劉　蘭　劉紅云　劉建新

(浙江大學奶業(yè)科學研究所，動物分子營養(yǎng)學教育部重點實驗室，杭州310058)

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奶牛乳腺氨基酸代謝利用及其信號通路

劉蘭劉紅云*劉建新*

(浙江大學奶業(yè)科學研究所，動物分子營養(yǎng)學教育部重點實驗室，杭州310058)

摘要：乳腺是奶牛乳汁合成的重要器官，乳腺內營養(yǎng)物質代謝與乳品質密切相關。乳蛋白作為乳中最重要的營養(yǎng)物質，一直受到研究者關注。氨基酸是乳蛋白合成的重要前體物，同時也是乳腺代謝途徑的重要調控因子。乳腺內氨基酸代謝涉及諸多信號通路，對信號通路的深入研究可從細胞分子水平揭示乳合成調控機理，為奶牛乳腺內氨基酸代謝營養(yǎng)調控提供理論依據(jù)。本文針對奶牛乳腺氨基酸代謝及其涉及到的信號通路進行綜述，并就其與營養(yǎng)的關聯(lián)進行了闡述。

關鍵詞：奶牛乳腺；氨基酸代謝；信號通路

乳腺營養(yǎng)物質代謝一直是奶牛營養(yǎng)研究的熱點。乳蛋白是乳中最為重要的營養(yǎng)物質，是衡量乳品質的重要指標之一。氨基酸作為合成乳蛋白的基本單位，在乳腺內代謝活躍，與泌乳密切相關。乳腺從血液中攝取的游離氨基酸絕大部分用于乳蛋白合成，另外也具有重要的代謝調控作用。關于奶牛乳腺氨基酸代謝，體內外已展開大量研究，但氨基酸代謝的分子機制仍不清楚。信號通路研究可從細胞分子水平闡述奶牛營養(yǎng)調控機理，為改善奶牛乳腺機能進而進行營養(yǎng)調控以提高乳品質以及產(chǎn)乳量提供理論依據(jù)。

1乳腺代謝

乳腺是乳汁合成的重要場所，其功能特性也是奶牛經(jīng)濟價值的根本體現(xiàn)。哺乳動物乳腺是較為特殊的器官，在整個生命過程中，伴隨妊娠進行著周期性發(fā)育，并且在不同泌乳階段具有不同的代謝特征。乳汁在乳腺中的合成與分泌過程復雜，并且其代謝狀況影響乳腺對營養(yǎng)物質的攝取吸收[1]。在代謝旺盛的泌乳期，奶牛乳腺合成的蛋白質占全身蛋白質合成量的43%，其中90%為乳蛋白[2]。蛋白質在乳腺內的代謝既有氨基酸組裝合成，也存在降解過程，是一動態(tài)平衡過程。氨基酸作為乳蛋白合成的前體物，一直是乳蛋白合成代謝研究的重點。深入研究乳腺對氨基酸的利用及氨基酸對乳蛋白合成的調控機制顯得尤為必要。

2乳腺內氨基酸代謝

乳腺主要攝取血液中游離的氨基酸。氨基酸通過轉運載體進入乳腺上皮細胞，進行蛋白質合成與降解過程。乳腺內氨基酸代謝復雜，各種氨基酸代謝過程及代謝效率需要進一步揭示。乳腺通過增加對必需氨基酸的攝取，以及對非必需氨基酸的選擇性攝取平衡配比，以增加乳蛋白的產(chǎn)量，提高可代謝蛋白質的利用率，并使吸收的氨基酸較少地進行分解代謝[3]。激素影響氨基酸的代謝，如生長因子影響多種氨基酸的轉運[4]，生乳激素可促進氨基酸氧化酶的表達[5]。通過體內灌注同位素標記氨基酸手段研究氨基酸代謝，對氨基酸在機體及乳腺內代謝具有指示性作用，但其具體機制仍有待揭示。由于氨基酸種類繁多，代謝受諸多因素影響，在不同生理狀態(tài)下代謝不同，大大增加研究難度。只有深入了解反芻動物乳腺組織對氨基酸的攝取代謝模式，才能合理得出各種氨基酸的需求量并對其調控，從而達到提高乳產(chǎn)量、改善乳品質的目的。

