趙黎明

摘要：對水稻中2個(gè)新的F-box蛋白基因Os5h和Os7h進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測分析。試驗(yàn)結(jié)果表明，基因序列分析確定Os5h和Os7h是F-box家族的兩個(gè)基因：啟動(dòng)子預(yù)測分析結(jié)果表明，這兩個(gè)基因含有大量的與光反應(yīng)應(yīng)答相關(guān)的元件，并且也都含有非生物逆境應(yīng)答元件：對這兩個(gè)基因進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析和共表達(dá)基因的分析，Os5h基因在花中表達(dá)最高，胚芽中最低，Os7h基因在根中表達(dá)相對其他組織較低，但整體表達(dá)相對比較均勻。

關(guān)鍵詞：水稻；Os5h基因；Os7h基因；F-box；生物信息學(xué)

中圖分類號：S511；078 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）09-2396-04

F-box蛋白是一類含有40～50個(gè)保守氨基酸F-box結(jié)構(gòu)域的蛋白家族成員，在真核生物中廣泛存在。研究報(bào)道雙子葉模式植物擬南芥基因組中至少存在568個(gè)F-box蛋白基因，單子葉模式植物水稻中有687個(gè)F_box蛋白基因。植物F-box蛋白基因家族中只有少部分F-box蛋白基因的功能被研究報(bào)道，研究表明F-box蛋白參與許多植物生長發(fā)育的過程，尤其與花發(fā)育有關(guān)，并參與生長素、乙烯、GA、JA等激素和光信號傳導(dǎo)等多種生理過程，也在植物的逆境和防御反應(yīng)中發(fā)揮重要功能。最近報(bào)道F-box蛋白SLF控制植物基于S-RNase的自交不親和。F-box蛋白在生物體內(nèi)數(shù)量龐大，功能復(fù)雜，但目前已經(jīng)研究透徹的F-box蛋白基因非常有限，為此，美國針對模式植物擬南芥啟動(dòng)了擬南芥全基因組F-boX蛋白研究計(jì)劃，這一計(jì)劃的實(shí)施將促進(jìn)F-box蛋白家族功能的揭秘，

關(guān)于水稻中F-box蛋白類基因的研究較少，其中1個(gè)赤霉素不敏感的基因dwarf2是赤霉酸信號的正調(diào)控因子。dwarf3（D3）控制著水稻分蘗芽的活動(dòng)，MAIF1受非生物逆境誘導(dǎo)，可能是mieroRNA的靶基因。

為了更多地了解F-box蛋白基因在水稻中的表達(dá)特性，本研究對水稻中2個(gè)新的F-box蛋白基因進(jìn)行了生物信息學(xué)預(yù)測分析，有助于揭示F-boX蛋白家族的功能，同時(shí)為水稻作物遺傳改良提供參考。

1 材料與方法

1.1 基因結(jié)構(gòu)及其編碼蛋白序列的特征分析

RiceGenomeAnnotationProjectRiceGenomeBrowser網(wǎng)站分析基因結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)序列。Pfm（http：//pfam.sanger.ac.uk/）和Mobyle數(shù)據(jù)庫（http：//mobyle.pasteur.fr/cgi-bin/portal，py？#forms：：hm-memit）獲得F-boxmotif結(jié)構(gòu)域及其氨基酸序列。采用ClustalXVersion2.0程序比對蛋白質(zhì)序列。

1.2 2個(gè)F-box基因的啟動(dòng)子預(yù)測

選取基因ATG上游1500bp的啟動(dòng)子序列在PlantCARE （http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）中進(jìn)行分析，顯示基因啟動(dòng)子序列所包含的motif，選取相關(guān)的重要motif，根據(jù)結(jié)果進(jìn)行修正，手工繪圖。

1.3 2個(gè)F-box基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析

在CREP（http：//crep.ncpgr.cn/crep-cgi/home.p1）水稻基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫中分別搜集了Os5h、Os7h基因在明恢63以及珍汕97品種兩個(gè)水稻品種中8個(gè)對應(yīng)組織器官的表達(dá)情況。

1.4 2個(gè)F-box基因的共表達(dá)分析

Os5h和Os7h的共表達(dá)分析是在水稻寡核酸芯片數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行的（http：//www.ricearrav.org/eoex-pression/coexpression.shtml），相關(guān)性的閾值設(shè)置為0.5。分析的步驟完全按照網(wǎng)站說明進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻Os5h和Os7h的結(jié)構(gòu)模式圖及其編碼蛋白的序列特征

在RiceGenomeAnnotationProjectRiceGenomeBrowser網(wǎng)站（http：//rice.plantbiology.msu.edu/analvses.shtml）分別輸入Os5h、Os7h基因的水稻LOC號，即顯示這兩個(gè)基因的模式圖，確定了各基因的內(nèi)含子和外顯子的數(shù)目及位置。Os5h含有3個(gè)外顯子，CDS總長894bp，編碼297個(gè)氨基酸。Os7h含有5個(gè)外顯子，CDS總長1191bp，編碼396個(gè)氨基酸（圖1）。

將Os5h、Os7h基因的蛋白序列及F-boxmotif的氨基酸序列用ClustalXVersion2，0程序來進(jìn)行蛋白質(zhì)的序列比對，并對結(jié)果進(jìn)行手工修正繪圖。得到蛋白序列特征模式圖（圖2）。圖中黑色方框?yàn)镺s5h、Os7h基因所編碼蛋白含有的F-boxdomain，表明它們都屬于F-box家族基因。

