董利鋒　YAN Tianhai　屠　焰　刁其玉*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，北京奶牛營養(yǎng)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部飼料生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100081；

2.農(nóng)業(yè)食品與生物科學(xué)研究所,希爾斯伯勒 BT26 6DR)

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中紅外光譜技術(shù)在牛奶營養(yǎng)物質(zhì)預(yù)測及奶牛相關(guān)特性分析上的應(yīng)用

董利鋒1YAN Tianhai2屠焰1刁其玉1*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，北京奶牛營養(yǎng)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部飼料生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100081；

2.農(nóng)業(yè)食品與生物科學(xué)研究所,希爾斯伯勒 BT26 6DR)

摘要：近年來，許多研究表明采用中紅外光譜(MIRS)分析技術(shù)能夠?qū)εＤ讨懈鳡I養(yǎng)物質(zhì)(如脂肪酸、蛋白質(zhì)和礦物質(zhì))及潛在的有害物質(zhì)(如摻雜物、抗生素)進(jìn)行實(shí)時(shí)、快速和準(zhǔn)確地定量分析，并以此建立預(yù)測模型來對奶牛的營養(yǎng)(如飼料轉(zhuǎn)化率、能量利用效率和甲烷排放)、健康(如乳房炎和代謝性疾病)和生殖生理與繁殖狀況進(jìn)行鑒定、評估和篩選，從而為優(yōu)化畜牧養(yǎng)殖業(yè)生產(chǎn)方式，發(fā)展創(chuàng)新畜牧養(yǎng)殖業(yè)循環(huán)經(jīng)濟(jì)模式，實(shí)現(xiàn)低碳、健康和可持續(xù)發(fā)展提供有效的技術(shù)保障。因此本文主要就近年來國際上最新的關(guān)于MIRS分析技術(shù)在牛奶營養(yǎng)物質(zhì)測定及奶牛相關(guān)特性分析方面的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

關(guān)鍵詞：中紅外光譜；預(yù)測模型；牛奶成分；奶牛

自2008年三聚氰胺事件以來，傳統(tǒng)的牛奶及奶制品檢測手段的弊端逐漸顯現(xiàn)出來。常用的檢測手段如凱氏定氮法不能對牛奶中非蛋白質(zhì)類含氮物質(zhì)(尿素氮、游離氨氮、無機(jī)氨鹽等)進(jìn)行有效鑒定[1]。其他的如考馬斯亮藍(lán)法和分光光度計(jì)法雖然可以進(jìn)行定量分析，但與上述方法一樣，分析測定過程中對儀器設(shè)備要求較高，分析步驟較為耗時(shí)和繁瑣，無法滿足實(shí)驗(yàn)室之外的快速準(zhǔn)確測定。牛奶及奶制品中脂肪的測定方法既有傳統(tǒng)的索氏抽提法、哥特里-羅紫法、蓋勃氏法和巴布科克法，也有氣相色譜法、高效液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)法等[2]。但這些方法或準(zhǔn)確度較低或由于分析過程復(fù)雜耗時(shí)，都往往局限于實(shí)驗(yàn)室樣品的小規(guī)模分析，而未能在生產(chǎn)實(shí)踐中得到廣泛使用。近年來，越來越多的研究表明，使用中紅外光譜(mid-infrared spectrometry，MIRS)分析技術(shù)能夠?qū)εＤ讨懈鞣N營養(yǎng)成分如蛋白質(zhì)、脂肪酸、礦物質(zhì)及潛在的有害物質(zhì)進(jìn)行實(shí)時(shí)、快速和準(zhǔn)確地定量分析[3-6]。與傳統(tǒng)的化學(xué)分析方法相比，MIRS分析方法對樣品處理的要求不高，無需化學(xué)試劑，能夠快速無損的檢測樣品中各成分的含量。除此之外，通過使用MIRS技術(shù)對牛奶中特定物質(zhì)建立預(yù)測模型，能夠快速準(zhǔn)確地分析和鑒定奶牛的營養(yǎng)(如飼料轉(zhuǎn)化率、能量利用效率和甲烷排放)、健康[如乳房炎和代謝性疾病(酮病等)]和生殖生理與繁殖狀況。

