dá)到干重的695%，而白色低產(chǎn)系細(xì)胞不產(chǎn)生紫草素類(lèi)化合物[15]。并且，在自然狀態(tài)下，紫草素類(lèi)化合物主要集中于植株的根部。因此，為了進(jìn)一步了解新疆紫草中PGT基因的表達(dá)水平與紫草素類(lèi)化合物生成的關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Realtime PCR分別分析比較了7個(gè)新疆紫草PGT基因 （包括AePGT）在不同細(xì)胞系（紅色高產(chǎn)懸浮細(xì)胞系和白色低產(chǎn)懸浮細(xì)胞系）以及不同部位（植株地上部分與地下部分）的表達(dá)差異狀況。7個(gè)新疆紫草PGT基因在新疆紫草紅色高產(chǎn)細(xì)胞系和白色低產(chǎn)細(xì)胞系中的相對(duì)表達(dá)水平可知，在新疆紫草白色低產(chǎn)懸浮細(xì)胞系中7個(gè)PGT基因表達(dá)量由高到低依次為AePGT4>AePGT1>AePGT5>AePGT3>AePGT>AePGT6>AePGT2；而在紅色高產(chǎn)懸浮細(xì)胞系中表達(dá)量由高到低則為AePGT5>AePGT4>AePGT>AePGT3>AePGT1>AePGT2>AePGT6。并且，7個(gè)PGT基因在白色低產(chǎn)細(xì)胞系中的表達(dá)水平均低于紅色高產(chǎn)細(xì)胞系，尤以AePGT，AePGT2，AePGT3，AePGT4，AePGT5最為明顯，暗示在不同細(xì)胞系中，紫草素類(lèi)化合物的生成與相關(guān)PGT基因的表達(dá)呈正相關(guān)（圖5）。

7個(gè)PGT基因在新疆紫草植株地上部分與地下部分的相對(duì)表達(dá)水平可知，在植株的地上部分7個(gè)PGT基因表達(dá)量由高到低依次為：AePGT3>AePGT4>AePGT2>AePGT5>AePGT>AePGT1>AePGT6；而地下部分表達(dá)量由高到低的次序?yàn)椋篈ePGT4>AePGT5>AePGT3>AePGT>AePGT2>AePGT6>AePGT1（圖6）。此外，通過(guò)對(duì)比可以看到，7個(gè)PGT基因在植株地下部分的表達(dá)水平均顯著高于地上部分。這再一次證明，光照能夠降低PGT基因的表達(dá)水平，減少紫草素類(lèi)化合物的生成量，同時(shí)進(jìn)一步說(shuō)明了紫草素類(lèi)化合物的生成與相關(guān)PGT基因表達(dá)水平的正相關(guān)性。

4討論

長(zhǎng)期以來(lái)，由于紫草素類(lèi)化合物可觀的藥用及工業(yè)價(jià)值，作為其主要來(lái)源的紫草被過(guò)量采挖，野生資源破壞嚴(yán)重，加之環(huán)境的惡化及人工種植難度大，導(dǎo)致紫草資源日漸減少。為了滿足紫草素的市場(chǎng)需求，人們?cè)噲D通過(guò)其他方式來(lái)進(jìn)行生產(chǎn)，如自20世紀(jì)80年代日本學(xué)者Terada等[16]首次完成對(duì)紫草素消旋體全合成以來(lái)，已有10多個(gè)研究組先后報(bào)道了紫草素的外消旋體、左旋或右旋異構(gòu)體、以及紫草素的衍生物的合成方法[17]。但目前報(bào)道的合成方法大多合成路線長(zhǎng)，收率較低或原料不易得、反應(yīng)條件苛刻，不適于工業(yè)生產(chǎn)。除此之外，在過(guò)去的幾十年間，日本與我國(guó)曾先后建立了紫草、新疆紫草和滇紫草的細(xì)胞培養(yǎng)體系，并對(duì)紫草素類(lèi)化合物生物合成相關(guān)代謝酶和基因及其調(diào)控展開(kāi)了全面研究[1820]，以期通過(guò)篩選高產(chǎn)細(xì)胞系、改良培養(yǎng)基、調(diào)節(jié)外加物和外加條件及利用基因工程調(diào)控和生物反應(yīng)器培養(yǎng)工藝等方式提高細(xì)胞培養(yǎng)體系中紫草素類(lèi)化合物的產(chǎn)量[21]。目前，該方法已在日本實(shí)現(xiàn)了工業(yè)化生產(chǎn)，可惜生產(chǎn)成本仍然很高。然而，微生物工程的興起使人們?cè)俅慰吹搅藦母旧辖鉀Q市場(chǎng)需求與資源保護(hù)矛盾的希望，該技術(shù)主體是利用微生物，特別是用經(jīng)過(guò)DNA重組技術(shù)改造過(guò)的微生物來(lái)生產(chǎn)商業(yè)產(chǎn)品[22]。為此，就紫草素類(lèi)化合物而言，闡明其生物合成途徑，找出其合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶及基因，從而為DNA重組及發(fā)酵做好鋪墊，是一項(xiàng)重要且有意義的研究。而測(cè)序技術(shù)及生物信息學(xué)（bioinformatics）的發(fā)展則為上述工作的順利完成提供了強(qiáng)有力的保障。尤其是近年來(lái)，分子生物學(xué)的進(jìn)步帶動(dòng)了生物信息學(xué)的發(fā)展，并將其應(yīng)用到藥用植物領(lǐng)域，為中藥研究提供了新的研究手段。比如，可以將生物信息學(xué)與系統(tǒng)生物學(xué)相結(jié)合，運(yùn)用基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)研究手段，研究中藥有效成分的產(chǎn)生機(jī)制，從而為中藥開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

