陳歡葉品良張傳濤 等

【摘要】 目的：探討肺癆康對耐異煙肼結(jié)核ahpC基因突變的影響。方法：采用全基因重測序的方法，對藥物干預(yù)后的耐異煙肼結(jié)核模型小鼠肺組織結(jié)核桿菌基因組DNA進(jìn)行重測序。以標(biāo)準(zhǔn)菌株（H37RV）為參考序列，篩選出與ahpC基因相關(guān)的突變位點，進(jìn)行對比分析。結(jié)果：7個堿基突變位點的ahpC基因?qū)?yīng)的密碼子和氨基酸均未發(fā)生改變。肺癆康組和肺癆康聯(lián)合異煙肼組的突變位點2729621，對應(yīng)的密碼子Gcc→Tcc，氨基酸由丙氨酸變?yōu)榻z氨酸。結(jié)論：肺癆康對ahpC基因突變無修復(fù)作用，突變位點2729621，可能是肺癆康干預(yù)過的小鼠與未使用肺癆康干預(yù)過的小鼠之間的個體差異相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點。肺癆康抗結(jié)核的作用機制，需要參考與異煙肼耐藥相關(guān)的其它基因的文獻(xiàn)資料做進(jìn)一步研究討論。

【關(guān)鍵詞】 肺癆康； 耐異煙肼結(jié)核； ahpC基因突變

The Research on Relationship between Feilaokang and ahpC Gene Mutation of Isoniazid-resistant Tuberculosis/CHEN Huan，YE Pin-liang，ZHANG Chuan-tao，et al.//Medical Innovation of China，2016，13（08）：001-004

【Abstract】 Objective：To explore the effect of Feilaokang on Isoniazid-resistant TB ahpC gene mutation.Method：Used the method of whole genome sequencing after drug intervention of isoniazid resistance tuberculosis mouse with lung tissue tuberculosis DNA analysis.In standard strains （H37RV） as the reference sequence，selected associated with ahpC gene mutations to make a contrastively analyzed.Result：Seven bases of ahpC gene corresponding codon and amino acid had not been changed.The feilaokang group and feilaokang combine isoniazid group 2729621 of gene mutation locus，the corresponding codon Gcc changed to Tcc，by alanine to serine.Conclusion：Feilaokang cant repair ahpC gene mutation locus 2729621 maybe is the single nucleotide polymorphism refer to individual difference between the mouse using feilaokng intervention with the mouse not using feilaokang intervention.The mechanism of feilaokang resistance TB need refer to more gene literature associated with isoniazid resistance to make further researching and discussion.

【Key words】 Feilaokang； Resistant-isoniazid tuberculosis； ahpC mututation

First-authors address：Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，Chengdu 610075，China

doi：10.3969/j.issn.1675-4985.2016.08.001

“肺癆康”是在歷代醫(yī)家辨治“肺癆”經(jīng)驗的基礎(chǔ)上，根據(jù)臨證經(jīng)驗不斷總結(jié)組成的中藥復(fù)方，主要由蒸百部、白及、天門冬、川貝母、北沙參、蛤蚧、阿膠等十一味中藥組成，滋陰清熱，潤肺止咳，抗癆殺蟲。臨床觀察發(fā)現(xiàn)，肺癆康可以促進(jìn)肺部結(jié)核部分患者臨床癥狀和肺部體征消失[1]。前期研究發(fā)現(xiàn)肺癆康能延長耐多藥結(jié)核模型小鼠的存活時間，緩解肝、脾、肺的炎性反應(yīng)，對耐藥結(jié)核分枝桿菌具有明顯的抗菌作用[2-4]。本研究以耐異煙肼結(jié)核小鼠模型為研究對象，運用基因組重測序的方法對模型小鼠進(jìn)行DNA測序，擬證實肺癆康能修復(fù)與耐異煙肼耐藥相關(guān)的ahpC基因的突變，為探究肺癆康的抗耐異煙肼結(jié)核分子機制提供基因依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 SPF級昆明種小鼠120只（購自成都達(dá)碩生物科技有限公司，合格證號：SCXK（川）2013-24），雌雄各半，體重18～22 g，檢疫后備用。小鼠自購買后，自由攝食飲水適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，實驗室環(huán)境溫度控制在（25±2）℃。動物標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料購自成都達(dá)碩生物科技有限公司。