近年來，國際上越來越多的國家和組織通過收集和共享大量的奶牛試驗(yàn)及實(shí)際生產(chǎn)數(shù)據(jù)，采用MIRS分析技術(shù)來考察不同品種及遺傳能力、飼養(yǎng)水平和管理環(huán)境下牛奶中各營養(yǎng)物質(zhì)成分，進(jìn)而來實(shí)現(xiàn)對奶牛營養(yǎng)、健康和生殖狀況的預(yù)測和鑒定[7-9]。歐盟RobustMilk項(xiàng)目(2008—2012年)通過采用MIRS分析技術(shù)來定量分析牛奶中脂肪酸、蛋白質(zhì)和糖類的含量，并結(jié)合基因組分析技術(shù)來改善牛奶中特定營養(yǎng)成分的含量，從而提高牛奶及其制品的附加值[7]。作為歐盟區(qū)域性發(fā)展項(xiàng)目的一部分，歐洲6個(gè)國家(比利時(shí)、英國、愛爾蘭、德國、法國和盧森堡)的3個(gè)研究中心和11所牛奶測定組織于2011年聯(lián)合采用MIRS技術(shù)對牛奶中脂肪酸、蛋白質(zhì)、尿素含量以及體細(xì)胞數(shù)進(jìn)行定量分析，通過建立牛奶中特定成分的預(yù)測模型來對奶牛懷孕情況、健康狀況以及能量利用情況進(jìn)行快速檢測和篩選，提高奶牛生產(chǎn)過程中的管理和盈利能力[8]。在法國，由農(nóng)戶、育種公司、牛奶記錄組織和政府科研部門組成的PhenoFinlait項(xiàng)目也通過對大規(guī)模牛奶樣品進(jìn)行MIRS分析，建立起牛奶中各營養(yǎng)物質(zhì)的預(yù)測模型，為奶牛的營養(yǎng)調(diào)控和基因繁育提供依據(jù)[9]。目前，國內(nèi)采用MIRS分析技術(shù)對牛奶中各營養(yǎng)物質(zhì)含量進(jìn)行定量分析的研究尤為鮮見，通過MIRS分析技術(shù)來實(shí)現(xiàn)對奶牛自身營養(yǎng)、健康、生育等情況的檢測和分析還未見報(bào)道。本文將首先對MIRS分析技術(shù)的基本原理和測定方法進(jìn)行介紹。其次對近年來使用此技術(shù)建立牛奶中各營養(yǎng)物質(zhì)的預(yù)測模型以及在鑒定和篩選奶牛營養(yǎng)、健康、生育等方面的最新進(jìn)展進(jìn)行綜述，旨在為深入認(rèn)識(shí)MIRS技術(shù)在科學(xué)研究及生產(chǎn)實(shí)踐中的有效應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1MIRS分析技術(shù)的基本原理和數(shù)據(jù)處理

1.1基本原理

紅外光譜處于可見光區(qū)和微波光區(qū)之間，根據(jù)其波長通?？梢詫⒓t外光譜分為3個(gè)區(qū)：近紅外光區(qū)(0.75～2.50 μm)、中紅外光區(qū)(2.50～25.00 μm)和遠(yuǎn)紅外光區(qū)(25.00～1 000.00 μm)。中紅外區(qū)的波數(shù)范圍在400～4 000 cm-1之間，是絕大多數(shù)有機(jī)物和無機(jī)離子的基頻吸收帶。由于基頻振動(dòng)是紅外光譜中吸收能力最強(qiáng)的振動(dòng)，所以中紅外區(qū)也被認(rèn)為是最適于進(jìn)行紅外光譜定性和定量分析的區(qū)域。因此，借助現(xiàn)代化學(xué)計(jì)量學(xué)方法和計(jì)算機(jī)技術(shù)，MIRS分析技術(shù)能夠?qū)Υ郎y樣品中有機(jī)分子的組成和含量進(jìn)行快速、準(zhǔn)確、無損地分析，在科學(xué)研究和生產(chǎn)實(shí)踐中都有廣泛的應(yīng)用。

