張夏青　許建和,2　潘　茜　易樂飛　彭永興　申　欣

閻斌倫1,2　高　煥1,2　王雯祥1　程漢良1,2*

(1.淮海工學院，連云港222005；2.江蘇省海洋生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，

連云港222005；3.浙江省淡水水產(chǎn)研究所，湖州313001)

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半滑舌鰨乙酰輔酶A羧化酶α基因全長cDNA分子克隆及飼料脂肪水平對其在肝臟中表達的影響

張夏青1許建和1,2潘茜3易樂飛1彭永興1申欣1

閻斌倫1,2高煥1,2王雯祥1程漢良1,2*

(1.淮海工學院，連云港222005；2.江蘇省海洋生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，

連云港222005；3.浙江省淡水水產(chǎn)研究所，湖州313001)

摘要：本試驗采用反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)和cDNA末端快速擴增(RACE)技術(shù)從半滑舌鰨肝臟中克隆了乙酰輔酶A羧化酶α(ACC1)基因全長cDNA，并采用實時熒光定量PCR方法對半滑舌鰨ACC1基因在腸道、肝臟、肌肉、卵巢、脾臟、全腦、腎臟、心臟、腸系膜脂肪等組織中的表達進行了研究；此外，還研究了飼料脂肪水平對半滑舌鰨肝臟中ACC1基因表達的影響。結(jié)果表明：1)半滑舌鰨ACC1基因cDNA全長7 811 bp，含1個7 074 bp的開放閱讀框，編碼2 357個氨基酸，ACC1蛋白計算分子質(zhì)量為266 ku，等電點為6.42。半滑舌鰨ACC1氨基酸序列保守位點包括1個ATP結(jié)合位點(Gly(316)～Gly(321))、1個生物素結(jié)合位點(Val(785)-Met(786)-Lys(787)-Met(788))、1個輔酶A結(jié)合位點(Ser(1969)～Val(1995))。此外，半滑舌鰨ACC1基因存在可變剪接，形成另外2個同工型(isoforms)，與分子質(zhì)量為266 ku的ACC1相比，分別少8和15個氨基酸。2)半滑舌鰨所有組織中均檢測到ACC1基因的表達，肝臟和全腦中ACC1 mRNA相對表達量顯著高于其他組織(P<0.05)，分別為2.67和2.53；腸道、腸系膜脂肪和卵巢中次之，分別為1.14、1.10和0.97；腎臟中最低，僅為0.48。3)與對照組(未添加魚油組)相比，3.5%魚油組肝臟中ACC1 mRNA相對表達量顯著降低(P<0.05)；7.0%和10.0%魚油組肝臟中ACC1 mRNA相對表達量進一步降低，顯著低于3.5%組和對照組(P<0.05)，同時10.0%魚油組低于7.0%魚油組(P>0.05)。綜上，本試驗克隆出了半滑舌鰨ACC1基因的全長cDNA，并得出半滑舌鰨ACC1蛋白的主要功能位點為ATP結(jié)合位點、生物素結(jié)合位點、輔酶A結(jié)合位點，與其他脊椎動物相比基本保守。半滑舌鰨ACC1基因主要在肝臟和全腦等生脂組織中表達，飼料中添加魚油顯著抑制其肝臟中ACC1基因的表達，且抑制作用與魚油添加量呈正相關(guān)。

關(guān)鍵詞：半滑舌鰨；乙酰輔酶A羧化酶α；分子克隆；營養(yǎng)調(diào)控；組織表達

乙酰輔酶A羧化酶(ACC，EC 6.4.1.2)催化乙酰輔酶A生成丙二酸單酰輔酶A，是脂肪酸從頭合成的限速酶[1-2]。原核生物ACC由3個基因編碼的亞基組成，它們分別是生物素羧化酶(BC)、生物素羧基載體蛋白(BCCP)和羧基轉(zhuǎn)移酶(CT)[3]。真核生物ACC由1個基因編碼，并具有上述3個結(jié)構(gòu)域。哺乳動物ACC有α和β 2種類型，它們具有不同的組織分布和功能。ACC-α通常稱為ACACA或ACC1，主要在脂肪生成組織如肝臟中表達，催化長鏈脂肪酸的從頭合成[4-6]。ACC-β通常稱為ACACB或ACC2，是線粒體酶，主要在心臟和肌肉中表達，其產(chǎn)物丙二酰輔酶A通過抑制長鏈脂酰輔酶A從胞液向線粒體的轉(zhuǎn)運而調(diào)控脂肪酸氧化[7-8]。在恒溫動物中，已克隆出鼠[4]、雞[5]、人[6]、牛[9]、綿羊[10]和山羊[11]ACC1基因的全長cDNA。人的ACC1基因含有1個7 041 bp的開放閱讀框，編碼2 346個氨基酸，ACC1蛋白分子質(zhì)量255.5 ku；ACC2蛋白分子質(zhì)量為280 ku。這2類ACC都由獨立的基因進行編碼，ACC1基因在染色體17q12上，ACC2基因在染色體12q23上，兩者的總氨基酸序列的相似性達到76%，兩者的差別是在N端，ACC2比ACC1多大約140個氨基酸，而ACC2就是通過這些多出的氨基酸序列錨定在線粒體的外膜上。關(guān)于魚類ACC基因的研究較少，已克隆出草魚ACC1基因全長cDNA序列，該基因主要在草魚肝臟和脂肪組織中表達[12]。