2.2 啟動(dòng)子的預(yù)測分析

啟動(dòng)子預(yù)測分析顯示（圖3），水稻Os5h和Os7h均含有大量光應(yīng)答有關(guān)的元件。如Q-box、GAG-motif、Box I、Spl、I-box等，熱脅迫應(yīng)答元件HSE。茉莉酸甲酯的應(yīng)答元件CGTCA-motif、TGACG-motif，脫落酸應(yīng)答順式元件ABRE，胚乳表達(dá)元件Skn-1motif。另外，Os5h還含有賦予高轉(zhuǎn)錄水平元件的5UTR Py-richstretch、低溫應(yīng)答LTR元件、厭氧誘導(dǎo)ARE元件、冷和脫水應(yīng)答元件C-repeat/DRE、防御和脅迫應(yīng)答TC-richrepeats元件、水楊酸應(yīng)答TCA-element元件、晝夜節(jié)律控制cir-cadian元件。Os7h還含有干旱誘導(dǎo)MBS元件、缺氧特異誘導(dǎo)GC-motif元件、胚乳表達(dá)GCN4_motif元件及分生組織特異激活元件CCGTCC-box。

2.3 水稻Os5h和Os7h基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析

在CREP（http：//crep.ncpgr.cn/crep-cgi/home.p1）水稻基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫中分別搜集了Os5h、Os7h基因在明恢63以及珍汕97兩個(gè)品種中8個(gè)對應(yīng)組織器官的表達(dá)情況。所取組織器官分別為繼代愈傷、胚芽，成熟期的莖、葉、根、花、3-5cm長幼穗、15-20cm長幼穗。芯片結(jié)果顯示，Os5h基因在花中表達(dá)最高。胚芽中最低（圖4A）。芯片結(jié)果顯示。Os7h基因在根中表達(dá)相對其他組織較低，但整體表達(dá)相對比較均勻（圖4B）。

2.4 基因的共表達(dá)分析結(jié)果

在水稻寡核苷酸芯片數(shù)據(jù)庫中對Os5h（OsO3g02550）和Os7h（Os03g02560）基因進(jìn)行共表達(dá)分析。結(jié)果表明。多個(gè)表達(dá)蛋白（如LOCOs06g15700基因）、多種酶。還有過敏反應(yīng)（如LOCOs05g51420基因）、鎘誘導(dǎo)的蛋白（如LOCOs07g05040基因）與Os5h基因正向共表達(dá)（表1）。有1個(gè)葡萄糖-1-磷酸磷酸轉(zhuǎn)移酶的大亞基LOC_Os05g50380基因、葉綠索的前體與此基因負(fù)向共表達(dá)。多個(gè)表達(dá)蛋白、鋅指家族蛋白、多種酶蛋白與Os7h基因正向共表達(dá)，有2個(gè)抗病蛋白LOCOS01G15580基因和LOCOs07g17250基因與其負(fù)向共表達(dá)（表2）。

3 小結(jié)與討論

基因結(jié)構(gòu)分析顯示，Os5h和Os7h這兩個(gè)基因均含有保守F-box結(jié)構(gòu)域，屬于F-box基因家族，因此可能在泛素途徑中的SCF蛋白復(fù)合體中發(fā)揮作用?；蜣D(zhuǎn)錄表達(dá)分析結(jié)果顯示，這2個(gè)F-box基因?yàn)榻M成型表達(dá)，其中尤其在花器官中表達(dá)較高?？赡芸刂苹ǖ陌l(fā)育。啟動(dòng)子的分析預(yù)測顯示，它們的啟動(dòng)子中含有較多的光應(yīng)答元件。有研究報(bào)道，EID1和AFR這2個(gè)F-box蛋白參與phvyA介導(dǎo)的光信號傳導(dǎo)。已報(bào)道的水稻Hd1是水稻種第一個(gè)被克隆的數(shù)量性狀基因，其在短日照下促進(jìn)抽穗和在長日照下抑制抽穗。由于Hd1本身的轉(zhuǎn)錄并不受日照長短的影響，推測轉(zhuǎn)錄受其影響的基因的表達(dá)受光周期變化的控制。

同時(shí)，這2個(gè)基因的啟動(dòng)子序列均含有脫落酸應(yīng)答順式元件ABRE和各種非生物逆境誘導(dǎo)應(yīng)答元件，推測他們可能也在水稻非生物逆境和防御反應(yīng)中起一定作用。另外，OsSh基因還含有防御和脅迫應(yīng)答元件TC-richrepeats及低溫、熱脅迫元件HSE等逆境應(yīng)答所需的作用元件，Os7h基因還含有大量脫落酸應(yīng)答的順式元件ABRE及干旱、JA等逆境所需應(yīng)答元件，這些為進(jìn)一步功能鑒定提供了依據(jù)。

共表達(dá)分析結(jié)果顯示，多個(gè)表達(dá)蛋白、多種酶，還有過敏反應(yīng)、鎘誘導(dǎo)蛋白與OsSh基因正向共表達(dá)，有1個(gè)葡萄糖-1-磷酸磷酸轉(zhuǎn)移酶的大亞基、葉綠素前體與此基因負(fù)向共表達(dá)。多個(gè)表達(dá)蛋白、鋅指家族蛋白、多種酶蛋白與Os7h基因正向共表達(dá)，有2個(gè)抗病蛋白與其負(fù)向共表達(dá)。這個(gè)結(jié)果也印證了F-box蛋白在植物體內(nèi)的作用相當(dāng)廣泛，與其組成型表達(dá)的特征關(guān)系密切。