梁文潔 盧聰宇 舒志明 周仔莉 葉嘉鈺 張躍進 梁宗鎖

[摘要]利用雄性不育系培育新品種和生產(chǎn)雜種一代，在產(chǎn)量、品質(zhì)等方面均具有獨特優(yōu)勢。前期課題組已通過多代連續(xù)雜交獲得丹參雄性不育與可育近等基因系。該文在前期工作基礎(chǔ)上采用AFLP和BSA技術(shù)對378對引物進行篩選，發(fā)現(xiàn)7對引物和26個標記與丹參育性調(diào)控基因緊密連鎖，由此構(gòu)建出連鎖遺傳圖譜。以前期發(fā)現(xiàn)的E11/M4208標記為模板，運用染色體步移技術(shù)，在不育和可育系中分別擴增出2 028，2 027 bp的差異片段，發(fā)現(xiàn)4個突變堿基位點均處于內(nèi)含子中。在所有差異標記中發(fā)現(xiàn)E01/M09418，E05/M13308，E05/M04750，E01/M01204 4個與丹參育性調(diào)控基因緊密連鎖的標記，與擬南芥1，3，5號染色體相似性達100%。其中與育性調(diào)控基因距離很近（21 cM）的E01/M09418與同處于擬南芥第3號染色體的核不育基因MS2相似度高達100%。不育系中獲得的2 028 bp片段與MS2基因在兩處相似度達100%。 與擬南芥第5號染色體相似度100%的E05/M04750，與楊樹POP085M05基因和擬南芥中低親和力鈣逆向轉(zhuǎn)運蛋白序列具有較高相似性，且E非常低。該文遺傳圖譜的構(gòu)建和功能性差異序列的發(fā)現(xiàn)，為后續(xù)準確錨定丹參基因組中育性調(diào)控基因及揭示其功能奠定了堅實基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞]丹參；雄性不育；近等基因系；可育系；染色體步移；差異序列；遺傳圖譜；AFLP

[Abstract]There is distinctive advantage of using male sterile lines to breed new cultivar and produce hybrids， when compared with general breeding method on yield and quality In our previous work， nearisogenic lines （NILs） of male sterile and fertile Salvia miltiorrhiza have been obtained through continuous hybridization in many years In this investigation， 378 primer combination were screened by using AFLP and BSA technique， in which 26 markers amplified from seven primers were found to tightly link to male sterile gene Based on these markers， two linkage genetic maps were constructed A 2 027，2 028 bp fragment was amplifed from NILs of fertile and sterile S miltiorrhiza， respectively， using genome walking technique and previous E11/M4208 marker as template Four base mutations were found in intron when comparing both fragments Among all different markers between NILs of male sterile and fertile S miltiorrhiza， four was found to have 100% identities to chromosome 1， 3 and 5 of Arabidopsis， namely， E01/M09418， E05/M13308， E05/M04750 and E01/M01204 The E01/M09418 marker was very close to male sterile gene of S miltiorrhiza with distance of 21 cM， which also had 100% identities to male sterile gene MS2 in Arabidopsis Both were distributed in chromosome 3 of Arabidopsis The 2 028 bp fragment also had 100% identities to MS2 gene Another E05/M04750 marker that had 100% identities to chromosome 5 of Arabidopsis was found to have high identities to POP085M05 gene of poplars and low affinity calcium antiporter CAX2 of Arabidopsis with very low Evalue The constructed genetic map and differential fragments with potential functions found in this study provide a solid foundation to lock male sterile genes in S miltiorrhiza genome and to discover their functions

[Key words]Salvia miltiorrhiza； male sterility； nearisogenic lines； fertile lines； genome walking； different fragments； genetic map； AFLP

doi：10.4268/cjcmm20160808

丹參Salvia miltiorrhiza Bunge根莖是我國常用大宗藥材之一，在治療心腦血管疾病、抗氧化方面具有顯著療效，藥理成分基本清楚[1]。丹參植物具有基因組小、染色體數(shù)目少、組織培養(yǎng)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)成熟等特點，被認為是中藥研究的理想模式植物[2]。

研究已發(fā)現(xiàn)，利用雄性不育系培育作物新品種和生產(chǎn)雜種一代，在產(chǎn)量、品質(zhì)、整齊度和抗逆性等方面均具有獨特優(yōu)勢，如超級雜交稻、雜交油菜和雜交小麥等。但藥用植物中基因型一致的品種少，種子來源混雜，個體間有效成分含量差異大，栽培數(shù)年后種質(zhì)易退化，影響藥材質(zhì)量穩(wěn)定[3]。栽培藥材質(zhì)量首先取決于其優(yōu)良的遺傳品質(zhì)，這主要通過品種選育獲得[4]。