1.2 實驗藥物

1.2.1 肺癆康藥液的制備及用量用法 肺癆康方劑中藥物均購自北京同仁堂成都分店。將上述中藥飲片采用傳統(tǒng)方法一次性煎煮完畢。煎煮方法：將除阿膠、蛤蚧外的九味藥物冷水浸泡1 h后煎煮3次，第1次煮沸后煎煮15 min，第2次煮沸后煎煮20 min，第3次煮沸后煎煮30 min，3次過濾的藥液混合，趁熱加入烊化好的阿膠及蛤蚧粉。用電子恒溫水箱60℃低溫將藥液濃縮至含生藥1 g/mL，放入4 ℃冰箱保存，每日取適量藥液加熱使用。前期實驗得出高劑量肺癆康用量為6 g/kg灌胃時，對耐藥結(jié)核治療效果明顯，經(jīng)過換算后得出體質(zhì)量20 g的小鼠肺癆康藥液灌胃量約為0.12 mL/d。小鼠每3天稱量一次體重，根據(jù)小鼠體重情況增減灌胃的藥液量[3]。

1.2.2 異煙肼液的制備及用量用法 異煙肼片（100 mg/片，沈陽紅旗制藥有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字H21022350，產(chǎn)品批號：201309021）按照成人用量：0.3 g/d，1 次/d[5]。將異煙肼片磨成粉狀，加入蒸餾水，混合均勻。以成人體重70 kg、小鼠體重20 g，按體表面積折算等效量比（成人：小鼠=1∶0.0026）進(jìn)行計量換算，體重20 g的小鼠給藥量為0.001 54 g/d[6]。將藥物研末后加蒸餾水溶解稀釋100倍，則20 g小鼠灌胃INH藥量約為0.15 mL。

1.2.3 肺癆康聯(lián)合異煙肼藥液的制備及用量用法 肺癆康藥液和異煙肼液等體積混合均勻，按6 g/kg體重計算，20 g重的小鼠需給予灌胃約0.12 mL。

1.3 實驗主要試劑 1X Low TE Buffer （10 mM Tris-HCl，pH 8.0，0.1 mM EDTA）；50 xTAE concentrate Solution buffer（生工生物工程（上海）有限公司，SD8101-500mL）；MinElute PCR Purification（KitQiagen，136270849）；Qubit?dsDNA HS Assay Kit（Invitrogen，Q32854）；HiSeq PE Cluster Kit v4（Illumina，PE-401-4001）；HiSeq SBS Kit v4（Illumina，F(xiàn)C-401-4003）。

1.4 實驗主要儀器設(shè)備 Qubit? 2.0 Fluorometer（Invitrogen，Q32866）；Magnetic Stand-96（Life Technologies，AM10027）；GeneAmp PCR System 9700（Life Technologies，4314878）；MicroCentrifuge（Eppendorf，5418）；cBot Clonal Amplification System（Illumina，SY-301-2002）；HiSeq 2500 Sequencing System（Illumina，SY-401-2501）。

1.5 實驗菌株 H37RV標(biāo)準(zhǔn)結(jié)核分枝桿菌菌株（ATCC：27294）由中國疾病預(yù)防控制中心四川結(jié)核病預(yù)防控制分中心提供，含量為1 mg/mL含1×106 cfu；耐異煙肼結(jié)核分枝桿菌菌株20130332（000962.3）由中國疾病預(yù)防控制中心四川結(jié)核病預(yù)防控制分中心提供，含量為1 mg/mL含1×106 cfu。

1.6 實驗場地 成都中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實驗室；四川省疾病控制預(yù)防中心實驗室，實驗室備案證書：川衛(wèi)BSL-2-A備（2009）第0081-01號；上海伯豪生物科技有限公司。

1.7 實驗方法

1.7.1 動物造模及分組 SPF級昆明種小鼠120只，參照文獻(xiàn)[7]采用小鼠尾靜脈法建立耐異煙肼結(jié)核小鼠模型，選取80只SPF級昆明種小鼠，每只注射0.1 mL耐異煙肼菌懸液。將耐異煙肼結(jié)核小鼠隨機分為耐異煙肼結(jié)核模型組、異煙肼組、肺癆康組、聯(lián)合組，共四組，每組20只，再將其分別分籠編號。將H37RV標(biāo)準(zhǔn)菌菌懸液注入20只小鼠的尾靜脈，每只0.1 mL，編為標(biāo)準(zhǔn)菌株組，對其進(jìn)行分籠編號。剩下20只小鼠，作為空白組。