半滑舌鰨是我國重要的海水養(yǎng)殖魚類，但近年來其脂肪代謝相關(guān)疾病逐年增加，影響商品魚肉質(zhì)和成活率。本研究的目的是克隆半滑舌鰨ACC1基因全長cDNA，分析其組織表達，并研究飼料中不同脂肪水平對其表達的影響，探討該基因在脂肪代謝中的作用，為魚類脂肪代謝營養(yǎng)調(diào)控研究提供基礎(chǔ)資料和理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1半滑舌鰨ACC1基因全長cDNA分子克隆

1.1.1試驗用魚

試驗用半滑舌鰨購自江蘇省贛榆現(xiàn)代漁業(yè)示范園區(qū)，個體濕重750～1 000 g，在淮海工學院海洋學院240 L水族箱中飼養(yǎng)2周，水溫20～23 ℃。

1.1.2試驗引物

本試驗所用引物見表1。各引物在ACC1 cDNA上的位置見圖1。

續(xù)表1引物名稱Primernames序列Sequence(5'→3')用途Use預期產(chǎn)物大小Expectedproductsize/bpRace3-RCTAGAGGTACCGGATCCTT與ACC3-F2合用ACC3-F1AGGTTCTGGGATGATAGCA與AP合用3'RACE第1輪ACC3-F2CCCAGTGCCCATCCTTAT與Race3-R合用3'RACE巢式PCR1520ACC5-RGCTCCACATTAGCGTAGTTG5'RACE反轉(zhuǎn)錄合成第1鏈ACC5-R1GCTCCACATTAGCGTAGTTG與Oligo(dT)16AP合用5'RACE第1輪ACC5-R2ACGAATCGCCCTTTCATT與AP合用5'RACE巢式PCR650實時熒光定量PCR引物RT-qPCRprimersqACC-FqACC-RGGTGGAGTGTTGGAGCCTGAAGTGGTGGTAGATGGACAGCAGAAACACC1實時熒光定量PCR200qRPL13A-FqRPL13A-RCAATAAGGTTCTGCTGCTGGATGGCTGGGTGCTCTGAAGTGGTAAGG內(nèi)參基因核糖體蛋白L13A(ribosomalproteinL13a,RPL13A)實時熒光定量PCR222qRPL4-FqRPL4-RCATAGCGAGTGGAGCGTGGTTCGGGCTGGCGGCTGTTCTTG內(nèi)參基因核糖體蛋白L4(ribosomalproteinL4,RPL4)實時熒光定量PCR203qPPIase-FqPPIase-RTCCACCGTCTCTGTTCTGTCTGCTTGTAGCCAAAGCCCTTCTCAC內(nèi)參基因肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶A(peptidyl-prolylcis-transisomeraseA,PPIase)實時熒光定量PCR176qB2M-FqB2M-RTCCTCGTCTCTTCTGTGATCTTCCCCCAACCTTCTGTTCGCATCTAC內(nèi)參基因β2微球蛋白(beta-2microglobulin,B2M)熒光定量PCR140

圖1　各引物在ACC1 cDNA上的位置

1.1.3肝臟總RNA提取

半滑舌鰨活體解剖，快速分離肝臟，液氮研磨，使用QIAGEN公司的RNeasy Lipid Tissue Mini Kit試劑盒，按推薦方法提取肝臟總RNA。1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量，核酸定量儀(Gene Quant)檢測RNA的濃度后-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.4用于核心序列擴增的第1鏈cDNA反轉(zhuǎn)錄

