崔一喆　王秋菊,2*　蘇　景　李　悅　周亞強(qiáng)　陳　玲

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，大慶163319；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，

哈爾濱150030；3.黑龍江省動物疫病預(yù)防與控制中心，哈爾濱150069)

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早期斷奶對仔豬空腸和回腸興奮性氨基酸載體1表達(dá)的影響

崔一喆1王秋菊1,2*蘇景3李悅1周亞強(qiáng)1陳玲1

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，大慶163319；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，

哈爾濱150030；3.黑龍江省動物疫病預(yù)防與控制中心，哈爾濱150069)

摘要：本試驗旨在研究仔豬出生后10～20 d，早期斷奶仔豬小腸谷氨酸轉(zhuǎn)運載體基因表達(dá)情況與哺乳仔豬的差異。試驗分別從40頭不同母豬的仔豬中各選出體重相近，10日齡的“杜×長×大”三元雜交仔豬1頭，共40頭仔豬，隨機(jī)不配對分為2組，每組20頭仔豬，對照組(哺乳組)為哺乳仔豬，隨母豬喂養(yǎng)；試驗組(斷奶組)為斷奶仔豬，隔離斷奶飼養(yǎng)；試驗期10 d。飼養(yǎng)結(jié)束，每組隨機(jī)取12只仔豬，宰殺取空腸和回腸，測定谷氨酸轉(zhuǎn)運載體興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運載體1(EAAC1)蛋白質(zhì)表達(dá)情況和游離氨基酸含量。結(jié)果顯示，斷奶顯著降低了仔豬空腸和回腸EAAC1(57和73 ku)及其相關(guān)蛋白谷氨酸轉(zhuǎn)運聯(lián)合蛋白(GTRAP3-18)(50 ku)的蛋白質(zhì)和mRNA表達(dá)量(P<0.05)。斷奶提高了仔豬空腸游離谷氨酸和總氨基酸含量，卻降低了仔豬回腸游離谷氨酸和總氨基酸含量，差異顯著(P<0.05)。結(jié)果提示，早期斷奶降低EAAC1和GTRAP3-18的蛋白質(zhì)含量，這可能與早期斷奶仔豬遭受營養(yǎng)谷氨酸缺乏導(dǎo)致的腸道氨基酸吸收轉(zhuǎn)運障礙有關(guān)。