前期課題組發(fā)現(xiàn)丹參雄性不育突變株后[5]，利用不同親本組合雜交發(fā)現(xiàn)丹參雜種優(yōu)勢非常明顯，不育系干根產(chǎn)量高出可育系30%以上，有效成分含量明顯提高，丹酚酸B質(zhì)量分數(shù)達4%～10%（平均6%）。通過對其遺傳規(guī)律、制種技術(shù)的研究，獲得了丹參雄性不育與可育近等基因系[6]。利用128對AFLP（擴增片段長度多態(tài)性）引物和BSA（群體分離分析法），獲得1對引物（E11/M4208）與丹參育性調(diào)控基因緊密連鎖[6]。為發(fā)掘更多與丹參育性調(diào)控基因緊密連鎖的標記，本文設(shè)計并合成了378對AFLP引物繼續(xù)進行篩選；同時對前期獲得的E11/M4208片段，采用染色體步移（genome walking）技術(shù)在其上下游進行延伸擴增，以期找出丹參雄性不育與可育近等基因系中的差異位點。將這些差異片段在測序后與擬南芥等物種進行了比對分析，從而為后續(xù)在丹參基因組中準確錨定育性調(diào)控基因、探索其功能奠定基礎(chǔ)。

1材料

2013年6月從西北農(nóng)林科技大學藥用植物園中隨機選取第5組合丹參雄性不育和可育近等基因系不育株16株（標記為S1～S16），可育株8株（標記為F1～F8）進行掛牌標記，作為本文試驗材料。

2方法

21DNA提取與AFLP標記技術(shù)采取丹參雄性不育與可育近等基因系植株的幼葉，用錫箔包好標記后立即投入液氮中帶回實驗室，后在-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩５⒒蚪MDNA提取、AFLP標記技術(shù)、差異片段回收與測序等流程均參照前期工作進行[6]。

22AFLP引物設(shè)計在實驗室前期設(shè)計AFLP引物的基礎(chǔ)上[67]，再次設(shè)計21條EcoR I （E00+3）引物（標記為E1E21）和18條Mse I（M00+3）引物（標記為M01M18）（表1），共計378（21×18）對引物組合。

23利用丹參群體驗證AFLP差異片段與育性調(diào)控基因是否連鎖將在基因池中出現(xiàn)差異條帶的引物再在群體所有個體中進行群體驗證。用“0，1”記錄聚丙烯酰胺凝膠電泳圖上的條帶，有條帶標記為“1”，沒有條帶標記為“0”，分別統(tǒng)計差異條帶在可育和不育群體中出現(xiàn)的比率。并根據(jù)驗證結(jié)果來計算遺傳距離（cM）。

其中，重組率（r）= 重組型植株數(shù)/群體單株總數(shù)×100%；而重組率（r）與2個位點在染色體上的遺傳距離（M）具有如下函數(shù)關(guān)系。

Kosambi公式：M=ln（1+2r）/（1-2r）·1/4；r=[1-e-4M]/ [1+e-4M]1/2。

24連鎖遺傳圖譜構(gòu)建將分子標記和育性性狀數(shù)據(jù)輸入并運行Mapmaker 30 軟件構(gòu)建遺傳連鎖

圖譜。Mapmaker 30是專門用于構(gòu)建分離標記的遺傳連鎖圖譜軟件，可對共顯性和顯隱性標記作多點連鎖分析（multipoint linkage analysis），既可同時估計整體數(shù)據(jù)間的連鎖關(guān)系，又可自動排除數(shù)據(jù)內(nèi)誤差對結(jié)果的影響。

25染色體步移技術(shù)及引物設(shè)計利用Primer 50軟件設(shè)計引物，以實驗室前期得到的E11/M4208片段為模板，設(shè)計出3條上游特異性引物和3條下游特異性引物（表2）。染色體步移技術(shù)按照TaKaRa試劑盒說明書進行，共進行3輪巢式PCR。將染色體步移技術(shù)擴增得到的片段用快速凝膠試劑盒Biotake進行回收，并與PMD19T載體在16 ℃條件下連接過夜。在過夜培養(yǎng)的平板上挑取單菌落于含有AMPr（100 mg·L-1）的LB液體培養(yǎng)基中搖菌10～12 h。用PMD19T通用引物M13F與M13R進行菌落PCR檢測。用質(zhì)粒小提試劑盒（康為）從培養(yǎng)過夜的菌液中提取重組質(zhì)粒，進行PCR鑒定，測序驗證。將上下游序列測序結(jié)果用DNAMAN軟件進行拼接，得到序列全長。用Primer 50軟件根據(jù)拼接得到的序列在拼接片段的上下游設(shè)計引物，分別在丹參雄性可育和不育基因池中進行全長序列擴增。

