田翠霞 魏強(qiáng) 李憲彬

摘要：為探究擬南芥和水稻BRI1基因差異表達(dá)的原因，本研究克隆了OsBRI1啟動(dòng)子，并將其構(gòu)建在植物表達(dá)載體pCambia2300-GUS上，為進(jìn)一步轉(zhuǎn)化擬南芥或其他植物并研究其表達(dá)模式奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：水稻；油菜素內(nèi)酯；OsBRI1

中圖分類號(hào)：S511+Q78文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2016）08-0001-05

AbstractIn order to explore the reasons for expression difference of BRI1 in rice and Arabidopsis thaliana， we cloned the OsBRI1 promoter and connected it on the plant expression vector pCambia2300-GUS. These results laid foundations for further transformation into Arabidopsis or other plants and study on its expression patterns.

KeywordsRice； Brassinosteroids； OsBRI1

植物激素（plant hormone）是植物體內(nèi)產(chǎn)生的一類在很低濃度時(shí)即可對(duì)植物的生長發(fā)育、代謝、環(huán)境應(yīng)答等生理過程產(chǎn)生重要調(diào)控作用的代謝產(chǎn)物，在植物生長過程中扮演著極其重要的角色。植物中最早發(fā)現(xiàn)的一類甾醇類激素是蕓苔甾內(nèi)酯（brassinolide， BL）[1]。到目前為止，已發(fā)現(xiàn)60多種具BL結(jié)構(gòu)的類似物，廣泛存在于植物的不同組織和器官中，由于它們的功能與BL相似，統(tǒng)稱為油菜素甾醇類物質(zhì)（brassinosteroid， BR）[2-4]，BL是油菜素甾醇類成員中生物活性最強(qiáng)的一種分子。隨著BR結(jié)構(gòu)鑒定和人工合成BR的出現(xiàn)，科學(xué)家們進(jìn)行了大量的生理學(xué)研究，不僅確定了BR在多種植物中的促生長作用，還揭示了BR的多種其它功能，包括種子萌發(fā)、氣孔形成、維管分化、株型、開花、雄性可育性和抑制衰老等[5]。外施具生物活性的BR能增強(qiáng)植物對(duì)各種脅迫的抗性，包括生物和非生物脅迫[6-8]。自20世紀(jì)80年代起，BR已被廣泛用于增加農(nóng)作物和蔬菜的產(chǎn)量。在水稻中，BR影響許多農(nóng)藝性狀如糧食產(chǎn)量、株高、葉角、籽粒大小和分蘗數(shù)等[9，10]。

BR的感知和信號(hào)傳遞過程需要眾多基因參與，首先通過一個(gè)定位于細(xì)胞膜上的富含亮氨酸重復(fù)序列（leucine-rich repeats， LRRs）的跨膜類受體蛋白激酶BRI1 （brassinosteroid insensitive 1） 感知傳遞信號(hào)[11，12]，然后才能激活一系列的信號(hào)級(jí)聯(lián)傳遞[13，14]。利用AtBRI1啟動(dòng)子在野生型擬南芥中驅(qū)動(dòng)GUS表達(dá)，顯示AtBRI1在根、莖、葉柄及葉中廣泛表達(dá)[15]。采用RT-PCR技術(shù)，檢測(cè)水稻各組織器官中OsBRI1的表達(dá)模式，其主要在芽中表達(dá)，在根部表達(dá)不明顯[16]。本文構(gòu)建了OsBRI1啟動(dòng)子（pOsBRI1）的表達(dá)載體，為利用pOsBRI1在野生型擬南芥中驅(qū)動(dòng)GUS報(bào)告基因的表達(dá)，在同一水平觀察水稻和擬南芥BRI1的表達(dá)位置及表達(dá)量的差異，以及揭示OsBRI1基因的表達(dá)特征奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1試驗(yàn)材料水稻日本晴基因組DNA。

1.1.2菌株和載體大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、pCambia2300-GUS載體質(zhì)粒由陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院進(jìn)化發(fā)育實(shí)驗(yàn)室保存。克隆載體pMD19-Simple購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.1.3酶、試劑盒及其他耗材LA Taq酶、Sal Ⅰ、BamHⅠ、T4 DNA Ligase、6×DNA Loading Buffer、DNA Marker、dNTP Mixture 購自寶生物工程（大連）有限公司；KOD FX（附有dNTPs，KOD Buffer） 購自KOD公司；NheⅠ、RNA溶解酶溶液購于NEB公司；EasyPure Quick Gel Extraction Kit、EasyPure Plasmid MiniPrep Kit購自O(shè)miga；其他藥品試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

1.1.4引物和測(cè)序PCR引物合成及DNA測(cè)序工作由南京金斯瑞生物工程股份有限公司完成。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1引物設(shè)計(jì)根據(jù)TAIR （The Arabidopsis Information Resource）網(wǎng)站上AtBRI1的基因序列，在網(wǎng)站Phytozm中查找水稻日本晴BRI1基因，定義起始密碼子ATG上游2 000 bp為啟動(dòng)子序列。根據(jù)表達(dá)載體pCambia2300-GUS插入位點(diǎn)的酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)PCR引物，pOsBRI1-F： 5′-GCGTCGACCCCAATGCATGGATAGTTTAGGTTG3′ （下劃線為限制性內(nèi)切酶SalⅠ的酶切位點(diǎn)），pOsBRI1-R： 5′-CGGGATCCGAAGTGATGAGGAGGAGATGGAGAGAG-3′ （下劃線為限制性內(nèi)切酶BamHⅠ的酶切位點(diǎn)）。