關(guān)鍵詞：仔豬；斷奶；谷氨酸轉(zhuǎn)運載體；EAAC1；小腸

谷氨酸(Glu)作為動物黏膜主要的能源物質(zhì)之一，是仔豬斷奶時的條件性必需氨基酸[1]，對仔豬生長發(fā)育及腸道黏膜生長和修復(fù)起關(guān)鍵作用。谷氨酸在腸道中不能被動吸收，必須依靠轉(zhuǎn)運載體進(jìn)行主動運輸。興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運體家族(excitatory amino acid transporters，EAATs)是鈉離子(Na+)依賴的高親和力的谷氨酸轉(zhuǎn)運載體[2]，對維持神經(jīng)系統(tǒng)中的谷氨酸平衡起重要作用。其中的興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運載體1(excitatory amino acid carrier 1，EAAC1)是EAATs家族中最重要的一個谷氨酸轉(zhuǎn)運載體，不僅因為EAAC1在神經(jīng)系統(tǒng)中轉(zhuǎn)運谷氨酸的速度是其他轉(zhuǎn)運載體轉(zhuǎn)運速度的近10倍[3]，而且EAAC1不是神經(jīng)系統(tǒng)特異的，也存在于一些非神經(jīng)組織中，如小腸等。EAAC1的表達(dá)受到谷氨酸轉(zhuǎn)運聯(lián)合蛋白(glutamate transporter associate protein 3-18，GTRAP3-18)的負(fù)調(diào)節(jié)作用。在人類的癌癥和癲癇病中發(fā)現(xiàn)，GTRAP3-18通過與EAAC1的C末端連接以抑制EAAC1對谷氨酸的轉(zhuǎn)運，造成神經(jīng)系統(tǒng)中谷氨酸中毒[4]。且GTRAP3-18僅與EAAC1結(jié)合并對其調(diào)節(jié)，與其他EAATs不發(fā)生作用[5]。EAAC1的表達(dá)受到GTRAP3-18表達(dá)量的調(diào)節(jié)。多數(shù)關(guān)于EAAC1的研究集中在神經(jīng)系統(tǒng)中，腸道中的研究較少。有研究顯示EAAC1基因缺失小鼠表現(xiàn)出年齡依賴性黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的損失和氧化應(yīng)激的增加[6]，且在阿爾茨海默氏病患者海馬神經(jīng)元中發(fā)現(xiàn)異常EAAC1積聚[7]。Fu等[8]2012年首次克隆哺乳仔豬空腸EAAC1，并確定在哺乳仔豬空腸中，EAAC1的表達(dá)量是變化的，且低初生重的仔豬空腸中EAAC1的表達(dá)量很低。以上研究均說明EAAC1的表達(dá)量與機(jī)體非正常發(fā)育或所處的應(yīng)激及疾病狀態(tài)息息相關(guān)。低的EAAC1表達(dá)量將影響谷氨酸的轉(zhuǎn)運效率繼而影響仔豬小腸的黏膜發(fā)育和吸收功能[8]。斷奶是仔豬生理應(yīng)激過程，失去母源谷氨酸的攝取，小腸中EAAC1的表達(dá)變化是怎樣的尚不得知。因此，本試驗在前人研究的基礎(chǔ)上，以哺乳仔豬為對照，通過研究斷奶時仔豬回腸和空腸中EAAC1及其調(diào)節(jié)蛋白GTRAP3-18表達(dá)的變化，說明斷奶應(yīng)激對EAAC1表達(dá)的影響作用，為進(jìn)行仔豬斷奶時腸黏膜損傷修復(fù)機(jī)制研究和提高仔豬斷奶前后生長質(zhì)量提供理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗動物分組與飼養(yǎng)管理

試驗于2010年5月在黑龍江省齊齊哈爾市養(yǎng)豬示范基地進(jìn)行。分別從40頭不同母豬的仔豬中各選出平均體重為(4.48±0.26) kg、10日齡的“杜×長×大”三元雜交仔豬1頭，共40頭仔豬，采用單因素試驗設(shè)計，隨機(jī)分為2組，每組20個重復(fù)，每個重復(fù)1頭豬。飼養(yǎng)期10 d。

哺乳組仔豬在哺乳仔豬舍隨母豬繼續(xù)哺乳10 d；斷奶仔豬在保育仔豬舍飼養(yǎng)，飼喂玉米-豆粕型商業(yè)斷奶飼糧10 d，每日早、中、晚飼喂3次，自由飲水。基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

斷奶仔豬豬舍為封閉式，通風(fēng)良好，水泥地面；采用單欄隔離飼養(yǎng)，每欄1頭仔豬；欄內(nèi)一角上方距地面0.8 m處懸掛紅外取暖燈，燈下地面鋪一塊0.5 m×1.0 m的吸熱板，以保證仔豬溫暖。

1.2試驗樣品采集與處理

飼養(yǎng)試驗結(jié)束，第11日清晨，從各組中隨機(jī)選取12頭，共計24頭。打開仔豬腹腔，將空腸和回腸取出，立即用冰生理鹽水沖洗小腸內(nèi)部，并從每段腸的中間取樣，液氮冷凍保存[5]。冷凍后的腸段樣品，用研缽在液氮存在的條件下研磨成粉末狀，保存在-80 ℃。

1.3樣品制備

組織勻漿：稱取約1.3 g粉末狀的冷凍的小腸組織樣品，按照1 g樣品20 mL勻漿緩沖液的比例，用冷藏的含有蛋白酶抑制劑的勻漿緩沖液將樣品解凍，并用多層勻漿儀將樣品勻漿。勻漿時，每個樣品16 000 r/min勻漿3 min，且每隔1 min，停頓20 s。勻漿后的樣品，稱量并記錄勻漿液的總體積，取2 mL勻漿液樣品于-80 ℃超低溫冷凍保存。