2.1蛋氨酸

含硫氨基酸蛋氨酸和半胱氨酸在哺乳動物蛋白質代謝中具有重要作用。蛋氨酸是奶牛在玉米基礎飼糧條件下的第一限制性氨基酸，在乳腺中攝取量低于乳分泌量。除與蛋白質合成密切相關，蛋氨酸也以組織特異性的方式進行多種代謝，如生成磷脂、肉毒堿、多胺[6]。同時，蛋氨酸也是一種甲基供體，在一系列轉甲基反應，如調控DNA活性、致癌基因活性過程中起到重要作用，并且為半胱氨酸的合成提供硫。單獨添加蛋氨酸或同時添加賴氨酸時，可顯著提高以玉米為基礎飼糧奶牛的乳蛋白合成[7]。在培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細胞中研究發(fā)現(xiàn)，蛋氨酸可促進β-酪蛋白基因的表達，其中60s核糖體蛋白的一種亞基(60s核糖體蛋白L35)在蛋氨酸調控β-酪蛋白基因翻譯延長和分泌過程中起到重要作用[8]。自然界中L型氨基酸可以構成蛋白質，Lapierre等[9]研究發(fā)現(xiàn)D型蛋氨酸雖然不被乳腺攝取利用，但在機體其他部位可轉化生成L型蛋氨酸，用于乳蛋白合成。在乳腺中，蛋氨酸和半胱氨酸除了用于合成乳蛋白，是否存在其他作用，且蛋氨酸和半胱氨酸在其他組織中發(fā)現(xiàn)的分解代謝途徑在乳腺中是否存在均有待于進一步確定。

2.2賴氨酸

乳腺對賴氨酸的攝取量高于乳中分泌量。盡管乳腺對其過度攝取，但賴氨酸仍是奶牛營養(yǎng)限制性氨基酸，這不僅由于賴氨酸可直接用于合成乳蛋白，也與其在乳腺內的代謝密切相關。添加過瘤胃保護性賴氨酸和蛋氨酸可增加乳蛋白產(chǎn)量[10]，而相關體外研究進一步發(fā)現(xiàn)賴氨酸與蛋氨酸合成乳蛋白的最適比例為3∶1[11]。Lapierre等[12]對賴氨酸代謝進行了一系列研究，發(fā)現(xiàn)賴氨酸在乳腺內發(fā)生分解代謝，并為非必需氨基酸合成提供氮，即使在賴氨酸受限制時該過程仍有發(fā)生；而當賴氨酸過量時，乳腺攝取量增加并且氧化反應增強。過度攝取的賴氨酸究竟如何代謝，以及賴氨酸如何限制乳蛋白生成等問題均有待闡明。了解賴氨酸的代謝機制，在不同營養(yǎng)條件下可以對其需求量做出預判，從而達到調控乳合成的目的。

2.3精氨酸

精氨酸是一種功能性必需氨基酸，在生長、繁殖、泌乳等生命過程中起重要作用，其乳腺攝取量高于乳分泌量。在泌乳奶牛乳腺中，精氨酸在精氨酸酶催化下轉化為氨和鳥氨酸，鳥氨酸在鳥氨酸脫羧酶作用下轉化為多胺，具有調控乳生成的作用。精氨酸代謝生成的一氧化氮(NO)可作為血管舒張劑，有利于維持血管通透性，保證組織氨基酸的正常血供。精氨酸也可轉化生成非必需氨基酸，如脯氨酸。當乳腺其他必需氨基酸供應充足時，缺乏精氨酸會使乳腺對于精氨酸的吸收減少，但并不降低乳蛋白及乳產(chǎn)量[13]，精氨酸與其他氨基酸之間也存在著某些代謝轉化。乳腺中精氨酸的代謝在眾多氨基酸研究中相對較多，但具體代謝機制仍不清晰，需要進一步確認，也為后續(xù)其他氨基酸代謝提供參考思路。