本研究借助生物信息學(xué)技術(shù)，首先從新疆紫草轉(zhuǎn)錄組中檢索目的基因，共獲得了6個(gè)對(duì)羥基苯甲酸香葉基轉(zhuǎn)移酶（PGT）基因。對(duì)其做進(jìn)一步生物信息學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，6個(gè)PGT基因編碼的蛋白均具有UbiA異戊烯基轉(zhuǎn)移酶家族標(biāo)簽、異戊烯焦磷酸結(jié)合位點(diǎn)NDxxDxxxD及芳環(huán)結(jié)合位點(diǎn)GX（K/Y）STAL，這說(shuō)明新獲得的6個(gè)AePGTs蛋白可能具有將異戊烯供體轉(zhuǎn)移到芳香化合物受體被活化的C原子上的功能。細(xì)胞定位分析結(jié)果顯示6個(gè)AePGTs均定位在細(xì)胞質(zhì)膜上，同時(shí)信號(hào)肽分析結(jié)果顯示6個(gè)AePGTs均無(wú)線粒體信號(hào)肽，故推測(cè)PGTs基因與其他植物來(lái)源的的對(duì)羥基苯甲酸多異戊烯轉(zhuǎn)移酶（PPTs）不屬于同一進(jìn)化枝。而系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析則證明了該推論的正確性，這說(shuō)明PGT基因所編碼的蛋白在結(jié)構(gòu)及功能上有其特殊性，如LePGT1和LePGT2具有嚴(yán)格的底物特異性，即僅以GDP作為異戊烯基的供體[11]。Singh等[12]研究結(jié)果表明暗培養(yǎng)、寡糖和茉莉酸甲酯能增加培養(yǎng)基中紫草細(xì)胞PGT基因表達(dá)和活性以及紫草素類(lèi)化合物的形成；而光照、銨離子和2， 4D卻起到相反的作用，證明PGT基因的表達(dá)與紫草素類(lèi)化合物的合成直接相關(guān)。而本實(shí)驗(yàn)通過(guò)基因表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，7個(gè)AePGTs基因在新疆紫草紅色高產(chǎn)細(xì)胞系、白色低產(chǎn)細(xì)胞系及植株的地上和地下部分的相對(duì)表達(dá)水平差異明顯，且在紫草素類(lèi)化合物產(chǎn)量較高的新疆紫草紅色高產(chǎn)系細(xì)胞及植株的地下部分，其PGT基因的相對(duì)表達(dá)水平明顯高于白色低產(chǎn)系及植株的地上部分。這進(jìn)一步證明了PGT基因的表達(dá)與紫草素類(lèi)化合物生物合成呈正相關(guān)。

盡管PGT在紫草素的生物合成過(guò)程中扮演重要的角色，但在不產(chǎn)生紫草素類(lèi)化合物的新疆紫草白色低產(chǎn)細(xì)胞系及植株的地上部分仍然能檢測(cè)到PGT的表達(dá)。并且，本實(shí)驗(yàn)室前期的研究成果顯示[15，23]，在紫草素的生物合成過(guò)程中，位于PGT上游的一些關(guān)鍵酶在白色低產(chǎn)細(xì)胞系中同樣能夠表達(dá)，并且用茉莉酸甲酯對(duì)白色低產(chǎn)懸浮細(xì)胞進(jìn)行處理后檢測(cè)到了紫草呋喃類(lèi)化合物，該類(lèi)化合物與紫草素類(lèi)化合物的共同前體正是GBA的下游產(chǎn)物香葉基氫醌（geranylhydroquinone， GHQ）[10]。由此可見(jiàn)，白色低產(chǎn)系生成紫草素類(lèi)化合物的障礙發(fā)生位置應(yīng)當(dāng)位于PGT酶促反應(yīng)的下游，即GHQ及下游產(chǎn)物的催化反應(yīng)。然而，至今為止，與之相關(guān)的基因和酶卻鮮有報(bào)道，可見(jiàn)對(duì)新疆紫草白色低產(chǎn)系形成原因的探究及紫草素類(lèi)化合物生物合成途徑的探索仍然任重而道遠(yuǎn)。

本研究綜合了目前應(yīng)用廣泛認(rèn)可度較高的生物信息分析手段對(duì)新疆紫草做了較為完善的生物信息學(xué)研究，也為傳統(tǒng)中藥的生物信息學(xué)研究提供了文獻(xiàn)支持和參考。研究結(jié)果為進(jìn)一步了解新疆紫草中對(duì)羥基苯甲酸香葉基轉(zhuǎn)移酶（PGT）的功能及特性奠定基礎(chǔ)，并為紫草素類(lèi)化合物生物合成及代謝調(diào)控提供依據(jù)。

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[責(zé)任編輯呂冬梅]