表1　基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

預(yù)混料為每千克飼糧提供 Premix provided the following per kg of diet：Fe 180 mg，Zn 195 mg，Cu 76.8 mg，Mn 260.0 mg，Se 0.30 mg，I 0.5 mg，Co 0.3 mg，VA 13 500 IU，VD 11 250 IU，VE 15 mg，VK 33 mg，VB11.5 mg，VB24.5 mg，VB61.5 mg，VB120.018 mg，煙酸胺 niacin amine 18 mg，泛酸鈣 calcium pantothenate 9.6 mg，葉酸 folic acid 0.3mg，生物素 biotin 0.06 mg。

細(xì)胞內(nèi)質(zhì)：采用鎂離子(Mg2+)沉淀反應(yīng)和4 ℃差異離心的方法制備細(xì)胞內(nèi)質(zhì)樣品[5]。

細(xì)胞頂膜：將余下的細(xì)胞內(nèi)質(zhì)樣品繼續(xù)差異離心制備頂膜樣品。

1.4仔豬谷氨酸轉(zhuǎn)運載體表達(dá)的測定

1.4.1蛋白質(zhì)表達(dá)量的測定[6]

蛋白質(zhì)含量的測定：使用牛血清蛋白(級分Ⅳ)作為蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)，測定組織勻漿、細(xì)胞內(nèi)質(zhì)和頂膜樣品中蛋白質(zhì)的含量。

蛋白質(zhì)印跡法(Western-blot)測定：制得蛋白質(zhì)含量為1 μg/μL的樣品，以肌動蛋白(β-actin)為內(nèi)參對照進(jìn)行Western-blot。EAAC1一抗為羊抗人EAAC1多克隆抗體(Sc-7761，圣克魯斯生物國際有限公司)，1∶2 000稀釋；GTRAP3-18一抗為鼠抗人GTRAP3-18多克隆抗體(H00010550-A01，Abnova公司)，1∶2 000稀釋；β-actin一抗用鼠抗人單克隆抗體(Bio-rad公司)，1∶10 000稀釋；二抗均用兔抗人免疫球蛋白G(IgG)抗體(Bio-rad公司)，1∶10 000稀釋。

1.4.2基因表達(dá)量的測定

寡聚核苷酸引物的設(shè)計：采用Primer 5.0軟件對目的基因和持家基因的擴(kuò)增引物進(jìn)行設(shè)計，基因引物核酸序列參照GenBank cDNA序列(表2)，由Invitrogen公司合成。為避免擴(kuò)增物被非特異性的基因組DNA污染，所有仔豬樣品的mRNA序列都用Spidey軟件與對應(yīng)的豬基因序列擬合，并使所有引物含有2個外顯子區(qū)域。

表2　引物序列和產(chǎn)物大小

RNA的制備：通過TRIzol試劑(Invitrogen公司)提取組織樣品中的總RNA[6]，經(jīng)DNA酶(Invitrogen公司)處理后，用iScript cDNA合成試劑盒，根據(jù)試劑盒的說明，合成cDNA。

實時熒光定量(RT)-PCR檢測：采用25 μL反應(yīng)體系，體系組成參見iQ SYBR Green Supermix RT-PCR試劑盒(Qiagen有限公司)說明書。

RT-PCR的操作程序為：反轉(zhuǎn)錄程序(50 ℃，30 min)；蛋白變性程序(95 ℃，15 min)；擴(kuò)增和量化程序，重復(fù)45個循環(huán)(95 ℃變性15 s，54 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s)；熔解曲線程序(60～99 ℃，以0.1 ℃/s的速度加熱，且進(jìn)行熒光測量)。

數(shù)據(jù)計算：目的基因與持家基因相對表達(dá)量比值的計算公式如下。

R=2-Ct(目的基因-持家基因)。

式中：R表示目的基因的相對表達(dá)比值，Ct表示閾值的循環(huán)數(shù)。

在這個循環(huán)數(shù)下，目的基因和持家基因都被擴(kuò)增了30個熒光單位以上。最佳的RT-PCR效率是根據(jù)公式10(-1/斜率)使得RNA連續(xù)的稀釋擴(kuò)增得到的，且該值在目的基因和β-actin上數(shù)值是一致的。

