葉沙舟　張　杰　陳海敏*　周歧存　朱芳周

(1．寧波大學海洋學院，浙江省海洋生物工程重點實驗室，寧波315211；2.寧波大學海洋學院，

魚類營養(yǎng)研究室，寧波315211；3.鄭州新威營養(yǎng)技術有限公司，鄭州450100)

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谷氨酰胺對黃顙魚幼魚生長性能、腸道形態(tài)及非特異性免疫相關基因表達的影響

葉沙舟1張杰1陳海敏1*周歧存2朱芳周3

(1．寧波大學海洋學院，浙江省海洋生物工程重點實驗室，寧波315211；2.寧波大學海洋學院，

魚類營養(yǎng)研究室，寧波315211；3.鄭州新威營養(yǎng)技術有限公司，鄭州450100)

摘要：本試驗旨在探討谷氨酰胺對黃顙魚幼魚生長性能、腸道形態(tài)及非特異性免疫相關基因表達的影響。選用體重為(2.49±0.04) g的黃顙魚幼魚240尾，隨機分為4組，每組3個重復，每個重復20尾。配制含0(對照)、0.10%、0.20%和0.40%谷氨酰胺的4種試驗飼料，每種試驗飼料隨機飼喂1組試驗魚，飼養(yǎng)周期為70 d。結果發(fā)現(xiàn)：飼料中添加谷氨酰胺對黃顙魚幼魚的生長性能指標無顯著影響(P>0.05)。相比對照組，飼料中添加谷氨酰胺后促進了腸道絨毛的發(fā)育，絨毛高度與皺褶深度有所增加，但肌層厚度有所下降，其中0.20%和0.40%組腸道絨毛高度、皺褶深度顯著增加(P<0.05)，肌層厚度顯著降低(P<0.05)。在0.10%～0.20%谷氨酰胺添加范圍內，金屬硫蛋白(MT)mRNA相對表達量在肌肉中變化最明顯，各添加組均較對照組顯著升高(P<0.05)；谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)mRNA相對表達量在腸道中變化最明顯，其中0.20%組較對照組顯著升高(P<0.05)；抗菌肽(Hepc)和組成型熱休克蛋白70(Hsc70)mRNA相對表達量在肝臟中變化最明顯，其中0.10%組的Hepc mRNA相對表達量達到對照組的73倍之多(P<0.05)，0.20%組的Hsc70 mRNA相對表達量達到對照組的3倍之多(P<0.05)。由此得出，在基礎飼料中添加一定量的谷氨酰胺能增強黃顙魚幼魚的非特異性免疫和抗氧化能力。

關鍵詞：黃顙魚；谷氨酰胺；非特異性免疫；腸道形態(tài)

谷氨酰胺(glutamine,Gln)是動物體內含量最豐富的一種條件性必需氨基酸，是機體一些快速分裂細胞的主要能量來源，參與合成多種必需物質代謝，具有維持腸道黏膜屏障、改善機體營養(yǎng)狀況、增強機體免疫能力等多種功能。研究表明，適量Gln的添加可以增加大鼠腸絨毛高度，降低腸黏膜通透性，增強腸免疫功能，并防止細菌及毒素的移位，維持腸黏膜屏障。Gln在動物飼料領域的應用已有所研究，例如：添加1%的Gln可以增加斷奶仔豬的空腸絨毛高度，降低肌層厚度，防止斷奶仔豬的腸黏膜萎縮，對維持腸道的結構和功能具有重要作用；Gln可以提高豬腸黏膜中抗菌肽mRNA的表達量，提高仔豬的抗病能力，且可以減少斷奶仔豬應激時自由基的產生，從而減少應激對機體的損傷。

黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)屬鯰形目(Siluriformes)，鲿科(Bagridae)，黃顙魚屬(Pelteobagrus)，其肉味鮮美、含肉率高、營養(yǎng)價值高，深受中國、韓國、日本等東亞國家消費者青睞。隨著黃顙魚養(yǎng)殖業(yè)的興起和發(fā)展，對病害防治途徑的探索不斷加深。然而，Gln對動物免疫及營養(yǎng)作用的研究主要集中在畜禽方面，關于水生動物方面的研究只有零星報道，而在黃顙魚飼料中的應用效果還未有報道。因此，本研究通過在飼料中添加Gln，探討其對黃顙魚幼魚生長性能、腸道形態(tài)和非特異性免疫相關基因表達的影響，并確定其適宜添加量，為Gln在水產飼料生產中的應用提供參考。