采用QIAGEN的QuantiTect Reverse Transcription Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒，以O(shè)ligo(dT)16AP為引物，按推薦方法去除DNA污染并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈，稀釋10倍備用。

1.1.5核心序列擴增

根據(jù)斑馬魚(XM_001919780)ACC1基因序列，設(shè)計5對簡并引物(表1和圖1)，PCR擴增ACC1基因5段核心序列，25 μL反應體系含：TaKaRa公司的EmeraldAmp PCR Master Mix 12.5 μL，cDNA第1鏈1 μL，上、下游引物各0.5 μL，ddH2O 10.5 μL。擴增條件為：94 ℃變性40 s、52 ℃退火40 s、72 ℃延伸60 s，共35個循環(huán)；反應前95 ℃預變性5 min；反應后72 ℃充分延伸7 min。1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，切膠回收，克隆測序。

1.1.6半滑舌鰨ACC1基因3′cDNA末端快速擴增(RACE)

根據(jù)ACC1基因核心序列設(shè)計3′RACE特異引物(表1)。以cDNA第1鏈為模版，ACC3-F1和AP為引物進行第1輪PCR擴增，將第1輪的PCR產(chǎn)物稀釋10倍為模板，以ACC3-F2和Race3-R為引物進行第2輪擴增。3′RACE的反應體系和反應條件同核心序列，1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，切取目的條帶并回收，克隆測序。

1.1.7半滑舌鰨ACC1基因5′RACE

參考Dieffenbach等[13]的方法快速擴增ACC1基因5′末端，5′RACE擴增使用的引物見表1。首先，以ACC5-R為引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈；然后，用RNase H分解cDNA-RNA雜交體中的RNA，乙醇沉淀；再用末端脫氧核苷轉(zhuǎn)移酶在5′末端加poly(A)尾，20 μL反應體系如下：在有沉淀的原管中加入5×Buffer 4 μL，dATP(100 mmol/L)1 μL，末端脫氧核苷轉(zhuǎn)移酶(20 U/μL)1.5 μL，加ddH2O至20 μL。反應條件為：37 ℃溫育30 min，70 ℃滅活10 min，用TE緩沖液稀釋10倍后備用；最后，以O(shè)ligo(dT)16AP和ACC5-R1為引物進行第1輪PCR擴增，產(chǎn)物稀釋10倍，用Race3-R與ACC5-R2進行第2輪PCR擴增，PCR反應體系和條件同核心序列。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，切取目的條帶并回收，克隆測序。

1.1.8序列分析

用DNAstar 7.1軟件包中的SeqMan對核心序列以及3′和5′末端序列進行組裝，得到ACC1基因全長cDNA序列。用EditSeq對序列進行編輯和分析，尋找開放閱讀框，并翻譯成氨基酸序列。通過http://www.cbs.dtu.dk/services/預測糖基化位點、磷酸化位點；通過http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/預測信號肽；通過http://www.ebi.ac.uk/interpro/和http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/預測跨膜結(jié)構(gòu)域。使用MEGA 6.0采用鄰接(neighbor joining，NJ)法構(gòu)建基于ACC1氨基酸序列的分子系統(tǒng)發(fā)育樹[14]。

1.2半滑舌鰨ACC1基因?qū)崟r熒光定量PCR

采用SYBR Green實時熒光定量PCR方法，對ACC1基因表達進行定量研究。

1.2.1內(nèi)參基因的克隆與定量引物設(shè)計

內(nèi)參基因β2微球蛋白(beta-2 microglobulin，B2M)和核糖體蛋白L13A(ribosomal protein L13a，RPL13A)從GenBank中獲得，登錄號分別為FJ965562和GH232293；核糖體蛋白L4(ribosomal protein L4，RPL4)和肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶A(peptidyl-prolylcis-transisomerase A，PPIase)采用電子克隆方法獲得。內(nèi)參基因引物見表1。

1.2.2定量PCR檢測體系

實時熒光定量PCR反應在StepOnePlus PCR儀(ABI)上進行。采用QIAGEN的QuantiFast SYBR Green PCR Kit定量試劑盒，20 μL的反應體系中包含2×PCR Master Mix 10 μL，25 mmol/L的上、下游引物各0.8 μL和10倍稀釋后的cDNA第1鏈1 μL，ddH2O 7.4 μL。采用2步PCR法進行擴增，首先95 ℃預變性5 min，然后是40個循環(huán)，每個循環(huán)包括95 ℃變性10 s和60 ℃延伸30 s，循環(huán)結(jié)束后，從60 ℃緩慢升溫到95 ℃，制備熔解曲線。每次反應都設(shè)置無模板對照，每個樣品設(shè)3個技術(shù)重復。