1.7.2 藥物干預(yù)方法 造模1周后開始對6組小鼠進(jìn)行藥物灌胃干預(yù)。用配制好的異煙肼液、肺癆康藥液、肺癆康聯(lián)合異煙肼藥液分別對異煙肼組、肺癆康組、聯(lián)合組的小鼠進(jìn)行干預(yù)。模型組和空白組的小鼠用生理鹽水干預(yù)，按照20 g體重灌胃0.12 mL生理鹽水的標(biāo)準(zhǔn)，隨小鼠體重增減。以上五組小鼠均連續(xù)灌胃56 d。

1.7.3 標(biāo)本的采集與保存 第57天脫頸椎處死小鼠，用75%酒精消毒小鼠體表5 min，無菌條件下解剖小鼠，完整取出雙肺，用生理鹽水沖洗，取小鼠肺門部位組織，約重0.1 g，放入無菌試管內(nèi)，置冰箱保存。

1.7.4 基因組測序 隨機從5個實驗組中抽出1～2個小鼠肺組織樣本，并將這些樣本進(jìn)行滅活，分離出結(jié)核分枝桿菌。采用DNeasy Blood & Tissue Kit （Qiagen，69506）設(shè)備，嚴(yán)格按照生產(chǎn)廠商提供的標(biāo)準(zhǔn)操作流程進(jìn)行基因組DNA抽提及純化。純化后的DNA經(jīng)Qubit? 2.0 Fluorometer和0.8%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行質(zhì)檢，質(zhì)檢合格的DNA進(jìn)行后續(xù)的測序?qū)嶒灐０凑諏嶒炚f明書對基因組DNA進(jìn)行片段化，末端修復(fù)、3末端加A、連接接頭、富集等步驟，完成測序樣本文庫構(gòu)建。所建文庫使用Qubit? 2.0 Fluorometer檢測濃度，按照cBot User Guide所示相應(yīng)流程，在Illummina HiSeq 2500測序儀配套的cBot上完成Cluster生成和第一向測序引物雜交。按照HiSeq 2500 User Guide準(zhǔn)備測序試劑，將攜有cluster的flow cell上機測序。測序過程由Illumina提供的data collection software進(jìn)行控制，并進(jìn)行實時數(shù)據(jù)分析。

1.8 數(shù)據(jù)處理 測序得到的原始圖像文件，經(jīng)過堿基識別及誤差過濾，得到可以用于分析的原始測序片段稱之為Reads。測序得到Raw Reads進(jìn)行過濾，得到可用于數(shù)據(jù)分析的clean Reads。使用bwa軟件（version 0.7.8）對預(yù)處理后的reads進(jìn)行Genome mapping（參考基因組版本為：肺結(jié)核桿菌（M.tuberculosis）H37RV標(biāo)準(zhǔn)菌（REF）），利用samtools軟件將原始文件轉(zhuǎn)換為bam文件，Picard軟件的Markduplicates工具用來標(biāo)記可能的PCR重復(fù)，去掉可能的有PCR錯誤導(dǎo)入的假陽性突變，samtools的flagstat工具統(tǒng)計mapping信息。GATK的IndelRealigner 工具對bam文件中的存在INS/DEL的位點，或者已知的INS/DEL位點附近進(jìn)行局部的多序列比對，減少因為插入缺失導(dǎo)致的reads邊緣假的SNP位點；InDel結(jié)果由GATK UnifiedGenotyper對多個樣品的bam文件同時處理，（保留Qual高于30的突變位點），Mapping生成的比對結(jié)果為BAM文件，結(jié)果由GATK Unified Genotyper對樣品bam文件同時處理，得到的vcf文件，snpEff軟件完成突變的注釋，通過Perl腳本處理得到最終的結(jié)果。同一個項目下的所有樣品方在同一個Excel表格下進(jìn)行手工篩選比較。

2 結(jié)果

以ahpC基因為查找內(nèi)容，手工篩選各excel表中snpEff軟件完成突變的注釋，模型組、肺癆康組、異煙肼組、聯(lián)合組分別與標(biāo)準(zhǔn)菌株組對比，發(fā)現(xiàn)