2.4支鏈氨基酸

亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸是奶牛營養(yǎng)代謝所需的必需氨基酸。尤以亮氨酸為首，有較多代謝相關研究。研究發(fā)現(xiàn)擠奶次數(shù)可影響亮氨酸在奶山羊乳腺內的代謝[14]，而生糖營養(yǎng)物質也可調控亮氨酸的代謝[15]。亮氨酸被乳腺大量吸收，并且攝取量超過乳蛋白分泌量。體外試驗表明，由支鏈氨基酸生成的酮酸不會氧化生成二氧化碳，反而釋放到細胞外[16]。酮酸脫氫酶的活性在磷酸化作用下受支鏈氨基酸和胰島素調控，當血漿中支鏈氨基酸濃度降低或胰島素濃度升高時，酶活性受到抑制。支鏈氨基酸相應的酮酸氧化可導致乙酰輔酶A和琥珀酰輔酶A生成，進而從根本上引發(fā)從頭合成非必需氨基酸、脂肪酸和碳骨架。纈氨酸在乳腺中可能除了合成蛋白質還參與包括氧化在內的代謝過程[17]。支鏈氨基酸的氧化改變可能與乳產(chǎn)量相關，但支鏈氨基酸氧化的量是否足以影響乳生成仍不得而知。

乳腺內氨基酸代謝為奶牛泌乳提供基礎，深入了解各氨基酸的代謝可指示機體整體狀況，或可指征疾病。代謝組學方法也為奶牛乳腺內氨基酸代謝研究提供便利，宏觀了解各氨基酸的代謝，從而為揭示各代謝通路提供依據(jù)[18]。

3奶牛乳腺氨基酸代謝相關信號通路

具有泌乳功能的基因既受自身表達調控，又受外部環(huán)境因素，如營養(yǎng)素、激素、溫度調節(jié)[19]。在奶牛乳腺內氨基酸的代謝涉及諸多信號通路，氨基酸應答(amino acid response，AAR)信號通路可感知氨基酸的平衡；兩面神激酶(Janus kinases,JAK)-信號轉導子與轉錄激活子(signal transducers and activators of transcription，STAT)信號通路主要調控乳蛋白的合成；AMP激活蛋白酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)信號通路掌控能量平衡；雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信號通路在氨基酸代謝、合成，糖脂代謝等方面均有重要作用，并且與諸多通路密切關聯(lián)。各信號通路如圖1所示。

AMPK：AMP激活蛋白酶 AMP-activated protein kinase；AMPKK：AMPK激酶 AMP-activated protein kinase kinase；eEF2：真核延長因子2 eukaryotic elongation factor 2；eEF2k：真核延長因子2激酶 eukaryotic elongation factor 2 kinase；NO：一氧化氮 nitric oxide；IRS1：胰島素受體底物1 insulin receptor substrate 1；PI3K：磷脂酰肌醇3激酶 phosphatidylinositol-3-kinase；Akt：蛋白激酶B protein kinase B；mTORC1：雷帕霉素靶蛋白復合物1 mammalian target of rapamycin complex 1；S6K1：核糖體S6蛋白激酶1 translational regulators S6 kinase 1；eIF2α：真核細胞翻譯啟動因子 eukaryotic translation initiation factor 2α；4E-BP1：真核細胞翻譯啟動因子4E結合蛋白1 eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein；tRNA：轉運RNA transfer1 RNA；GCN2：通用控制蛋白2 general control nonderepressible 2；ATF4：轉錄活化因子4 activating transcription factor 4；JAK2：兩面神激酶2 Janus kinase 2；STAT5：信號轉導子與轉錄激活因子5 signal transducer and activator of transcription 5。