1材料與方法

1.1試驗飼料

設定試驗飼料中Gln(純度99%，鄭州新威營養(yǎng)技術有限公司提供)添加量分別為0(對照)、0.10%、0.20%、0.40%。飼料原料粉碎后過60目篩，按照配方要求準確稱量，混勻，微量成分采取逐級擴大法預混合，再與大宗原料混合均勻，液體原料加入后過60目篩，使其混合均勻，混勻后加入30%的水，再次混勻后用雙螺桿制粒機(華南理工大學科技實業(yè)總廠，G-250)擠壓成粒徑分別為2.5和4.0 mm的2種顆粒飼料，制粒后于90 ℃烘箱中熟化0.5 h，干燥后于-20 ℃保存?zhèn)溆?。飼料成分分析參照AOAC(1995)的方法，即水分含量采用105 ℃常壓干燥法測定，粗蛋白質含量采用凱氏定氮法測定，粗脂肪含量采用索氏抽提法測定。試驗飼料組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1　試驗飼料組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)

1)礦物質預混料為每千克飼糧提供The mineral premix provided the following per kg of diets：Fe (as ferric citrate) 12 mg，Zn (as zinc sulfate) 32 mg，Mn (as manganese sulfate) 20 mg，Cu (as copper sulfate) 25 mg，I (as potassium iodide) 0.10 mg，Mg (as magnesium sulphate) 350 mg，K (as monopotassium phosphate) 1 000 mg，Na (as monosodium phosphate) 300 mg，Ca (as calcium lactate) 65 mg，Co (as cobalt dichloride) 5 mg，Se (as sodium selenite) 0.3 mg。

2)維生素預混料為每千克飼糧提供The vitamin premix provided the following per kg of diets：VA 2 mg，VB1100 mg，VB260 mg，VB6120 mg，VB120.2 mg，VC 105 mg，VD30.15 mg，VE 100 mg，VK340 mg，生物素 biotin 2.5 mg，葉酸 folic acid 4.0 mg，泛酸鈣 calcium pantothenate 150 mg，煙酸 nicotinic acid 400 mg，肌醇 inositol 2 000 mg。

1.2飼養(yǎng)管理

試驗用黃顙魚幼魚購自浙江湖州漁場，在試驗條件下飼養(yǎng)2周后開始試驗。試驗前，禁食24 h后取健康、體重相近的黃顙魚幼魚進行分組，將240尾平均體重為(2.49±0.04) g的黃顙魚幼魚隨機分為4組，每組3個重復，每個重復20尾，飼養(yǎng)于300 L藍色玻璃鋼桶中，試驗期為10周。每2周測量1次體重，每天投喂2次，投喂時間分別為07:00和17:00，日投喂量為其體重的6%～8%，投喂后1 h觀察其攝食情況，根據(jù)魚的進食情況調整投喂量。試驗用水為經過曝氣處理的自來水，整個養(yǎng)殖過程中連續(xù)充氣(1 L/min)，溶氧濃度保持或接近飽和，每天除污1次，前2周隔天換水1次，之后視水質情況每天換水40%～60%。試驗期間，水溫為19～29 ℃，pH 7.5～7.8，氨氮濃度不高于0.05 mg/L。

1.3樣品采集與指標測定

試驗結束后，禁食24 h，擦干魚體表水分和黏液，稱重，統(tǒng)計存活率。每桶隨機取3尾魚測定其體重。按下列公式計算生長性能指標：

增重率(weight gain rate，WGR，%)=

100×(Wt-W0)/W0；

特定生長率(specific growth rate，SGR，%/d)=

100×(lnWt-lnW0)/t；

飼料效率(feed efficiency，F(xiàn)E)=

(Wt-W0)/F；

存活率(survival rate,SR,%)=100×

(Nt-N0)/N0。

式中：Wt為終末體重(g)；W0為初始體重(g)；t為試驗天數(shù)(d)；F為攝食量(g)；Nt為終末尾數(shù)；N0為初始尾數(shù)。

每個重復再隨機選取3尾魚，在冰浴條件下進行解剖，剝取肝臟、肌肉與腸道組織置于含RNA later的離心管中，立即置于液氮中備用。取出前腸1 cm左右，用生理鹽水沖洗干凈，放入10%中性甲醛中固定，石蠟包埋，連續(xù)橫斷切片，厚7 μm，進行常規(guī)蘇木精-伊紅(HE)染色。利用NIS-Elements D照相處理軟件，每個腸管取2張切片，每張切片選取3個絨毛高度、皺褶深度和肌層厚度進行測量。