5個相同的能影響的堿基突變位點，分別為2721562、2723252、2723506、2729058、2729832。5個堿基突變位點其分別對應(yīng)的堿基突變?yōu)镃→G、T→G、T→C、A→C、G→C。其中肺癆康組與模型組對比，發(fā)現(xiàn)多出一個突變位點2729621，堿基突變?yōu)镃→A。異煙肼組與模型組比較，發(fā)現(xiàn)多出一個突變位點2726141，堿基突變?yōu)镃→T。發(fā)現(xiàn)2729621、2726141這兩個突變位點在聯(lián)合組中均能找到。與標(biāo)準(zhǔn)菌株作序列對比的4個實驗組的7個影響ahpC基因的堿基突變位點，與影響基因ahpC相對應(yīng)的密碼子、氨基酸均未發(fā)生變化，見表1；這些突變位點的影響基因均不單一，2729058、2729621位點發(fā)生錯義突變，影響程度中等（MODERATE）。2729058密碼子cTg→cGg，氨基酸由亮氨酸變?yōu)榫彼帷?729621僅出現(xiàn)在肺癆康組、聯(lián)合組，密碼子Gcc→Tcc，引起氨基酸丙氨酸變?yōu)榻z氨酸。2721562、2723252、2723506、2729832發(fā)生沉默突變，影響小（LOW），不會影響蛋白質(zhì)的功能和表達(dá)，其對應(yīng)的氨基酸未被翻譯出來。2726141引起的變異位于基因間區(qū)，密碼子、氨基酸未發(fā)生改變，見表2。

3 討論

耐異煙肼結(jié)核是指經(jīng)體外藥物敏感性試驗證實，對異煙肼耐藥的結(jié)核。異煙肼是治療結(jié)核最常用的一線藥物，其作用機制可能是抑制敏感細(xì)菌分枝菌酸的合成而破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的完整性。從1952年使用至今，已有63年的歷史。可能由于異煙肼長期、廣泛及不規(guī)范的使用，導(dǎo)致了異煙肼出現(xiàn)了全球性的耐藥。根據(jù)2007年在中國做的全國性調(diào)查，表明有16%新發(fā)結(jié)核病例和38.5%已經(jīng)治療過的結(jié)核病例耐異煙肼[8]。耐異煙肼結(jié)核病一直被認(rèn)為是發(fā)展成耐多藥結(jié)核的第一步[multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB：是指結(jié)核病患者感染的結(jié)核分枝桿菌經(jīng)體外藥敏實驗證實至少同時對異煙肼（isoniazid，INH或H）和利福平（rifampicin，RFP或R）兩種以上一線抗結(jié)核藥物耐藥][9]。

目前已知的INH耐藥相關(guān)突變基因有katG、inhA、kasA、ahpC、oxyR、ndh。KatG基因和inhA基因的突變僅能解釋80%以上耐異煙肼菌株[10]，還有少部分的異煙肼耐藥與kasA、ahpC、oxyR、ndh等基因相關(guān)。文獻(xiàn)[11-12]提示，耐異煙肼結(jié)核桿菌ahpC的突變率為13.2%，ahpC突變引起ahpC蛋白的過量表達(dá)，降低過氧化物的濃度，從而阻抑了KatG介導(dǎo)的異煙肼活化，導(dǎo)致異煙肼耐藥[13-14]。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的密碼子突變位點有-9、-46、-48、-49、

-50、-51、-52、-53、-54位（相對ahpC起始密碼子）等[15]。本次實驗研究顯示，影響ahpC基因的堿基突變位點有7個，其影響密碼子改變的位置均未在目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的突變位點上。ahpC基因?qū)?yīng)的密碼子、氨基酸未發(fā)生突變。這7個位點的等位基因頻率均大于10%，可能是單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點，可能與耐異煙肼結(jié)核分枝桿菌的易感染因素相關(guān)。肺癆康組、聯(lián)合組與模型組、異煙肼組相比較，多出突變位點2729621，其對應(yīng)的密碼子Gcc→Tcc，氨基酸由丙氨酸變?yōu)榻z氨酸。該位點可能是肺癆康干預(yù)過的小鼠與未使用肺癆康干預(yù)過的小鼠之間的個體差異的相關(guān)位點。肺癆康與修復(fù)ahpC基因突變相關(guān)的假設(shè)不成立，肺癆康抗結(jié)核的作用機制，需要參考與異煙肼耐藥相關(guān)的其他基因的文獻(xiàn)資料，做進(jìn)一步研究討論。

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（收稿日期：2015-11-19） （本文編輯：蔡元元）