1.2.3半滑舌鰨ACC1基因的組織表達

取3尾喂食后6 h的半滑舌鰨活體解剖，快速分離腸道、肝臟、肌肉、卵巢、脾臟、全腦、腎臟、心臟、腸系膜脂肪等組織，分別提取總RNA。采用QIAGEN的QuantiTect Reverse Transcription Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒，以Primer Mix為引物，按試劑盒推薦方法去除DNA污染并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈，稀釋10倍用于熒光定量分析，經(jīng)篩選確定RPL13A、RPL4、PPIase為組織表達的3個內(nèi)參基因。

1.2.4飼料脂肪水平對半滑舌鰨肝臟中ACC1基因表達的影響

1.2.4.1試驗飼料

共配制4種試驗飼料，4種試驗飼料的魚油添加量分別為0(對照)、3.5%、7.0%和10.0%(表2)。制作飼料的魚粉、魚油、膽堿等主要原料由淮安通威飼料科技有限公司提供。根據(jù)配方，稱量所需要的各種原料，充分混勻10 min，加水后揉拌15 min，再利用便攜式絞肉機進行壓縮制粒。將制粒的飼料均勻灑在白瓷盤內(nèi)，放入干燥箱內(nèi)50 ℃烘10 h，室溫放置1 h，裝袋、編號、密封保存待用。

表2　試驗飼料組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1)預混料為每千克飼料提供The premix provided the following per kg of diets：VA 5 000 IU，VD 2 000 IU，VE 50 mg，VK 5 mg，VB18 mg，VB210 mg，VB68 mg，VB120.03 mg，泛酸 pantothenic acid 30 mg，煙酸 nicotinic acid 30 mg，生物素 biotin 0.4 mg，葉酸 folic acid 3 mg，VC 180 mg，肌醇 inositol 100 mg，Mg 300 mg，F(xiàn)e 170 mg，Cu 4 mg，Zn 150 mg，Mn 22 mg，I 1 mg，Se 0.4 mg，Co 0.25 mg。

2)計算值Calculated values。

1.2.4.2飼養(yǎng)管理

試驗在“單循環(huán)可控實驗生態(tài)水槽系統(tǒng)”(大連匯新鈦設(shè)備開發(fā)有限公司生產(chǎn))內(nèi)完成，每個水槽體積240 L。整套系統(tǒng)有獨立的水處理、溫度控制、充氣/增氧和紫外消毒等設(shè)備。試驗用魚購自江蘇省贛榆現(xiàn)代漁業(yè)示范園區(qū)，共240尾，規(guī)格為76.7～87.6 g/尾，隨機分為4組，每組3個重復(水槽)，每個重復20尾，養(yǎng)殖周期12周，養(yǎng)殖水溫20～23 ℃。日投飼2次，投飼量隨各水槽內(nèi)半滑舌鰨的攝食情況及時調(diào)整，以30 min內(nèi)吃完為度。

1.2.4.3ACC1基因相對表達量測定

養(yǎng)殖12周后，每組隨機取3尾喂食后6 h的半滑舌鰨提取肝臟總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈，采用SYBR Green實時熒光定量PCR方法測定ACC1基因的相對表達量。經(jīng)篩選確定RPL4和B2M為內(nèi)參基因。

1.2.5數(shù)據(jù)分析

將內(nèi)參基因的擴增效率和循環(huán)數(shù)(Cq)值數(shù)據(jù)導入geNorm程序，從而為不同的處理選擇不同的內(nèi)參組合。將目的基因和內(nèi)參基因的擴增效率和Cq值數(shù)據(jù)導入qBase Plus程序，從而計算各基因在不同的處理下的相對表達量，結(jié)果采用平均值±標準差表示。統(tǒng)計分析采用SPSS 13.0軟件，各組數(shù)據(jù)均通過了正態(tài)性和方差齊性檢驗，因此，組間差異采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間多重比較采用Turkey’s檢驗，P<0.05表示差異顯著。

2結(jié)果與分析

2.1半滑舌鰨ACC1基因全長cDNA分子特征

半滑舌鰨ACC1基因cDNA全長7 811 bp(圖2)，含1個7 074 bp的開放閱讀框，編碼2 357個氨基酸，ACC1蛋白計算分子質(zhì)量為266 ku，等電點6.42(GenBank登錄號為KP033455)。此外，由于可變剪接，還發(fā)現(xiàn)了另外2個分子質(zhì)量分別為265和264 ku的半滑舌鰨ACC1的同工型(isoforms)(GenBank登錄號分別為KP033456和KP033457)，與分子質(zhì)量為266 ku的ACC1相比，分別少8和15個氨基酸。