圖1奶牛乳腺上皮細胞氨基酸代謝重要信號通路

Fig.1Pathways of amino acids metabolism in bovine mammary epithelial cells[20-23]

3.1通用控制蛋白2(general control nonderepressible 2，GCN2)信號通路

細胞通過感知胞內外氨基酸進而對其分配利用，維持其動態(tài)平衡狀態(tài)。GCN2是感知氨基酸缺乏的信號通路，當任何一種氨基酸缺乏時，AAR啟動，胞內氨基酸被分配循環(huán)利用，在營養(yǎng)限制條件下合成所需的蛋白質。GCN2與空載轉運RNA(tRNA)具有高親和性，當氨基酸充足時，氨基酸被連接到相應的tRNA上；當氨基酸缺乏時，GCN2則與空載tRNA相連引發(fā)構象改變，激活真核細胞翻譯啟動因子(eukaryotic translation initiation factor,eIF)2α[21]，抑制大多數(shù)蛋白質的合成，也特異性激活轉錄活化因子4(activating transcription factor 4，ATF4)，促進一些氨基酸代謝調控基因翻譯，如氨基酸轉運載體、氨基酸代謝酶、能量調節(jié)因子，調控細胞內氨基酸缺失應答。氨基酸的不平衡也會對糖脂代謝造成影響[24]。添加組氨酸和支鏈氨基酸可減少Mac-T細胞eIF2α磷酸化；盡管能夠使培養(yǎng)的乳腺組織中乳蛋白合成率改變，但并不影響組織塊中eIF2α的磷酸化[25]。體內試驗研究表明，支鏈氨基酸以及賴氨酸的缺乏會導致eIF2α表達上調。盡管在亮氨酸和賴氨酸缺乏條件下，eIF2α表達量得以維持，但乳蛋白產(chǎn)量下降說明存在其他因素調控賴氨酸和亮氨酸的代謝[26]。穩(wěn)態(tài)的維持是氨基酸代謝的重要過程，了解其機制有利于透徹認知氨基酸代謝。GCN2信號通路的研究目前常見于人類疾病如癌癥中，奶牛營養(yǎng)研究或可從營養(yǎng)缺乏角度提供研究思路。

3.2AMPK信號通路

AMPK信號通路在不同種類細胞中具有功能性調節(jié)細胞代謝以及協(xié)調幾種代謝應答的作用，可在細胞水平，甚至機體整體水平調控代謝能量平衡。泌乳期乳腺需要大量能量供應，AMPK信號通路起到關鍵作用，并調控奶牛脂肪代謝，在奶牛肝臟中也起到重要作用。Mahmoudi等[27]利用基因組學方法發(fā)現(xiàn)AMPKγ1基因上影響乳蛋白及乳產(chǎn)量的突變位點。AMPK通過真核延長因子(eukaryotic elongation factor 2，eEF2)激酶與mTOR抑制蛋白質合成。活化的AMPK可抑制mTOR及其效應器的活性[28]，并激活eEF2激酶，使eEF2磷酸化失活，從而抑制蛋白質的合成，減少ATP的損耗。其調控機制是AMPK的激活多發(fā)生在應激條件下，AMP/ATP，瘦素、脂聯(lián)素等激素以及AMPK激酶(AMPKK)對AMPK的激活均有調節(jié)作用[29]。在培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細胞中添加必需氨基酸可增加ATP濃度，抑制AMPK的磷酸化，影響乳蛋白合成[23]。此外，葡萄糖、乙酸等能量物質可通過AMPK-mTOR信號通路調控乳蛋白的生成[30]。能量可以作為衡量代謝程度的指標，通過AMPK信號通路研究有利于從能量水平揭示氨基酸代謝過程，為氨基酸代謝研究提供新思路。