1.5仔豬小腸組織中游離氨基酸含量的測定

采用高效液相色譜儀(帶二元溶劑洗脫體系和自動進(jìn)樣器)、數(shù)據(jù)工作站、熒光檢測器、分析柱(高效C18)進(jìn)行測定。

1.6數(shù)據(jù)計算與統(tǒng)計分析

本試驗中蛋白質(zhì)水平的表達(dá)量實際為目的蛋白的相對表達(dá)量。經(jīng)Western blot分析得到的蛋白印跡，通過Quantity One軟件(Bio-Rad)進(jìn)行印跡掃描，將印跡換算成密度值，用目的蛋白/β-actin印跡密度的比值作為目的蛋白的相對含量進(jìn)行計算。

采用SAS 9.0軟件中單因素方差分析(one-way ANOVA)進(jìn)行分析。試驗數(shù)據(jù)以平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤或混合平均標(biāo)準(zhǔn)誤表示。P<0.05視為差異顯著。結(jié)果采用Fig.P曲線擬合軟件繪制柱狀圖和曲線圖。

2結(jié)果與分析

2.1斷奶對仔豬生長性能的影響

由表3可見，在10 d的飼養(yǎng)試驗期間，斷奶組仔豬的平均日采食量為(148.50±16.90) g/d，料重比為3.58±2.34，與哺乳組仔豬相比，斷奶組仔豬的末重顯著降低(P<0.05)，同時斷奶組仔豬的平均日增重極顯著降低(P<0.01)。早期斷奶對仔豬的生長性能具有顯著的影響。

表3　斷奶對仔豬生長性能的影響

*表示與哺乳組相比差異顯著(P<0.05)，**表示與哺乳組相比差異極顯著(P<0.01)。下表同。

* means significant difference compared with the suckling group (P<0.05), ** means significant difference compared with the suckling group (P<0.01). The same as below.

2.2早期斷奶對仔豬小腸EAAC1蛋白質(zhì)及mRNA表達(dá)量的影響

2.2.1早期斷奶對仔豬小腸EAAC1蛋白質(zhì)表達(dá)量的影響

采用Western blot分析方法，成功地從仔豬小腸組織勻漿、細(xì)胞內(nèi)質(zhì)和細(xì)胞頂膜中檢測到EAAC1蛋白質(zhì)，并分析其含量，結(jié)果檢測到EAAC1蛋白質(zhì)在小腸組織勻漿和細(xì)胞內(nèi)質(zhì)中的分子質(zhì)量為57 ku；EAAC1蛋白質(zhì)在小腸細(xì)胞頂膜中的分子質(zhì)量為73 ku。以β-actin為參照量，與哺乳仔豬相比較，斷奶仔豬空腸組織勻漿、細(xì)胞內(nèi)質(zhì)和細(xì)胞頂膜中EAAC1蛋白質(zhì)含量較哺乳仔豬分別降低了25%、21%和9%，差異顯著(P<0.05)，如圖1所示。與哺乳組仔豬相比較，斷奶組仔豬回腸組織勻漿、細(xì)胞內(nèi)質(zhì)和細(xì)胞頂膜中EAAC1蛋白質(zhì)含量分別降低了32%、22%和14%，差異顯著(P<0.05)，如圖2所示。本結(jié)果顯示，EAAC1蛋白質(zhì)在仔豬小腸組織中存在，且受早期斷奶的影響，含量降低。

2.2.2早期斷奶對仔豬小腸EAAC1 mRNA表達(dá)量的影響

斷奶與哺乳仔豬小腸組織中EAAC1 mRNA表達(dá)量分析結(jié)果如表4所示。以β-actin為參照量，與哺乳組仔豬相比較，斷奶組仔豬空腸中EAAC1 mRNA表達(dá)量降低了88%，差異顯著(P<0.05)；斷奶組仔豬回腸中EAAC1 mRNA表達(dá)量降低了73%，差異顯著(P<0.05)。

Homogenate 組織勻漿，Intracellular 細(xì)胞內(nèi)質(zhì)，Apical menbrane 細(xì)胞頂膜，Suckling group哺乳組，Weaning group斷奶組。下圖同 The same as below。

*表示與哺乳組相比差異顯著(P<0.05)。下圖同。

* means significant difference compared with the suckling group (P<0.05). The same as below.