續(xù)圖2

*代表終止密碼子，灰色堿基代表實時熒光定量PCR和驗證可變剪接的引物，灰色氨基酸表示信號肽，保守的磷酸化位點Ser79～Ser81、潛在的ATP結(jié)合域Gly316～Gly321、生物素結(jié)合位點Val785～Met788及輔酶A結(jié)合位點Ser1969～Val1995用氨基酸加框表示。

* represented a termination codon. The grey bases indicated the primers for RT-qPCR and verifying alternative splicing. The grey amion acids indicated signal peptides. Boxed amion acid sequences indicate the conservative phosphorylation sites Ser79to Ser81, the potential ATP-binding site Gly316to Gly321, the biotin-binding site Val785to Met788, and the CoA-binding site Ser1969to Val1995.

圖2半滑舌鰨ACC1基因全長cDNA核苷酸序列及其編碼氨基酸序列

Fig.2The nucleotide sequence and deduced amino acid sequences ofACC1 gene full-length cDNA in

half-smooth tongue sole (Cynoglossussemilaevis)

2.2半滑舌鰨ACC1基因的組織表達

以RPL13A、RPL4、PPIase3個基因組合為內(nèi)參基因，采用實時熒光定量PCR方法對半滑舌鰨ACC1 mRNA在腸道、肝臟、肌肉、卵巢、脾臟、全腦、腎臟、心臟、腸系膜脂肪等組織中的表達進行了研究。結(jié)果表明，所有組織中均檢測到ACC1mRNA的表達，肝臟和全腦中的相對表達量顯著高于其他組織(P<0.05)，其相對表達量分別為2.67和2.53，腸道、卵巢和腸系膜脂肪中相對表達量次之，分別為1.14、0.97和1.10，腎臟中相對表達量最低，僅為0.48(圖3)。

數(shù)據(jù)柱標注不同字母表示差異顯著(P<0.05)。圖5同。

Value columns with different letters mean significant difference (P<0.05). The same as Fig.5.

圖3半滑舌鰨ACC1基因組織表達分析

Fig.3Expression analysis ofACC1 gene in different tissues of half-smooth tongue sole (Cynoglossussemilaevis)

2.3基于ACC1氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

從GenBank下載了7種魚類和16種其他脊椎動物ACC1氨基酸序列用于系統(tǒng)發(fā)育分析。使用MEGA 6.0軟件的Clustal W方法進行氨基酸序列比對，用NJ法構(gòu)建基于ACC1氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹，用自展法(bootstrap method)進行系統(tǒng)發(fā)生檢測，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可見，所有魚類聚為一枝，與其他脊椎動物分開。在魚類中，同屬鯉科的斑馬魚(Daniorerio)(GenBank登錄號為XP_009300128和XP_009300133)、草魚(Ctenopharyngodonidella)(GenBank登錄號為ADT82650)、墨西哥脂鯉(Astyanaxmexicanus)(GenBank登錄號為XP_007245267)聚為一枝，自展值為99%；本研究克隆的半滑舌鰨的3個同工型首先聚為一枝，然后與同屬鱸形總目(Percomorpha)的大黃魚(Laimichthyscrocea)(GenBank登錄號為XP_010748451)、布氏新燦鯛(Neolamprologusbrichardi)(GenBank登錄號為XP_006799564)和月光魚(Xiphophorusmaculatus)(GenBank登錄號為XP_005803670)聚為一枝，自展值為99%，表明它們的親緣關(guān)系較近。其他動物中，哺乳類、鳥類和爬行類均單獨聚為一枝，自展值均為100%，其中鳥類首先和爬行類聚為一枝，然后再與哺乳類聚為一枝，最后與兩棲類聚為一枝。在哺乳類中，偶蹄動物牛(Bostaurus)(GenBank登錄號為XP_005220033)和山羊(Caprahircus)(GenBank登錄號為XP_005693213)聚為一枝；熊科動物大熊貓(Ailuropodamelanoleuca)(GenBank登錄號為XP_002924940)和北極熊(Ursusmaritimus)(GenBank登錄號為XP_00869366)聚為一枝；靈長類動物智人(Homosapiens)(GenBank登錄號為NP_942131和XP_006721916)、黑猩猩(Pantrolodytes)(GenBank登錄號為XP_511428)和普通獼猴(Macacamulatta)(GenBank登錄號為NP_001253707)聚為一枝，自展值均為100%?；贏CC1氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系與傳統(tǒng)分類基本一致。此外，由于ACC1存在多種形式的可變剪接，每種生物的ACC1均有多個同工型，如斑馬魚的同工型多達13個，但每種生物的同工型都首先聚在一起，表明這些同工型是1個基因的不同剪接方式造成的。