1.4總RNA提取和cDNA合成

1.5引物的設計和合成

根據(jù)GenBank中黃顙魚的金屬硫蛋白(MT)、谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)、抗菌肽(Hepc)、組成型熱休克蛋白70(Hsc70)和β-肌動蛋白(β-actin，內參基因)的cDNA序列，用Primer 5.0軟件設計引物，見表2，引物由上海英濰捷基公司合成。

表2　內參和目的基因的引物序列

1.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

通過統(tǒng)計軟件SPSS 20.0，采用單因素方差分析(one-way ANOVA)和Duncan氏多重檢驗法進行統(tǒng)計分析，P<0.05為差異顯著。

2結果

2.1Gln對黃顙魚幼魚生長性能的影響

表3顯示，隨著飼料中Gln添加量的增加，黃顙魚幼魚的存活率出現(xiàn)增高的趨勢，但組間差異不顯著(P>0.05)。黃顙魚幼魚的終末體重、增重率、特定生長率、飼料效率各組間亦差異不顯著(P>0.05)。

表3　Gln對黃顙魚幼魚生長性能的影響

同行數(shù)據(jù)肩標相同或無字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。

In the same row, values with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

2.2Gln對黃顙魚幼魚腸道形態(tài)的影響

圖1顯示，相比對照組，飼料中添加Gln后促進了腸道絨毛的發(fā)育，絨毛高度與皺褶深度有所增加，但肌層厚度有所下降。

表4顯示，隨著飼料中Gln添加量的增加，黃顙魚幼魚腸道絨毛高度呈現(xiàn)增加的趨勢，其中0.10%組與對照組差異不顯著(P>0.05)，而0.20%和0.40%組與對照組差異顯著(P<0.05)。對于皺褶深度，0.20%和0.40%組較對照組顯著增加(P<0.05)，而0.10%組與對照組差異不顯著(P>0.05)。飼料中添加0.10%Gln對腸道肌層厚度未產生顯著影響(P>0.05)，但添加0.20%和0.40%Gln則顯著降低了腸道肌層厚度(P<0.05)。

2.3Gln對黃顙魚幼魚MTmRNA相對表達量的影響

圖2顯示，飼料中添加Gln后，肌肉中MTmRNA相對表達量變化最明顯，各添加組均較對照組顯著升高(P<0.05)，其中0.40%組達到了對照組的3倍之多，但沒有劑量效應，以0.20%組的升高量較低。與對照組相比，腸道中MTmRNA相對表達量在0.20%組顯著升高(P<0.05)，升高了28.42%，但在0.10%和0.40%組則顯著下降(P<0.05)。肝臟中MTmRNA相對表達量隨著飼料中Gln添加量的增加先顯著降低(P<0.05)，而后雖然有所升高，但各添加組仍均顯著低于對照組(P<0.05)。

2.4Gln對黃顙魚幼魚GSTmRNA相對表達量的影響

圖3顯示，與對照組相比，腸道中GSTmRNA相對表達量在0.10%和0.20%組有所升高，0.20%組升高了32.42%(P<0.05)，在0.40%組又有所下降，但差異未達顯著水平(P>0.05)。與對照組相比，肝臟中GSTmRNA相對表達量在0.20%組略有下降(P>0.05)，而在0.10%和0.40%組則下降顯著(P<0.05)。飼料中添加Gln后肌肉中GSTmRNA相對表達量出現(xiàn)了顯著下降(P<0.05)。

A：對照組；B：0.10%組；C：0.20%組；D：0.40%組。MH：絨毛高度；MF：皺褶深度；MC：肌層厚度。

A: control group; B: 0.10% group; C: 0.20% group; D: 0.40% group. MH: villus height; MF: folds depth; MC: muscle thickness.