MIRS分析技術(shù)能夠通過考察和分析被測物質(zhì)在中紅外區(qū)域內(nèi)特定的吸收特征來進(jìn)行定性或定量分析。定性分析一般是將樣品的中紅外譜圖與標(biāo)準(zhǔn)的譜圖進(jìn)行對照，通過分析吸收峰的位置、形狀以及相對強(qiáng)度來判定是否為該標(biāo)準(zhǔn)物；定量分析則是根據(jù)朗伯-比耳定律，通過對試樣特征吸收譜帶強(qiáng)度的測定來測定組分的含量，其流程如圖1所示。其分析方法的主要步驟如下：1)收集和選擇有代表性的樣本做校正集，測定其MIRS數(shù)據(jù)；2)采用標(biāo)準(zhǔn)或者廣泛認(rèn)可的參考方法測定校正集樣本的化學(xué)分析值；3)利用校正集光譜及其化學(xué)分析數(shù)據(jù)，采用合理的化學(xué)計(jì)量學(xué)方法建立校正模型；4)利用驗(yàn)證集樣本光譜和參考方法得到的數(shù)據(jù)來驗(yàn)證校正模型的準(zhǔn)確度，選擇最優(yōu)校正模型；5)模型確立后，通過樣品的光譜數(shù)據(jù)來預(yù)測其組成和含量。在使用MIRS分析技術(shù)建立樣品中特定成分最佳預(yù)測模型過程中，有很多的因素會(huì)影響最終的預(yù)測準(zhǔn)確度。例如，從不同地區(qū)、品種、飼喂管理方式收集到的牛奶樣品中，脂肪酸和蛋白質(zhì)含量會(huì)有所不同。不同的光譜分析儀器會(huì)在圖譜數(shù)據(jù)收集過程中產(chǎn)生誤差，而校正集的化學(xué)分析數(shù)據(jù)容易受到不同測定方法的影響。其中，圖譜數(shù)據(jù)預(yù)處理方法的選擇是影響預(yù)測模型準(zhǔn)確度的重要因素。

1.2數(shù)據(jù)預(yù)處理

在MIRS定量分析過程中，結(jié)果的可靠性首先取決于光譜數(shù)據(jù)及化學(xué)測定值的準(zhǔn)確性。通過判別和剔除MIRS和化學(xué)分析中的異常值能夠排除非有效值的干擾，提高預(yù)測模型的準(zhǔn)確度。但此時(shí)的圖譜數(shù)據(jù)中除了包含樣品自身的有效信息之外，還存在光譜隨機(jī)噪聲、基線漂移、干擾組分背景光譜與測定環(huán)境背景等其他干擾信息，這些都難以通過剔除異常值這種方法來對干擾數(shù)據(jù)進(jìn)行排除。因此，在使用化學(xué)計(jì)量學(xué)建立預(yù)測模型之前，通過對全圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)處理或變換，減弱以至于消除各種非目標(biāo)因素對光譜的影響，可以簡化后續(xù)建模處理運(yùn)算過程，顯著提高預(yù)測準(zhǔn)確度[6]。導(dǎo)數(shù)運(yùn)算如一階導(dǎo)數(shù)和二階導(dǎo)數(shù)可以降低光譜峰偏移和漂移，提高圖譜分辨率。多元散射校正可以消除多重光譜偏差，減小試驗(yàn)過程中樣品顆粒尺寸、均勻性等因素對紅外光譜的影響。其他的處理方式如標(biāo)準(zhǔn)正則變換技術(shù)可以有效降低不需要的光譜干擾以利于分析信號(hào)的解析；歸一化可以同時(shí)消除絕對強(qiáng)度及光散射的影響。