圖1仔豬空腸中EAAC1蛋白質(zhì)表達(dá)量

Fig.1EAAC1 protein abundance in jejunum of piglets

圖2　仔豬回腸中EAAC1蛋白質(zhì)表達(dá)量

Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，斷奶組與哺乳組仔豬空腸組織勻漿(r=0.52，P=0.042，n=24)，細(xì)胞內(nèi)質(zhì)(r=0.56，P=0.021，n=24)和細(xì)胞頂膜(r=0.49，P=0.008，n=24)中EAAC1蛋白質(zhì)含量與空腸組織中EAAC1 mRNA表達(dá)量之間呈正向線性關(guān)系(P<0.05)；且空腸組織勻漿EAAC1蛋白質(zhì)與細(xì)胞內(nèi)質(zhì)EAAC1蛋白質(zhì)及細(xì)胞內(nèi)質(zhì)EAAC1蛋白質(zhì)與細(xì)胞頂膜EAAC1蛋白質(zhì)之間的變化均呈正向線性關(guān)系，且差異顯著(P<0.05)。斷奶組仔豬與哺乳組仔豬的回腸組織勻漿(r=0.51，P=0.021，n=24)、細(xì)胞內(nèi)質(zhì)(r=0.51，P=0.016，n=24)、細(xì)胞頂膜(r=0.41，P=0.016，n=24)中EAAC1蛋白質(zhì)含量與回腸組織中EAAC1 mRNA表達(dá)量之間呈正向線性關(guān)系(P<0.05)。且回腸組織勻漿EAAC1蛋白質(zhì)與細(xì)胞內(nèi)質(zhì)EAAC1蛋白質(zhì)及細(xì)胞內(nèi)質(zhì)EAAC1蛋白質(zhì)與細(xì)胞頂膜EAAC1蛋白質(zhì)之間的變化均成正向線性關(guān)系，且差異顯著(P<0.05)。

表4　仔豬小腸中EAAC1 mRNA水平

2.3早期斷奶對仔豬小腸GTRAP3-18蛋白質(zhì)及mRNA表達(dá)量的影響

2.3.1早期斷奶對仔豬小腸GTRAP3-18蛋白質(zhì)表達(dá)量的影響

在空腸和回腸組織勻漿、細(xì)胞內(nèi)質(zhì)和細(xì)胞頂膜中檢測到分子質(zhì)量為50 ku的GTRAP3-18蛋白質(zhì)，如圖4和圖5所示。以β-actin為參照量，與哺乳組仔豬相比較，斷奶仔豬空腸組織勻漿、細(xì)胞內(nèi)質(zhì)和細(xì)胞頂膜中GTRAP3-18蛋白質(zhì)含量分別降低了15%、28%和55%，差異顯著(P<0.05)；與哺乳組仔豬相比較，斷奶組仔豬回腸組織勻漿、細(xì)胞內(nèi)質(zhì)和細(xì)胞頂膜中GTRAP3-18蛋白質(zhì)含量分別降低了16%、7%和27%，差異顯著(P<0.05)。

2.3.2早期斷奶對仔豬小腸GTRAP3-18 mRNA表達(dá)量的影響

斷奶與哺乳仔豬小腸組織中GTRAP3-18 mRNA表達(dá)量分析結(jié)果如表5所示。以β-actin為參照量，與哺乳組仔豬相比較，斷奶組仔豬空腸中GTRAP3-18 mRNA表達(dá)量降低了70%，差異顯著(P<0.05)；回腸中GTRAP3-18 mRNA表達(dá)量降低了52%，差異顯著(P<0.05)。