2.4飼料脂肪水平對半滑舌鰨肝臟中ACC1基因表達的影響

由圖5可見，與對照組相比，3.5%魚油組肝臟中ACC1 mRNA相對表達量顯著降低(P<0.05)；7.0%和10.0%魚油組肝臟中ACC1 mRNA相對表達量進一步降低，顯著低于對照組和3.5%組(P<0.05)，同時7.0%和10.0%魚油組間雖差異不顯著(P>0.05)，但在數(shù)值上10.0%魚油組低于7.0%魚油組。

節(jié)點上的數(shù)字是自展值，物種拉丁文后接的“X+阿拉伯數(shù)字”，表示該物種ACC1不同的同工型。The number on the node was the bootstrap value, and the “X+Arabic numeral” behind the Latin name mean the species’ different isoforms. mammals：哺乳類；reptilians：爬行類；birds：鳥類；amphibians：兩棲類；fish：魚類；Bostaurus：牛；Caprahircus：山羊；Musmusculus：小鼠；Ailuropodamelanoleuca：大熊貓；Ursusmaritimus：北極熊；Macacamulatta：普通獼猴；Pantrolodytes：黑猩猩；Homosapiens：智人；Sarcophilusharrisii：袋獾；Alligatormississippiensis：美國短吻鱷；Alligatorsinensis：揚子鱷；Anasplatyrhynchos：綠頭鴨；Gallusgallus：原雞；Aptenodytesforsteri：帝企鵝；Pygoscelisadeliae：阿德利企鵝；Xenopus(Silurana)tropicalis：非洲爪蟾；Lepisosteusoculatus：眼斑雀鱔；Daniorerio：斑馬魚；Ctenopharyngodonidellus：草魚；Astyanaxmexicanus：墨西哥脂鯉；Xiphophorusmaculatus：月光魚；Larimichthyscrocea：大黃魚；Neolamprologusbrichardi：布氏新燦鯛。

圖4基于ACC1氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

Fig.4Phylogenetic tree based onACC1 amino acid sequences

圖5　飼料脂肪水平對半滑舌鰨ACC1基因表達的影響

3討論

3.1半滑舌鰨ACC1蛋白結(jié)構(gòu)

半滑舌鰨ACC1氨基酸序列與其他脊椎動物相比具有相似的結(jié)構(gòu)特點，其主要結(jié)構(gòu)域見圖6。

由圖6可見，半滑舌鰨ACC1由1個基因編碼，具有3個結(jié)構(gòu)域，分別對應原核生物的3個基因——BC、BCCP和CT，它們組成ACC1的3個亞基。BC域包含1個ATP結(jié)合位點，甘氨酸富集區(qū)(GGGGKG)被認為是人ACC1和ACC2的ATP結(jié)合域[6-7]，半滑舌鰨的ATP結(jié)合位點是Glu316～Glu321，與草魚[12]和人類[6-7]ATP結(jié)合域完全相同，說明這段序列高度保守。生物素酶的一個重要特征就是有1個生物素結(jié)合位點序列Met-Lys-Met的存在，這個區(qū)域有很保守的功能[3,15-16]。半滑舌鰨ACC1的BCCP域位于氨基酸序列的第755～819位點，唯一的4肽序列Val-Met-Lys-Met位于氨基酸殘基的第785～788位點(圖2)。因此，脊椎動物的生物素結(jié)合位點高度保守[17]。人ACC1中區(qū)域SFSEIMQPWAQTVVVGRARLGGIPVGV和ACC2中區(qū)域SFKEIMAPWAQTVVTGRARLGGIPVGV被認為是輔酶A結(jié)合位點[6-7]，在半滑舌鰨CT域中有相似的序列1969SFMEIMKPWAQSVVVGRARLGGIPTGV1995。

陰影框2和3表示可變剪接。Shaded boxes 2 and 3 showed alternative splicing.