將PCR擴增獲得的片段進行膠回收，并與PMD19T載體在16 ℃連接過夜，轉(zhuǎn)化驗證后送上海生工測序。將丹參雄性不育和可育基因池擴增片段的測序結(jié)果用DNAMAN軟件進行比對，尋找兩者差異位點。

26差異片段的比對分析將篩選出的差異片段測序后，將序列提交至NCBI數(shù)據(jù)庫，運行BLAST程序進行差異片段同源性分析，統(tǒng)計相似度高的同源序列。

3結(jié)果與分析

31AFLP引物擴增與篩選以構(gòu)建的丹參雄性不育和可育池為材料，對378對AFLP引物進行了2次重復(fù)擴增篩選。其中10對引物在可育與不育基因池PCR擴增中穩(wěn)定地表現(xiàn)出差異片段。經(jīng)群體驗證后發(fā)現(xiàn)7對引物（E01/M1，E01/M9，E03/M3，E03/M10，E05/M10，E05/M13，E05/M04）與育性調(diào)控基因緊密連鎖。這7個引物擴增出差異條帶141條，每個引物平均條帶201條（表3，圖1）。其中E01/M01和E01/M09這2對引物擴增出的標記與育性調(diào)控基因遺傳距離最?。?1 cM）（圖2）。

32連鎖遺傳圖譜構(gòu)建經(jīng)軟件分析，141條差異片段中有26條與丹參育性調(diào)控基因緊密連鎖，占總差異片段的184%。這26條差異標記在測序后被構(gòu)建在2個連鎖群中（圖2），總遺傳距離為3256 cM。標記間最大距離為402 cM，位于連鎖群EM2

33丹參雄性不育與可育系染色體步移片段的獲得以E11/M04208片段為模板，運用染色體步移技術(shù)分別擴增獲得上游1 000 bp，下游1 800 bp的片段，并通過菌落PCR和質(zhì)粒PCR驗證。測序后將上下游擴增序列進行拼接，設(shè)計特異性引物在可育基因池與不育基因池中再次進行全序列擴增。除去PMD19T通用引物序列后在可育系中得到2 027 bp的序列，不育系中得到2 028 bp的序列（圖4）。經(jīng)DNAMAN序列比對，發(fā)現(xiàn)分別不育系在第662（C→T），690（C→T），1 072（G→A），1 800（T→C）位堿基發(fā)生突變，且均發(fā)生在內(nèi)含子區(qū)域。

34差異片段的比對分析運用BLAST程序?qū)λ蠥FLP差異片段和不育系中染色體步移獲得的2 028 bp片段進行比對分析，發(fā)現(xiàn)只有E01/M09418，E05/M13308，E05/M04750和E01/M01204標記與擬南芥1，3，5號染色體相似性均為100%，E在046～88（表5）。

將所有AFLP差異片段與擬南芥中已發(fā)現(xiàn)的一個僅有的核不育基因MS2（位于擬南芥第3號染色體，GenBank登錄號NM1120322）[8]序列進行比對，發(fā)現(xiàn)E01/M09418、E05/M04750標記和在不育系中通過染色體步移技術(shù)獲得的2 028 bp片段與MS2基因均具有100%相似度。

將所有AFLP差異片段與楊樹等物種基因組（片段）序列比對，發(fā)現(xiàn)E01/M09418，E05/M13308，E01/M01204，E01/M01230與潘那利番茄等物種的相似度達到100%。雖然E05/M04750與楊樹POP085M05基因序列的相似度僅有85%，但E非常小，僅有6E33（表6）。這說明楊樹中該基因可能與育性有關(guān)。

因不育系中獲得的2 028 bp序列翻譯成氨基酸序列后與擬南芥也沒有相似性，所以無法參與做氨基酸序列相似性分析。將能夠比對到擬南芥染色體上的E01/M09418，E05/M13308，E05/M04750，E01/M01204標記（表5）翻譯成氨基酸序列，與擬南芥蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進行比對，發(fā)現(xiàn)E05/M04750與擬南芥低親和力轉(zhuǎn)運蛋白CAX2相似度最高（75%），E也非常小，僅有8E-25（表7）。