圖3　仔豬空腸中GTRAP3-18的蛋白質(zhì)表達(dá)量

圖4　仔豬回腸中GTRAP3-18蛋白質(zhì)表達(dá)量

Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，斷奶組仔豬和哺乳組仔豬空腸組織勻漿(r=0.33，P=0.027，n=24)、細(xì)胞內(nèi)質(zhì)(r=0.54，P=0.019，n=24)、細(xì)胞頂膜(r=0.56，P=0.028，n=24)的GTRAP3-18蛋白質(zhì)表達(dá)量與空腸中GTRAP3-18 mRNA表達(dá)量之間呈正向線性關(guān)系(P<0.05)；且空腸組織勻漿GTRAP3-18蛋白質(zhì)與細(xì)胞內(nèi)質(zhì)和細(xì)胞頂膜GTRAP3-18蛋白質(zhì)及細(xì)胞內(nèi)質(zhì)GTRAP3-18蛋白質(zhì)與細(xì)胞頂膜GTRAP3-18蛋白質(zhì)表達(dá)量之間均呈正向線性關(guān)系，且差異顯著(P<0.05)?；啬c組織勻漿(r=0.42，P=0.014，n=24)、細(xì)胞內(nèi)質(zhì)(r=0.42，P=0.047，n=24)、細(xì)胞頂膜(r=0.15，P=0.029，n=24)GTRAP3-18蛋白質(zhì)表達(dá)量與回腸中GTRAP3-18 mRNA表達(dá)量之間呈正向線性關(guān)系(P<0.05)。且回腸組織勻漿GTRAP3-18蛋白質(zhì)與細(xì)胞內(nèi)質(zhì)和細(xì)胞頂膜GTRAP3-18蛋白質(zhì)及細(xì)胞內(nèi)質(zhì)GTRAP3-18蛋白質(zhì)與細(xì)胞頂膜GTRAP3-18蛋白質(zhì)表達(dá)量之間均成正向線性關(guān)系，且差異顯著(P<0.05)。

表5　仔豬小腸中GTRAP3-18 mRNA表達(dá)量

2.4早期斷奶對仔豬游離氨基酸含量的影響

2.4.1早期斷奶對仔豬空腸中游離氨基酸含量的影響

與哺乳組仔豬相比較，作為EAAC1蛋白質(zhì)的底物氨基酸，斷奶組仔豬空腸中谷氨酸含量提高了26%，差異顯著(P<0.05)；作為抗系統(tǒng)ASC氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白2(ASCT2)蛋白質(zhì)的底物氨基酸，谷氨酰胺含量沒有顯著變化(P>0.05)，其他游離氨基酸，蘇氨酸、甘氨酸和鳥氨酸含量分別提高了57%、88%和53%，差異顯著(P<0.05)(圖5)。

2.4.2早期斷奶對仔豬回腸中游離氨基酸含量的影響

與哺乳組仔豬相比較，斷奶組仔豬回腸中游離氨基酸含量的變化趨勢與空腸中游離氨基酸含量的變化趨勢相反。作為EAAC1轉(zhuǎn)運蛋白的底物氨基酸，與哺乳組仔豬相比，谷氨酸降低了43%，差異顯著(P<0.05)；ASCT2轉(zhuǎn)運蛋白的底物氨基酸谷氨酰胺降低了52%，顯著低于哺乳組(P<0.05)；其他氨基酸，賴氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、精氨酸、?；撬岷屠野彼岷慷冀档土?2%以上，差異顯著(P<0.05)(圖6)。

●：哺乳組；○：斷奶組。下圖同。

●: suckling group; ○: weaning group. The same as below.