圖1　利用MIRS技術(shù)進(jìn)行定量分析的基本流程

De Marchi等[10]利用氣相色譜法和MIRS分析技術(shù)對267份瑞士棕牛牛奶樣品中的脂肪酸組成和含量進(jìn)行了測定，在采用偏最小二乘法建立預(yù)測模型之前，除了采用未經(jīng)處理的圖譜數(shù)據(jù)之外，也比較了另外4種不同的圖譜處理方法：一階導(dǎo)數(shù)、二階導(dǎo)數(shù)、歸一化和多重散射矯正加一階導(dǎo)數(shù)。試驗(yàn)證明，圖譜數(shù)據(jù)經(jīng)過一階導(dǎo)數(shù)和多重散射矯正加一階導(dǎo)數(shù)處理之后，建立的預(yù)測模型具有最好的預(yù)測準(zhǔn)確度。其中經(jīng)過一階導(dǎo)數(shù)預(yù)處理之后預(yù)測模型對C12∶0和C14∶0的交互驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)分別為0.75和0.77。采用多重散射矯正加一階導(dǎo)數(shù)處理的預(yù)測模型對C8∶0和長鏈脂肪酸的交互驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)分別為0.74和0.76。Bonfatti等[11]對西門塔爾奶牛樣品中的總蛋白、酪蛋白、乳清蛋白及其他各組成成分和含量進(jìn)行MIRS分析時(shí)，比較了一階導(dǎo)數(shù)和二階導(dǎo)數(shù)圖譜預(yù)處理方法對預(yù)測準(zhǔn)確度的影響。試驗(yàn)結(jié)果與De Marchi等[6]的發(fā)現(xiàn)類似，MIRS譜圖經(jīng)一階導(dǎo)數(shù)預(yù)處理之后，由改進(jìn)的偏最小二乘回歸法建立的預(yù)測模型的準(zhǔn)確度能夠得到顯著提高。Soyeurt等[12]對比利時(shí)、愛爾蘭和英國3個(gè)國家共1 609個(gè)牛奶樣品中脂肪酸的組成和含量進(jìn)行了MIRS分析。與未經(jīng)處理的圖譜數(shù)據(jù)得到的預(yù)測模型相比，采用一階導(dǎo)數(shù)處理圖譜數(shù)據(jù)能夠得到更好的預(yù)測模型和更高的準(zhǔn)確度，也具有最高的交互驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)。Soyeurt等[13]采用更大量的數(shù)據(jù)(2 499個(gè))來考察6種不同圖譜預(yù)處理方法對建立牛奶中乳鐵蛋白預(yù)測模型準(zhǔn)確度的影響。與Soyeurt等[12]的結(jié)果類似，圖譜數(shù)據(jù)經(jīng)過導(dǎo)數(shù)處理之后能夠得到最好的預(yù)測模型，其中交互驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)能夠達(dá)到0.72。

2牛奶中脂肪酸的分析

牛奶中含有豐富的飽和脂肪酸(70%)、單不飽和脂肪酸(25%)和多不飽和脂肪酸(5%)[14]。這些脂肪酸的含量和組成受到奶牛品種、遺傳性能和飼養(yǎng)管理模式的影響[15-16]。因此，實(shí)時(shí)快速地獲取牛奶中脂肪酸的組成和含量信息能夠?yàn)槟膛５挠行юB(yǎng)殖和管理提供依據(jù)，提高奶牛養(yǎng)殖行業(yè)的盈利能力。傳統(tǒng)上采用的氣相色譜法雖能夠得到牛奶中脂肪及脂肪酸組成和含量較為準(zhǔn)確的結(jié)果[17]，但由于其分析所需材料較多，分析步驟較為耗時(shí)和繁瑣，往往局限于實(shí)驗(yàn)室分析，而不能滿足大規(guī)模樣品的測定和數(shù)據(jù)采集。近年來，越來越多的研究表明，牛奶中脂肪酸的組成和含量能夠采用MIRS分析技術(shù)來進(jìn)行快速、準(zhǔn)確和無損分析。在建立牛奶中脂肪酸的預(yù)測模型時(shí)，其準(zhǔn)確度容易受到待測物質(zhì)含量、表示單位以及選用的化學(xué)計(jì)量學(xué)模型的影響[3,18-19]。