Biotin carboxylase domain：生物素羧化酶結(jié)構(gòu)域；ACC1 central region：ACC1中心區(qū)域；Carboxyl transferase domain：羧基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域；BCCP：生物素羧基載體蛋白，biotin carboxyl carrier protein；BC ofE.coil：大腸桿菌BC結(jié)構(gòu)域；CT-β ofE.coil：大腸桿菌CT-β結(jié)構(gòu)域；CT-α ofE.coil：大腸桿菌CT-α結(jié)構(gòu)域；8aa absence in 265-ku isoform：缺少8個氨基酸分子質(zhì)量為265 ku的同工型：15aa absence in 264-ku isoform：缺少15個氨基酸分子質(zhì)量為264 ku的同工型。

圖6半滑舌鰨ACC1蛋白3個結(jié)構(gòu)域與細菌ACC1蛋白的3個亞基比較

Fig.6Comparison of three domains of ACC1 for half-smooth tongue sole and three subunits of ACC1 for bacteria

哺乳動物的ACC1基因共有54個編碼蛋白質(zhì)的外顯子，在中心區(qū)域，編碼8個氨基酸的外顯子E28在大鼠[18]、小鼠[19]和綿羊[1]均存在可變剪接。本研究中，半滑舌鰨ACC1的中心區(qū)域位于氨基酸殘基的第821～1 579位點(圖6)，該區(qū)域存在可變剪接，形成分子質(zhì)量分別為266、265和264 ku的3個同工型，與分子質(zhì)量為266 ku的ACC1相比，分子質(zhì)量為265和264 ku的ACC1分別少8和15個氨基酸，這與在大鼠[18]、小鼠[19]和綿羊[1]中發(fā)現(xiàn)的情況類似。

3.2半滑舌鰨ACC1基因的組織表達

哺乳動物ACC1基因在各種組織中均表達，但在肝臟、脂肪、哺乳期乳腺等生脂組織中表達量最高[1]。半滑舌鰨ACC1在本試驗檢測的10種組織中均有表達，其中，肝臟和全腦等組織中表達量顯著高于其他組織，與哺乳動物ACC1的組織表達規(guī)律相類似。

3.3營養(yǎng)素對ACC1基因表達的調(diào)控

對高等動物的研究表明，飼料營養(yǎng)素可通過調(diào)控相關(guān)基因表達控制動物體脂的沉積，高糖飼料能促進脂肪的合成，其作用涉及基因轉(zhuǎn)錄、mRNA加工和穩(wěn)定多個層次[20]；脂肪酸作為轉(zhuǎn)錄因子的配體參與了動物體內(nèi)多種脂肪代謝相關(guān)基因表達的調(diào)節(jié)[21]。研究表明，脂肪酸對生脂基因表達有抑制作用，但這種作用與脂肪酸種類關(guān)系密切，飼料中添加多不飽和脂肪酸(PUFA)可降低鼠肝臟ACC等生脂基因mRNA的相對表達量[22]。飼料中脂肪種類和水平對魚類生脂基因表達有顯著影響，黑鯛(Sparusmacrocephalus)飼料中當n-3 PUFA含量在0.92%以上時，脂肪酸合酶(FAS)基因表達量顯著下降[23]。草魚飼喂分別以豬油和魚油為主要脂肪源的飼料后發(fā)現(xiàn)，富含n-3 PUFA的魚油組肝胰臟FAS、ACC等生脂基因mRNA的相對表達量顯著低于豬油組[24]。鯽魚肝胰臟ACC1和FAS等生脂基因mRNA相對表達量隨飼料脂肪水平的升高而降低[25]。本研究中，飼料中添加魚油顯著抑制了半滑舌鰨肝臟ACC1基因的表達。因此，當飼料中提供充足的PUFA時，半滑舌鰨可以優(yōu)先利用，從而減少脂肪酸的從頭合成，以節(jié)省能量。

4結(jié)論

本研究從半滑舌鰨肝臟中克隆了ACC1基因全長cDNA，得出半滑舌鰨ACC1的主要功能位點為ATP結(jié)合位點、生物素結(jié)合位點、輔酶A結(jié)合位點，與其他脊椎動物相比基本保守。半滑舌鰨ACC1基因主要在肝臟和全腦等生脂組織中表達，飼料中添加魚油顯著抑制其肝臟ACC1基因的表達，且抑制作用與魚油添加量呈正相關(guān)。

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(責任編輯菅景穎)

Full Length cDNA Molecular Cloning of Acetyl-CoA Carboxylase α Gene and Effects of Dietary Lipid Level on Its Expression in the Liver of Half-Smooth Tongue Sole(Cynoglossussemilaevis)