3.3JAK-STAT信號通路

JAK-STAT信號通路參與生物體凋亡、生長、增殖及炎癥反應等多種生命活動。JAK與STAT包括多種激酶，在奶牛乳腺組織中的研究主要集中在JAK2-STAT5信號通路[11]。該通路是酪蛋白合成轉錄的重要通路，催乳素結合受體激活JAK2，JAK2使STAT5磷酸化，繼而引發(fā)酪蛋白合成轉錄。在多種動物細胞中已發(fā)現(xiàn)催乳素、生長激素、表皮生長因子、促紅細胞生成素等30種以上細胞因子能夠激活STAT蛋白[31]，但其激素激活機制仍待研究。氨基酸通過JAK2-STAT5信號通路調控乳生成，主要通過STAT5a基因調節(jié)乳蛋白的表達[32]。研究證實，蛋氨酸、亮氨酸以及賴氨酸在奶牛乳腺上皮細胞泌乳過程中起重要調節(jié)作用，能夠調節(jié)乳蛋白合成信號通路中的關鍵蛋白表達，從而提高奶牛乳腺上皮細胞的增殖能力以及乳糖、乳脂和乳蛋白合成[33-34]。最新研究表明，蛋氨酸-蛋氨酸二肽通過JAK-STAT信號通路影響乳蛋白的合成[35]。JAK-STAT信號通路對免疫應答也有著重要調控作用，對于該信號通路有待更多的探索。

3.4mTOR信號通路

mTOR信號通路是奶牛乳腺氨基酸代謝的重要通路，不僅調控乳蛋白合成也感知氨基酸豐度，同時還關聯(lián)其他代謝通路。mTOR復合物1(mTORC1)對雷帕霉素敏感，主要控制蛋白質合成、脂肪合成、能量代謝和自噬等多種細胞生命活動，是乳腺氨基酸代謝通路中的關鍵調控點。其活性受生長因子、激素、能量以及氨基酸調控，生長因子、激素的調控機制已經(jīng)得到確定，均通過磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)-蛋白激酶B(Akt)-mTOR通路刺激乳蛋白生成[36]，而氨基酸調控機制仍有待進一步確定。

3.4.1氨基酸感知及調控

mTORC1對各種氨基酸敏感度不同，對亮氨酸最為敏感。不同于GCN2信號通路可以感知任何一種氨基酸的缺乏，mTOR只感受幾種特定氨基酸的存在，即在氨基酸充足時通路才會被激活。研究發(fā)現(xiàn)，亮氨酸、精氨酸以及組氨酸對酪蛋白基因翻譯調控以及mTOR通路上相關基因的表達都起到重要作用[37-38]。并且不同氨基酸激活mTOR通路的同時也存在互作。在培養(yǎng)的奶牛乳腺組織中添加異亮氨酸和蘇氨酸均可影響mTOR的磷酸化，但兩者的作用卻是相抵抗的，異亮氨酸增加核糖體蛋白S6的磷酸化，而蘇氨酸則可抑制該效果[39]。雖然已有諸多關于氨基酸調控mTOR的研究，但氨基酸感知及調控mTORC1的分子機制至今仍不明確。mTORC1雖對于氨基酸水平的改變高度敏感，但卻不是氨基酸受體。SLC38A9作為一種氨基酸轉運受體，不僅具有轉運氨基酸進出細胞以及溶酶體等細胞器的功能，還可感知氨基酸，可以使mTORC1感知精氨酸[40]。而谷氨酰胺刺激mTORC1激活則依賴于溶酶體和空泡H+-ATP酶(V-ATPase)的活性，這與感知亮氨酸的方式不同[41]，可見mTOR感受氨基酸的機制較為復雜。氨基酸增強乳蛋白的合成與mTOR及其下游信號真核細胞翻譯啟動因子4E結合蛋白1(eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein，4E-BP1)和核糖體S6蛋白激酶(translational regulators S6 kinase 1，S6K1)的磷酸化相關。Appuhamy等[42]發(fā)現(xiàn)，必需氨基酸增強mTOR通路上mTOR、S6K1、4EBP1以及胰島素受體底物(insulin receptor substrate 1，IRS1)的磷酸化，并且對于調控蛋白質合成翻譯起始和延長過程中各控制點的作用強于胰島素。相關體內試驗也表明，調控蛋白質合成的細胞信號分子對于營養(yǎng)性刺激的應答是不同的[43]。