Soyeurt等[3]采用MIRS技術(shù)對比利時(shí)6個(gè)不同品種275頭奶牛牛奶樣品中的脂肪酸進(jìn)行定量分析，并在紅外光譜的1 736～1 805 cm-1和2 823～3 016 cm-1波數(shù)區(qū)建立預(yù)測模型，結(jié)果顯示該預(yù)測模型具有較高的預(yù)測準(zhǔn)確度，且預(yù)測模型的準(zhǔn)確度與待測成分在牛奶樣品中的含量呈正比。例如，對于單獨(dú)的脂肪酸，分別由MIRS分析技術(shù)和氣相色譜法獲得的數(shù)據(jù)之間的相關(guān)系數(shù)最高可達(dá)0.95，其中牛奶中含量較高的C12∶0、C14∶0、C16∶0和C18∶1的相關(guān)系數(shù)均大于0.90，而含量較低的C10∶1cis-9和C14∶1cis-9的相關(guān)系數(shù)較低，分別為0.05和0.12；對于脂肪酸組成，飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸的相關(guān)系數(shù)最高，分別為0.98和0.89，而含量較低的多不飽和脂肪酸的相關(guān)系數(shù)則為0.43。Soyeurt等[12]還收集了比利時(shí)、愛爾蘭和英國1 060個(gè)MIRS數(shù)據(jù)，分別采用6種不同的圖譜預(yù)處理方式建立牛奶中脂肪酸含量(g/dL)的預(yù)測模型，發(fā)現(xiàn)牛奶中含量較高的C4∶0、C6∶0、C8∶0、C10:0和C12:0的交互驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)在0.88～0.95之間，外部驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)為0.82～0.90。飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸的交互驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)分別為0.99和0.97，外部驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)分別為0.98和0.96，具有較高的預(yù)測準(zhǔn)確度，能夠在對牛奶的特異性選擇過程中發(fā)揮重要作用。隨后，Rutten等[18]采用荷蘭3 622個(gè)牛奶樣品進(jìn)行MIRS和氣相色譜法分析時(shí)，對牛奶中16種單獨(dú)脂肪酸和4類脂肪酸組建立預(yù)測模型。結(jié)果顯示，預(yù)測模型的準(zhǔn)確度與待測物質(zhì)的表示單位有關(guān)。當(dāng)以單位體積牛奶中含量(g/dL)為表示單位時(shí)，C4∶0、C6∶0 C8∶0和C10∶0的相關(guān)系數(shù)分別為0.91、0.96、0.94和0.92；脂肪酸組預(yù)測模型的相關(guān)系數(shù)在0.91～0.97之間，預(yù)測準(zhǔn)確度顯著高于以占總脂肪的含量(%)為表示單位的預(yù)測能力。De Marchi等[10]結(jié)合MIRS技術(shù)和氣相色譜法對1 200頭瑞士棕牛牛奶中的脂肪酸進(jìn)行定量分析，比較了不同表示單位的單獨(dú)脂肪酸和脂肪酸組預(yù)測模型的準(zhǔn)確度。