圖1　攝食含不同添加量Gln飼料后黃顙魚幼魚的腸道組織學變化

2.5Gln對黃顙魚幼魚HepcmRNA相對表達量的影響

圖4顯示，飼料中添加Gln后肝臟中HepcmRNA相對表達量受影響最明顯，在添加量為0.10%時較對照組升高達73倍之多(P<0.05)，而添加量增加到0.20%和0.40%時雖然較對照組有所增加，但差異不顯著(P<0.05)。與對照組相比，肌肉中HepcmRNA相對表達量只有0.20%組出現(xiàn)了2倍的升高(P<0.05)，另外2個組都略有下降(P>0.05)。飼料中添加Gln后腸道中HepcmRNA相對表達量出現(xiàn)了顯著下降(P<0.05)。

2.6Gln對黃顙魚幼魚Hsc70 mRNA相對表達量的影響

圖5顯示，肌肉中Hsc70 mRNA相對表達量隨飼料中Gln添加量的增加而升高，其中0.20%和0.40%組較對照組顯著升高(P<0.05)。與對照組相比，肝臟中Hsc70 mRNA相對表達量在0.20%組升高顯著(P<0.05)，達到3倍之多；而0.10%和0.40%組未產生顯著變化(P>0.05)。與對照組相比，腸道中Hsc70 mRNA相對表達量在0.20%組略有升高，在0.10%和0.40%組則略有降低，但差異均不顯著(P>0.05)。

數(shù)據(jù)柱標注不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下圖同。

Value columns with different letters mean signicant difference (P<0.05). The same as below.

圖2Gln對黃顙魚幼魚不同組織

MTmRNA相對表達量的影響

Fig.2Effects of Gln onMTmRNA relative expression

level in different tissues of

juvenile yellow catfish

圖3　Gln對黃顙魚幼魚不同組織

3討論

腸黏膜和其他迅速增生的細胞(如免疫細胞)的主要能量來源是Gln，而非葡萄糖。腸道是Gln最主要的消耗器官[10]。同時，腸道將體內環(huán)境和外源性物質隔離開來，腸黏膜作為第1道防線，與機體的非特異性免疫有著密切關系。飼料中添加適量的Gln可維持腸黏膜形態(tài)結構的完整性，能防止腸腔內的有害物質如細菌和毒素穿過腸黏膜進入體內其他組織器官和血液循環(huán)[11-12]。喬云芳[13]研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加0.5%Gln可顯著提高肉仔雞的絨毛高度。林燕[14]研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加1.2%Gln后建鯉(Cyprinuscarpiovar. Jian)腸道的皺褶深度顯著提高。鄒曉庭[15]研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加0.5%Gln可降低斷奶仔豬的肌層厚度。本試驗中，飼料中適量添加Gln提高了黃顙魚幼魚的增重率、特定生長率和存活率，說明Gln對其健康生長是有積極作用的。盡管Gln對增重率、特定生長率的影響不顯著，但考慮到Gln在增強免疫功能方面發(fā)揮主要作用，可能對生長速度的影響不是其主要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加0.20%Gln提高了黃顙魚幼魚腸道的絨毛高度、皺褶深度，且降低了肌層厚度。因此，該Gln添加量能有效防止黃顙魚幼魚的腸道黏膜萎縮，維持腸道的結構和功能，不同程度地提高機體非特異性免疫能力。

圖4　Gln對黃顙魚幼魚不同組織

Hepc和Hsc70與機體的非特異性免疫作用有著密切關系。Hepc對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、霉菌、螺旋體和病毒等病原微生物均具有很強的殺傷活性[16-17]，是魚體非特異性免疫系統(tǒng)的重要組成成分[18]。沈文英等[19]發(fā)現(xiàn)，正常狀態(tài)下，HepcmRNA相對表達量在肝臟中最高；用嗜水單胞菌(Aeromonashydrophila)和臘樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)感染黃顙魚后，HepcmRNA相對表達量在肝臟中變化最顯著。Hsc70是熱休克蛋白家族的成員，近來有研究表明，病原感染細胞后，細胞表面的Hsc70可以呈遞抗原，增強細胞的內攝作用[20]。賈愛榮[21]發(fā)現(xiàn)，正常狀態(tài)下，Hsc70 mRNA相對表達量在肝臟中最高，用哈維氏弧菌(Vibrioharveyi)感染大菱鲆(Scophthalmusmaximus)后，Hsc70 mRNA相對表達量在肝臟中變化最顯著。本試驗結果顯示，在飼料中添加Gln能提高機體的非特異性免疫能力，而且在0.10%～0.20%添加范圍內，Hepc和Hsc70 mRNA相對表達量在肝臟中變化最明顯。