圖5斷奶對仔豬空腸中游離氨基酸含量的影響

Fig.5Effects of weaning on free amino acids

content in jejunum of piglets

圖6　斷奶對仔豬回腸中游離氨基酸含量的影響

3討論

仔豬斷奶誘發(fā)了復(fù)雜的形態(tài)和功能變化，涉及營養(yǎng)、消化代謝[9]、應(yīng)激、神經(jīng)內(nèi)分泌[10]、基因功能等。斷奶后日增重是仔豬生長的一個重要表觀指標(biāo)，與哺乳仔豬相比，若未受到斷奶影響，則說明飼糧營養(yǎng)供給足夠仔豬需要，仔豬適應(yīng)從母乳到飼料的變化，并且腸道發(fā)育也適應(yīng)飼料采食。但在實際生產(chǎn)中，斷奶時有10%的仔豬死于這種生理應(yīng)激，一方面離開母豬的外環(huán)境應(yīng)激，另一方面就是從母乳到飼料對腸道內(nèi)環(huán)境和黏膜發(fā)育的應(yīng)激。斷奶應(yīng)激不僅引起胃腸道功能的改變，而且還會影響到腦-腸軸功能的調(diào)節(jié)[11]。仔豬在斷奶過程中，由于營養(yǎng)條件和環(huán)境的改變，引起仔豬的采食量下降。因此與正常哺乳的幼畜相比，由于仔豬胃腸道未發(fā)育成熟，斷奶會導(dǎo)致仔豬生長性能降低。在本研究中，早期斷奶仔豬顯示出明顯的斷奶應(yīng)激癥狀，斷奶仔豬的平均日采食量為148.5 g，明顯低于NRC(1998)飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)中240 g/d的平均日采食量，斷奶仔豬的平均日增重顯著低于同期哺乳組仔豬。Gu等[12]研究表明仔豬在斷奶時，斷奶應(yīng)激引起腸道結(jié)構(gòu)和功能的巨大變化，直接影響著仔豬腸道的消化與吸收功能，進(jìn)而影響仔豬的生長發(fā)育。

EAAC1是最主要的谷氨酸轉(zhuǎn)運載體，它廣泛地分布于整個細(xì)胞體。目前為止，很多的研究都集中EAAC1在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的谷氨酸轉(zhuǎn)運上，很少有EAAC1在仔豬小腸黏膜表達(dá)的研究報道。本試驗通過研究早期斷奶仔豬腸道組織EAAC1蛋白質(zhì)表達(dá)量及其mRNA水平的變化，揭示斷奶對谷氨酸轉(zhuǎn)運的影響。試驗結(jié)果顯示，早期斷奶顯著降低了仔豬小腸EAAC1蛋白質(zhì)和mRNA表達(dá)量。Watabe等[13]用HEK293細(xì)胞為模式研究并證明， GTRAP3-18反向調(diào)節(jié)EAAC1的活性和細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽的含量，并順次影響對氧化應(yīng)激的易感性。分化、熱應(yīng)激和氧化應(yīng)激都會提高人體內(nèi)GTRAP3-18蛋白質(zhì)的分離[12]，即GTRAP3-18蛋白質(zhì)或mRNA表達(dá)量在遇到氧化應(yīng)激時都應(yīng)該升高，而不是降低。本試驗結(jié)果顯示，早期斷奶降低了GTRAP3-18在仔豬空腸和回腸組織中的蛋白質(zhì)及其mRNA表達(dá)量，也就是說，斷奶應(yīng)激在仔豬腸道組織中表現(xiàn)的反應(yīng)結(jié)果與熱應(yīng)激等氧化應(yīng)激不一致。斷奶仔豬遭受生理應(yīng)激，需要從飼糧中攝取更多的保護(hù)腸黏膜的谷氨酸。有研究顯示，谷氨酸攝取效率提高時會引起GTRAP3-18蛋白質(zhì)表達(dá)量的降低[14]。本試驗結(jié)果顯示，斷奶仔豬空腸中谷氨酸濃度升高，同時伴隨斷奶仔豬空腸GTRAP3-18蛋白質(zhì)表達(dá)量降低，與Lin等[14]的研究結(jié)論一致；然而斷奶仔豬回腸中谷氨酸含量卻降低，GTRAP3-18表達(dá)量也降低，關(guān)于GTRAP3-18在應(yīng)激或疾病中起的具體作用及機(jī)制還不明確，有待進(jìn)一步研究[5]。