結(jié)果表明，以單位質(zhì)量牛奶中含量為表示單位(g/kg)的模型具有較高的預(yù)測精度，其中C18∶0、C10∶0和 C12∶0的交互驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)分別為0.74、0.73和0.74；脂肪酸組的交互驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)在0.63～0.76之間。在此試驗(yàn)中，預(yù)測模型的準(zhǔn)確度略低，原因可能是動(dòng)物品種和樣品來源較為單一，原始數(shù)據(jù)缺乏多樣性，限制了預(yù)測模型的預(yù)測范圍。Ferrand等[19]從4個(gè)不同品種的奶牛中收集了317個(gè)牛奶樣品，通過使用MIRS技術(shù)來比較2種不同化學(xué)計(jì)量學(xué)模型(偏最小二乘法與遺傳算法加偏最小二乘法)對脂肪酸預(yù)測模型準(zhǔn)確度的影響，發(fā)現(xiàn)采用偏最小二乘法能夠快速建立預(yù)測模型，其對C4∶0、C6∶0、C8∶0、C10∶0和C12∶0的外部驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)在0.82～0.95之間，飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸的外部驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)分別為0.97和0.89；采用基因算法加偏最小二乘法獲得的預(yù)測模型能夠略微提高預(yù)測準(zhǔn)確度，如飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸的外部驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)分別為0.98和0.91。但由于基因算法計(jì)算步驟較為繁瑣，耗時(shí)較長，在實(shí)踐生產(chǎn)中采用MIRS分析技術(shù)時(shí)常用偏最小二乘法來建立預(yù)測模型。另外，Maurice-Van Eijndhoven等[20]從24 445頭奶牛中收集41 404個(gè)牛奶樣品來建立脂肪酸(g/dL)的MIRS預(yù)測模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)預(yù)測模型能夠得到較高的預(yù)測準(zhǔn)確度，但不同品種奶牛牛奶中脂肪酸含量存在差異。因此，采用MIRS分析技術(shù)對牛奶中脂肪酸進(jìn)行測定時(shí)，無論是單獨(dú)的脂肪酸還是脂肪酸組(飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸以及多不飽和脂肪酸)，其預(yù)測模型的準(zhǔn)確度與待測物質(zhì)在牛奶中的含量呈正比，且顯著高于傳統(tǒng)的氣相色譜分析方法。同時(shí)，當(dāng)脂肪酸以單位質(zhì)量牛奶含量為表示單位時(shí)，其預(yù)測模型的相關(guān)系數(shù)顯著高于以單位體積牛奶含量為表示單位的相關(guān)系數(shù)。另外，化學(xué)計(jì)量學(xué)模型、脂肪酸測定的樣本量等因素也都會(huì)對預(yù)測模型的準(zhǔn)確度產(chǎn)生影響。