圖5　Gln對黃顙魚幼魚不同組織

MT和GST主要與機體的非特異性免疫作用中的抗氧化機制有關。MT富含還原態(tài)巰基且具有親核性，其中的金屬具有動力學不穩(wěn)定性，這使得MT對自由基有較強的清除作用[22]，對金屬[23]、化學物質[24]及輻射[25]導致的氧化損傷可起到一定的保護作用，同時還對巨噬細胞有保護和增強作用[26]。GST是生物機體內重要的氧化還原代謝酶之一[27]，同時具有解毒的功能[28]，可提高機體的防御能力。本試驗結果顯示，在飼料中添加Gln在提高機體抗氧化能力的同時也提高了機體的非特異性免疫能力，且在0.10%～0.20%添加范圍內，MTmRNA相對表達量在肌肉中變化最明顯，GSTmRNA相對表達量在腸道中變化最明顯。

4結論

在基礎飼料中添加一定量的Gln能增強黃顙魚幼魚的非特異性免疫和抗氧化能力，從而促進其健康生長。

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(責任編輯菅景穎)

Effects of Glutamine on Growth Performance, Intestinal Morphology and Non-Specific Immune Related Gene Expression of Juvenile Yellow Catfish (Pelteobagrusfulvidraco)

YE Shazhou1ZHANG Jie1CHEN Haimin1*ZHOU Qicun2ZHU Fangzhou3

(1. Key Laboratory of Marine Bioengineering of Zhejiang Province, School of Marine Sciences,Ningbo University, Ningbo 315211, China; 2. Laboratory of Fish Nutrition, School of Marine Sciences,Ningbo University, Ningbo 315211, China; 3. Zhengzhou Xinwei Nutrition Technology Company,Zhengzhou 450100, China)

Abstract:The effects of glutamine (Gln) on growth performance, intestinal morphology and non-specific immune related gene expression of juvenile yellow catfish (Pelteobagrus fulvidraco)were evaluated in this study. Two hundred and forty juvenile yellow catfish with the initial body weight of (2.49±0.04) g were randomly divided into four groups with three replicates, and there were twenty fish in each replicate. Four experimental diets were formulated to contain 0 (control), 0.10%, 0.20% and 0.40% Gln, which were randomly fed one of four groups for 70 days. The results showed that the growth performance indices were not significantly affected by Gln supplementation (P>0.05). Diets supplemented with Gln could improve the intestinal villus development, and increase the villus height and folds depth, but decrease the muscle thickness. Compared with control group, the intestinal villus height and folds depth in 0.20% and 0.40% groups were significantly increased (P<0.05), and the muscle thickness was significantly decreased (P<0.05). For the Gln supplemental level at 0.10% to 0.20%, the mRNA relative expression level of metallothionein (MT) in muscle had the most obvious change, and that in supplementation groups was significantly higher than that in control group (P<0.05); the mRNA relative expression level of glutathione-S-transferase (GST) in intestine got the most obvious change, and that in 0.20% group was significantly higher than that in control group (P<0.05); the mRNA relative expression levels of heppatic bactericidal protein (Hepc) and heat shock cognate protein 70 (Hsc70) both in liver got the most obvious changes, the mRNA relative expression level of Hepc in 0.10% group was over 73 times than that of control group (P<0.05), and the mRNA relative expression level of Hsc70 in 0.20% group was over triple than that of control group (P<0.05). In summary, these results suggest that Gln can improve the non-specific immune and antioxidant ability of juvenile yellow catfish at certain supplemental level.[Chinese Journal of Animal Nutrition, 2016, 28(2)：468-476]

Key words:yellow catfish (Pelteobagrus fulvidraco); glutamine; non-specific immune; intestine morphology

*Corresponding author, professor, E-mail： chenhaimin@nbu.edu.cn

中圖分類號：S963

文獻標識碼：A

文章編號：1006-267X(2016)02-0468-09

作者簡介：葉沙舟(1991—)，男，浙江溫州人，本科生，從事海洋生物分子生物學的研究。E-mail： 19948456@qq.com*通信作者：陳海敏，研究員，博士生導師，E-mail： chenhaimin@nbu.edu.cn

基金項目：寧波市創(chuàng)新團隊(2011B81007)；浙江省重大科技專項(2012C12907-6)；國家公益性行業(yè)(海洋)科研專項(201105023)；國家海洋公益性行業(yè)科研專項(201505033)

收稿日期：2015-08-24

doi：10.3969/j.issn.1006-267x.2016.02.020