谷氨酸為興奮性氨基酸，可被EAAC1轉(zhuǎn)運。本試驗結(jié)果顯示，早期斷奶仔豬回腸組織中游離谷氨酸含量明顯降低，與此相反，游離谷氨酸含量在空腸組織中卻明顯增加。有研究顯示，EAAC1在小腸中的表達(dá)主要是在空腸中[15]，而且小腸中谷氨酸跨膜轉(zhuǎn)運的效率和能力由EAAC1表達(dá)的變化進(jìn)行調(diào)控[16]。因此我們推測，斷奶仔豬空腸組織中大量的EAAC1轉(zhuǎn)運游離谷氨酸，以提高機(jī)體對谷氨酸的攝取量，與此同時EAAC1被消耗，表達(dá)量降低；而回腸組織中EAAC1表達(dá)量少，對谷氨酸轉(zhuǎn)運效率相對低，因此與哺乳仔豬相比，斷奶仔豬回腸中游離谷氨酸降低。當(dāng)然谷氨酸含量的變化不僅與其轉(zhuǎn)運相關(guān)，同時還受到谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán)的影響。

4結(jié)論

總的來說，受到早期斷奶應(yīng)激，仔豬空腸組織膜上EAAC1表達(dá)量降低，消耗的EAAC1提高了對斷奶仔豬空腸中谷氨酸的轉(zhuǎn)運，提高了空腸中谷氨酸等游離氨基酸的含量，并伴隨了EAAC1調(diào)節(jié)蛋白GTRAP3-18表達(dá)量的降低；而斷奶仔豬回腸組織膜上EAAC1表達(dá)量降低的同時，其對谷氨酸轉(zhuǎn)運的效率和能力也降低，導(dǎo)致回腸谷氨酸等游離氨基酸含量下降。

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(責(zé)任編輯武海龍)

Effects of Early Weaning on Jenunal and Ileal Excitary Amino Acid Aarrier 1 Expression of Piglets

CUI Yizhe1WANG Qiuju1,2*SU Jing3LI Yue1ZHOU Yaqiang1CHEN Ling1

(1. College of Animal Science and Veterinary, Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing 163319, China;2. College of Veterinary Medicine, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China;3. Heilongjiang Province Animal Epidemic Prevention and Control Center, Harbin 150069, China)

Abstract:This study was conducted to examine the effects of early weaning on adaptive changes in glutamate transporter gene expression in comparison with the suckling counterpart in the pig during the ages of 10 to 20 days. A total of 40 ternary hybrid piglets, with a similar body weight randomly taken from 40 different sows at 10 days of age, were divided into 2 groups. The trial group were 20 suckling piglets randomly obtained from 20 different sow litters, were allowed to continue suckling with their sows as the suckling group for 10 days; the 20 piglets of the weaning group were taken from another 20 different sow litters, moved off-site and weaned on a weaning diet for 10 days according to standard swine industry early weaning practices. At the end of the trial, 12 piglets were randomly taken from each group to remove the jejunum and ileum, and gene expression of excitatory amino acid carrier 1 (EAAC1) and free amino acids content were determined. The results showed that weaning significantly decreased the abundance of the EAAC1 (57 and 73 ku) and glutamate transporter associate protein 3-18 (GTRAP3-18) (50 ku) protein and mRNA expression in jejunum and ileum of piglets (P<0.05). Weaning significantly increased the contents of glutamate and total free amino acids (P<0.05), while the contents of glutamate and total free amino acids in ileum were significantly decreased (P<0.05). In conclusion, early weaning decrease jejunal and ileal EAAC1 and GTRAP3-18 protein expression and this may, in part, is related to early weaned piglets suffered from lack of nutrition leading to intestinal glutamate uptake disorder.[Chinese Journal of Animal Nutrition, 2016, 28(2)：555-563]

Key words:piglet; weaning; glutamate transporter; EAAC1; small intestine

*Corresponding author, associate professor, E-mail： wqj_9@163.com

中圖分類號：S828

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1006-267X(2016)02-0555-09

作者簡介：崔一喆(1979—)，男，黑龍江雞西人，博士，研究方向為動物腸道疾病及營養(yǎng)調(diào)控。E-mail： cuiyizhe1979@126.com*通信作者：王秋菊，副教授，E-mail： wqj_9@163.com

基金項目：黑龍江省自然科學(xué)基金項目(C201444，C2015040)；黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)校內(nèi)課題資助(XZR2014-05)；中國博士后科學(xué)基金項目(2013M531011)

收稿日期：2015-09-01

doi：10.3969/j.issn.1006-267x.2016.02.030