ZHANG Xiaqing1XU Jianhe1,2PAN Qian3YI Lefei1PENG Yongxing1SHEN Xin1YAN Binlun1,2GAO Huan1,2WANG Wenxiang1CHENG Hanliang1,2*

(1. Huaihai Institute of Technology, Lianyungang 222005, China; 2. Co-Innovation Center of Jiangsu Marine Bio-Industry Technology, Lianyungang 222005, China; 3. Zhejiang Institute of Freshwater Fisheries, Huzhou 313001, China)

Abstract:The full-length cDNA of acetyl-coa carboxylase α (ACC1) gene was cloned from liver of half-smooth tongue sole (Cynoglossus semilaevis) by reverse transcription PCR (RT-PCR) and rapid amplification of cDNA ends (RACE) methods. The expression of ACC1 mRNA in gut, liver, muscle, ovary, spleen, brain, kidney, heart, mesenteric adipose tissue of half-smooth tongue sole was analyzed by real-time fluorescence quantitative PCR (RT-qPCR) method. In addition, the effects of dietary lipid level on ACC1 gene expression in liver of half-smooth tongue sole were investigated. The results showed as follows: 1) the full-length cDNA of ACC1 gene was 7 811bp with a 7 074 bp open reading frame encoding 2 357 amino acids. The ACC1 protein has a calculated molecular weight of 266 ku and isolectric point of 6.42. Some conserved sites of ACC1 amino acid sequence were found, including a ATP-binding site (Gly(316) to Gly(321)), a biotin-binding site (Val(785)-Met(786)-Lys(787)-Met(788)), and a CoA-binding site (Ser(1969) to Val(1995)). In addition, the alternative splice varieties were found in ACC1 gene, and we present evidence for the presence of two isoforms of ACC1 in half-smooth tongue sole liver that differ from the 266 ku ACC1 by the absence of 8 and 15 amino acids. 2) The expression of ACC1 mRNA was detected in all examined tissues. The relative expression level of ACC1 mRNA in liver and brain were 2.67 and 2.53, respectively, which were significantly higher than that in other tissues (P<0.05); the relative expression level of ACC1 mRNA in gut, mesenteric adipose and ovary were second, which were 1.14, 1.10 and 0.97, respectively; the relative expression level of ACC1 mRNA in kidney was the lowest, only was 0.48. 3) Compared with the control group (without fish oil group), diet added with 3.5% fish oil significantly decreased the relative expression level of ACC1 mRNA in liver (P<0.05); diet added with 7.0% and 10.0% fish oil led to further decrease the relative expression level of ACC1 mRNA in liver, and it was significantly lower than that in 3.5% fish oil group and control group (P<0.05), meanwhile, the 10.0% fish oil group was lower than 7.0% fish oil group (P>0.05). In summary, we have cloned the full-length cDNA of ACC1 gene from half-smooth tongue sole. Compared with other vertebrates, the main functional sites (ATP-binding site, biotin-binding site and CoA-binding site) are basically conserved. The lipogenic tissues, such as liver and brain, are the main ACC1 gene expressing tissues in half-smooth tongue sole. Moreover, liver ACC1 mRNA expression is inhibited after the fish fed diets added with fish oil, and the inhibitory effect is positively correlated with the addition of fish oil.[Chinese Journal of Animal Nutrition, 2016, 28(2)：485-497]

Key words:half-smooth tongue sole (Cynoglossus semilaevis); ACC1; molecular cloning; nutritional regulation; tissue express

*Corresponding author, professor, E-mail: CHL3139@163.com

中圖分類號：S963

文獻標識碼：A

文章編號：1006-267X(2016)02-0485-13

作者簡介：張夏青(1990—)，女，江蘇宿遷人，碩士研究生，研究方向為水產(chǎn)動物營養(yǎng)與飼料。E-mail: zxq761114@163.com*通信作者：程漢良，教授，碩士生導師，E-mail： CHL3139@163.com

基金項目：國家自然科學基金(31272636)；江蘇省高校自然科學研究重大項目(10KJA240002)；江蘇省自然科學基金(BK2012664)；江蘇省海洋生物技術(shù)重點實驗室開放基金(2009HS15)；浙江省重大科技專項(2012C12907-2)；江蘇省優(yōu)勢學科建設(shè)工程項目(PAPD)；國家科技支撐計劃(2012BAD26B04-04)

收稿日期：2015-08-01

doi：10.3969/j.issn.1006-267x.2016.02.022