3牛奶中蛋白質(zhì)的分析

牛奶具有較高的營養(yǎng)價(jià)值，其中酪蛋白(κ-酪蛋白、αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白和β-酪蛋白)和乳清蛋白(α-乳白蛋白和β-乳球蛋白)分別約占牛奶蛋白質(zhì)總量的80%和20%。傳統(tǒng)的牛奶蛋白質(zhì)成分檢測以化學(xué)分析方法為主，如液相色譜法、毛細(xì)管電泳法和毛細(xì)管等電聚焦電泳。但近年來的研究證明MIRS分析技術(shù)不僅能夠無損地對樣品進(jìn)行測定，而且還能縮短測定時(shí)間，提高測定準(zhǔn)確度[21-25]。

Etzion等[21]通過確定牛奶中蛋白質(zhì)在MIRS中的特定吸收區(qū)域(1 500～1 700 cm-1和1 060～1 100 cm-1)來建立預(yù)測模型，結(jié)果證明該模型的預(yù)測誤差較低，能夠滿足對牛奶中蛋白質(zhì)含量進(jìn)行快速準(zhǔn)確測定的要求。De Marchi等[22]使用反向液相色譜和MIRS分析技術(shù)研究西門塔爾奶牛1 336個(gè)牛奶樣品中蛋白質(zhì)組分和含量，通過偏最小二乘法建立定量預(yù)測模型，結(jié)果表明，預(yù)測模型中總蛋白和酪蛋白含量的預(yù)測值與化學(xué)分析值的相關(guān)系數(shù)為0.58，交互驗(yàn)證均方根誤差分別為3.11和2.76 g/L；乳清蛋白、αS1-酪蛋白和β-乳球蛋白的相關(guān)系數(shù)在0.50～0.58之間，交互驗(yàn)證均方根誤差分別為0.51、1.07和0.43 g/L，具有較高的預(yù)測準(zhǔn)確度。但是由于α-乳白蛋白在牛奶中的總含量較低，其相關(guān)系數(shù)僅為0.29，模型的預(yù)測準(zhǔn)確度較低。這個(gè)結(jié)果與Soyeurt等[3]和Rutten等[18]在利用MIRS技術(shù)定量預(yù)測牛奶中脂肪酸含量的結(jié)果類似，研究都發(fā)現(xiàn)預(yù)測模型的預(yù)測精度與待測物質(zhì)在牛奶樣品中的含量呈線性相關(guān)關(guān)系。Bonfatti等[11]采用MIRS技術(shù)得到西門塔爾牛牛奶樣品中13種蛋白質(zhì)成分的光譜圖并建立定量預(yù)測模型，發(fā)現(xiàn)總蛋白、酪蛋白、乳清蛋白、αS1-酪蛋白和β-乳球蛋白的相關(guān)系數(shù)分別為0.80、0.79、0.65、0.69和0.67，預(yù)測準(zhǔn)確度高于De Marchi等[22]的結(jié)果。另外，此研究發(fā)現(xiàn)在對樣品中含量較低的α-乳白蛋白建立預(yù)測模型之前，對原始光譜進(jìn)行預(yù)處理(一階導(dǎo)數(shù)或二階導(dǎo)數(shù))能夠有效提高預(yù)測精度，其相關(guān)系數(shù)(0.39)較De Marchi等[22]的結(jié)果(0.29)得到了顯著提高。與采用MIRS分析技術(shù)對牛奶中脂肪酸進(jìn)行預(yù)測分析時(shí)類似，牛奶中蛋白質(zhì)的MIRS預(yù)測模型準(zhǔn)確度同樣的會(huì)受到待測物質(zhì)表示單位的影響。Rutten等[23]分別采用毛細(xì)管區(qū)帶電泳法和MIRS法對荷斯坦奶牛5 545個(gè)牛奶樣品中10項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行化學(xué)和圖譜分析，首次嘗試采用以占總蛋白含量(%)為表示單位來建立牛奶中各蛋白質(zhì)成分的定量預(yù)測模型，結(jié)果顯示預(yù)測模型對酪蛋白、乳清蛋白和β-乳球蛋白的預(yù)測準(zhǔn)確度較低，相關(guān)系數(shù)分別為0.25、0.53和0.56。而以往的試驗(yàn)多采用以單位體積牛奶含量(g/dL)為表示單位來獲得較高的相關(guān)系數(shù)(>0.90)和預(yù)測準(zhǔn)確度[22,24]。