3.4.2小肽調控

除氨基酸外，小肽也可通過mTOR信號通路調控乳蛋白合成。Yang等[44]在培養(yǎng)的奶牛乳腺組織中添加蛋氨酸-蛋氨酸二肽替換蛋氨酸發(fā)現(xiàn)，αs1酪蛋白基因表達量可顯著升高，并且mTOR通路上的關鍵基因表達量也顯著增加。小肽逐漸成為近年研究熱點，在奶牛營養(yǎng)研究中功能性作用日趨被發(fā)現(xiàn)，該試驗研究也為乳蛋白合成研究提供理論基礎。但目前對于小肽調控mTOR通路的機制仍有許多未知，需更進一步研究。

4小結

乳腺內氨基酸代謝極其復雜，在不同生理狀況、不同環(huán)境影響等條件下，GCN2、AMPK、JAK-STATE、mTOR等信號通路通過對氨基酸進行相應的感知反饋，在乳腺氨基酸代謝利用中均發(fā)揮重要作用。此外，環(huán)單磷酸鳥苷依賴性激酶(cGMP-dependent kinase)、環(huán)一磷酸腺苷依賴性激酶(cAMP-dependent kinase)等信號通路以及一些氣體分子如硫化氫也可能調控奶牛乳腺代謝。對奶牛乳腺氨基酸代謝信號通路分子機理的揭示，將有助于闡明奶牛乳腺中乳蛋白代謝機制，為提高奶牛及其他家畜的生產(chǎn)效率，提供最優(yōu)化營養(yǎng)調控策略提供依據(jù)，并將對奶牛生產(chǎn)產(chǎn)生深遠影響。

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(責任編輯王智航)

Amino Acids Metabolism and Signaling Pathways in Bovine Mammary Gland

LIU LanLIU Hongyun*LIU Jianxin*

(Key Laboratory of Molecular Animal Nutrition of Ministry of Education, Institute of Dairy Science,Zhejiang University, Hangzhou 310058, China)

Abstract:The mammary gland is the most important organ to produce milk in dairy cows. The metabolism of nutrients in the mammary gland is related to the quality of milk. Much attention has been paid to milk protein. Amino acids are not only building blocks of milk protein but also key regulators of metabolic pathways in the mammary gland of dairy cows. The metabolism of amino acids in the mammary gland involves a number of signaling pathways which will modulate the mechanism at cellular molecular level. Knowledge of these pathways will provide the theoretical foundation for modulating the nutrition of dairy cows. In this review, the metabolism of amino acids and the main signaling pathway in the mammary gland of dairy cows were introduced, and their relationship to nutrition was also discussed.[Chinese Journal of Animal Nutrition, 2016, 28(2)：345-352]

Key words:bovine mammary gland; amino acids metabolism; signaling pathway

*Corresponding authors: LIU Hongyun, associate professor, E-mail: hyliu@zju.edu.cn; LIU Jianxin, professor, E-mail: liujx@zju.edu.cn

中圖分類號：S852.2

文獻標識碼：A

文章編號：1006-267X(2016)02-0345-08

作者簡介：劉蘭(1990—)，女，黑龍江哈爾濱人，博士研究生，從事分子營養(yǎng)學研究。E-mail: liulan11279@163.com*通信作者：劉紅云，副教授，博士生導師，E-mail: hyliu@zju.edu.cn;劉建新，教授，博士生導師，E-mail: liujx@zju.edu.cn

基金項目：國家奶牛產(chǎn)業(yè)技術體系(CARS-37);國家自然科學基金(31372336)

收稿日期：2015-08-25

doi：10.3969/j.issn.1006-267x.2016.02.006