1.2.2啟動(dòng)子克隆以水稻日本晴基因組DNA為模板，用設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系50 μL：2×PCR Buffer for KOD FX 25 μL，2 mmol/L dNTPs 10 μL，10 pmol/μL上下游引物各1.5 μL，Template DNA 1 μL，1.0 U/μL KOD FX 1 μL，最后加ddH2O將反應(yīng)體系調(diào)至50 μL。PCR反應(yīng)程序： 95℃預(yù)變性5 min；98℃變性15 s， 58℃退火30 s， 68℃延伸2 min 20 s，循環(huán)25次；68℃延伸10 min，16℃恒溫保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳分離，用凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)并記錄結(jié)果。將PCR回收產(chǎn)物加A，純化，與載體pMD19-Simple連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽性克隆抽提質(zhì)粒進(jìn)行酶切檢測(cè)，將檢測(cè)的陽性質(zhì)粒送去測(cè)序。

1.2.3表達(dá)載體構(gòu)建將測(cè)序正確的質(zhì)粒及pCambia2300-GUS載體質(zhì)粒進(jìn)行SalⅠ、BamHⅠ雙酶切。酶切體系為：pOsBRI1質(zhì)粒5 μL，SalⅠ、BamHⅠ各0.5 μL，1.5×T Buffer 2 μL加ddH2O平衡反應(yīng)體系終體積到20 μL；同時(shí)在另一小EP管中加入pCambia2300-GUS載體質(zhì)粒5 μL，SalⅠ、BamHⅠ各0.5 μL，1.5×T Buffer 2 μL加ddH2O平衡反應(yīng)體系終體積到20 μL。將以上兩個(gè)酶切體系同時(shí)置于37℃保溫箱中反應(yīng)3 h。酶切結(jié)束后用2%的瓊脂糖凝膠電泳純化反應(yīng)產(chǎn)物，并回收目的片段及載體片段。用T4連接酶將目的片段連接到pCambia2300-GUS載體上。連接體系10 μL：pCambia2300-GUS載體1.5 μL、目的片段7 μL、T4 DNA連接酶0.5 μL、10×T4 DNA ligase Buffer 1 μL，16℃反應(yīng)12 h。載體構(gòu)建示意圖見圖1。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，挑選陽性抗性菌落進(jìn)行PCR檢測(cè)，將陽性菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，提質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切再檢測(cè)。

2結(jié)果與分析

2.1OsBRI1啟動(dòng)子的克隆

以水稻日本晴基因組DNA為模板，用pOsBRI1-F和pOsBRI1-R為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。電泳檢測(cè)結(jié)果（圖2）顯示，擴(kuò)增出2 000 bp左右的條帶，與預(yù)期目的片段大小相符。

將回收的PCR產(chǎn)物加尾純化后連接到pMD19-Simple 載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑選白色單菌落，使用菌落PCR方法進(jìn)行初步篩選，將菌落PCR檢測(cè)得到的陽性菌抽提質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切（SalⅠ和BamHⅠ、NheⅠ和BamHⅠ）及單酶切（NheⅠ）檢測(cè)，由圖3可知，酶切片段與預(yù)期相符，說明目的片段已連接到載體上。將檢測(cè)陽性的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與Phytozm網(wǎng)站提供的水稻日本晴序列對(duì)比結(jié)果見圖4，說明基因未發(fā)生突變。

2.2表達(dá)載體構(gòu)建

將OsBRI1啟動(dòng)子經(jīng)酶切連接到pCambiaM：DNA Marker；1：SalⅠ與BamHⅠ雙酶切片段；2：NheⅠ單酶切片段；3：NheⅠ和BamHⅠ雙酶切片段；SalⅠ與BamHⅠ雙酶切片段分別長2 065、2 692 bp；NheⅠ單酶切片段長4 757 bp；NheⅠ和BamHⅠ雙酶切片段分別長1 224、3 533 bp。

2300-GUS表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，對(duì)陽性菌抽提質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切（SalⅠ和BamHⅠ）鑒定（圖5），結(jié)果顯示pOsBRI1成功連接到pCambia2300-GUS表達(dá)載體上。

3討論與結(jié)論

BR是一種廣泛存在于植物中的類固醇激素，通過位于細(xì)胞膜上的跨膜類受體蛋白激酶BRI1感知和傳遞信號(hào)。已有的研究表明，擬南芥BRI1在整個(gè)植株內(nèi)廣泛表達(dá)，但水稻BRI1在根部表達(dá)不明顯。BRI1在水稻和擬南芥中的表達(dá)差異是基因本身造成的還是由于啟動(dòng)子區(qū)的差異所致，為了探究其原因，我們對(duì)十字花科和禾本科BRI1基因序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)BRI1的編碼序列保守，但其啟動(dòng)子區(qū)存在多樣性，由此推測(cè)，啟動(dòng)子區(qū)的多態(tài)性可能導(dǎo)致BRI1蛋白在水稻和擬南芥中的表達(dá)差異。因此，我們根據(jù)已經(jīng)公布的水稻日本晴基因序列，結(jié)合表達(dá)載體pCambia2300-GUS上的酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)引物克隆得到OsBRI1啟動(dòng)子，并成功連接到pCambia2300-GUS載體上。該研究為進(jìn)一步研究十字花科與禾本科BRI1表達(dá)差異奠定了基礎(chǔ)，以期為深入探究水稻的BR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制做出貢獻(xiàn)。

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