4討論

在前期發(fā)現(xiàn)1對引物與丹參育性調(diào)控基因緊密連鎖的基礎(chǔ)上[6]，本文再次發(fā)掘到7對緊密連鎖引物。在擴增出的141個差異片段中有26個與育性調(diào)控基因緊密連鎖。據(jù)此本文首次在丹參中對這些與育性調(diào)控基因緊密連鎖的標記進行了遺傳圖譜構(gòu)建（圖3）。EM1圖譜中10個標記和EM2圖譜中5個標記與育性調(diào)控基因的距離均小于10 cM，在丹參全基因組序列公布后將能較精確錨定到丹參染色體及其序列上。從而為準確找尋丹參育性調(diào)控基因奠定了堅實基礎(chǔ)。

本文發(fā)現(xiàn)E01/M09418，E05/M13308，E05/M04750和E01/M01204標記不僅與丹參育性調(diào)控基因緊密連鎖，而且與擬南芥1，3，5號染色體相似性達100%（表5）。與育性調(diào)控基因距離很近（21 cM）的E01/M09418，E01/M01204均分布在擬南芥3號染色體上。其中E01/M09418與同處于3號染色體的核不育基因MS2[8]的相似度達100%，在不育系中通過染色體步移技術(shù)獲得的2 028 bp片段與MS2基因的相似度也達100%，可能預(yù)示丹參中這2個片段與育性調(diào)控密切相關(guān)。

與擬南芥5號染色體相似度很高的E05/M04750，除與MS2基因有較高相似度外，與楊樹的POP085M05基因和擬南芥的低親和力轉(zhuǎn)運蛋白也均有較高相似度，且E非常低，推測該片段可能在丹參育性轉(zhuǎn)變過程中發(fā)揮了重要作用，同時也說明育性轉(zhuǎn)換的調(diào)控存在調(diào)控鏈，在不同染色體的基因或蛋白中可能存在互作現(xiàn)象，或在同一調(diào)控鏈中存在上下游關(guān)系。

將擬南芥雄性核不育基因MS2與在不育系中通過染色體步移技術(shù)獲得的2 028 bp片段進行比對，發(fā)現(xiàn)MS2基因在2 028 bp片段的第1 500，2 000 bp左右的相似性極高。不育與可育系（2 027 bp）的4個突變位點中后兩個突變分別在第1 072，1 800個堿基，突變位點均在內(nèi)含子中。研究已發(fā)現(xiàn)內(nèi)含子突變，對其后外顯子的剪切、翻譯均具有顯著影響[9]。奇特的是，可能與丹參育性調(diào)控密切相關(guān)的E01/M09418，E05/M04750片段與不育系2 028 bp片段沒有相似度。由此也進一步證明，丹參育性轉(zhuǎn)換的調(diào)控存在調(diào)控鏈或有多個基因和蛋白參與。

[參考文獻]

[1]宋經(jīng)元，羅紅梅，李春芳，等. 丹參藥用模式植物探討[J]. 藥學學報，2013，48（7）：1099.

[2]王慶浩，陳愛華，張伯禮. 丹參：一種中藥研究的模式生物[J]. 中醫(yī)藥學報，2009，37（4）：1.

[3]陳士林，魏建和，韓建萍，等. 中藥農(nóng)業(yè)與中藥資源可持續(xù)發(fā)展[J]. 世界科學技術(shù)——中藥現(xiàn)代化，2007，9（4）：1.

[4]黃璐琦，郭蘭萍，崔光紅，等. 中藥資源可持續(xù)利用的基礎(chǔ)理論研究[J]. 中藥研究與信息，2005，7（8）：4.

[5]舒志明，梁宗鎖，孫群，等. 丹參雄性不育系ShB的鑒定與花粉發(fā)育過程的解剖學研究[J]. 西北植物學報，2006，26（11）：2202.

[6]Shu Z， Wang Z， Mu X， et al. A dominant gene for male sterility in Salvia miltiorrhiza Bunge[J]. PLoS ONE， 2012， 7（11）：e50903.

[7]Zhang Y， Guo L， Shu Z， et al. Identification of AFLP markers tightly associated with drought stress gene in male sterile and fertile Salvia miltiorrhiza Bunge [J]. Int J Mol Sci， 2013， 14：6518.

[8]Aarts M G M， Dirkse W G， Stiekema W J， et al. Transposon tagging of a male sterility gene in Arabidopsis [J]. Nature， 1993， 363（6431）：715.

[9]Ling J P， Pletnikova O， Troncoso J C， et al. TDP43 repression of nonconserved cryptic exon is compromised in ALSFTD [J]. Science， 2015， 349（6248）：650.

[責任編輯呂冬梅]