牛奶中乳鐵蛋白可增強(qiáng)鐵的傳遞和吸收，具有光譜的抑菌性等許多獨(dú)特的生理調(diào)節(jié)作用。在采用免疫酶聯(lián)吸附法測定牛奶中乳鐵蛋白含量時(shí)，樣品需要預(yù)處理且操作步驟較為繁瑣；高效液相色譜法對待測樣品的純度有較高的要求，設(shè)備也較昂貴[26]。Soyeurt等[25]嘗試采用MIRS分析技術(shù)對475頭奶牛的1 609個(gè)牛奶樣品進(jìn)行定量分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)牛奶中乳鐵蛋白預(yù)測模型的相關(guān)系數(shù)為0.83，交互驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)為0.75，較傳統(tǒng)的免疫酶聯(lián)吸附法具有更高的測定精度。Soyeurt等[13]使用中MIRS技術(shù)和免疫酶聯(lián)吸附法對愛爾蘭、蘇格蘭和比利時(shí)3個(gè)地區(qū)共2 499個(gè)牛奶樣品進(jìn)行分析，采用6種不同圖譜預(yù)處理方法之后利用內(nèi)部交互驗(yàn)證集和外部驗(yàn)證集來考察預(yù)測模型的準(zhǔn)確度。試驗(yàn)證明，預(yù)測模型中牛奶中乳鐵蛋白具有較高的相關(guān)系數(shù)(0.69～0.74)。此外，由于實(shí)際生產(chǎn)中常用體細(xì)胞數(shù)量作為評判奶牛乳房炎以及免疫情況的指標(biāo)，而牛奶中乳鐵蛋白也有奶牛免疫系統(tǒng)有關(guān)[27]。因此，作者還發(fā)現(xiàn)將得到的乳鐵蛋白預(yù)測模型與牛奶中體細(xì)胞數(shù)量的測定方程相結(jié)合，也能夠?qū)δ膛Ｈ榉垦装l(fā)病情況進(jìn)行快速準(zhǔn)確地鑒定和篩選。一般來說，采用MIRS分析技術(shù)對牛奶中蛋白質(zhì)建立預(yù)測模型進(jìn)行定量分析時(shí)，其預(yù)測模型的準(zhǔn)確度與待測蛋白質(zhì)成分在牛奶中的含量呈正比。與此同時(shí)，與采用MIRS分析技術(shù)定量測定牛奶中脂肪酸含量相同，待測成分采用不同的表示單位能夠影響其預(yù)測準(zhǔn)確度。因此，與傳統(tǒng)的液相色譜和免疫酶聯(lián)吸附法相比，MIRS分析技術(shù)能夠顯著提高預(yù)測精度及測定效率。同時(shí)，將MIRS定量分析模型與其他測定方程相結(jié)合，能夠?qū)崿F(xiàn)對奶牛整體健康狀況等方面的鑒定和篩選，有效改善奶牛養(yǎng)殖管理模式，提升奶牛養(yǎng)殖企業(yè)的盈利能力，從而實(shí)現(xiàn)整個(gè)養(yǎng)殖行業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。

4牛奶中礦物質(zhì)及其他潛在有害物質(zhì)的分析

牛奶中除了含有優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)和脂肪酸之外，還有非常豐富的礦物質(zhì)元素、微量元素和維生素等。在對牛奶中這些物質(zhì)檢測時(shí)，MIRS分析技術(shù)憑借其快速、無損的特性迅速成為近年來研究的熱點(diǎn)。Soyeurt等[4]以6個(gè)不同品種奶牛的1 543個(gè)牛奶為樣品，用原子吸收法和MIRS對牛奶中鈣、鈉、磷、鉀和鎂的含量進(jìn)行定量分析，結(jié)果表明，MIRS對鈣、鈉和磷具有較高的預(yù)測能力，其相關(guān)系數(shù)分別為0.96、0.83和0.99，結(jié)果與Toffanin等[28]結(jié)果類似；對鉀和鎂的預(yù)測模型的準(zhǔn)確度略低，交互驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)分別為0.76和0.85。Stocco等[29]采用MIRS對5個(gè)種群共173頭水牛奶中的鈣、磷、鎂和鉀元素含量進(jìn)行定量分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)預(yù)測模型的預(yù)測值和分析值的相關(guān)系數(shù)分別為0.71、0.70、0.72和0.55，進(jìn)一步表明MIRS能夠?qū)Σ煌淘粗械牡V物質(zhì)元素進(jìn)行較為準(zhǔn)確地定量分析。此外，Wu等[30]比較了近紅外光譜(near-infrared spectroscopy，NIRS)和MIRS技術(shù)對奶粉中鈣含量預(yù)測模型的準(zhǔn)確度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，樣品在MIRS(671～3 698 cm-1)光譜區(qū)具有較好的吸收能力，相關(guān)系數(shù)為0.94，顯著高于由NIRS建立的預(yù)測模型(相關(guān)系數(shù)為0.64)。

在實(shí)際生產(chǎn)中，除了需要對牛奶中營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行定量檢測之外，還需要對乳品摻假、藥物殘留等方面進(jìn)行實(shí)時(shí)鑒定和分析。但基于色譜、質(zhì)譜、免疫、微生物等方法建立起來的檢測手段過程繁瑣復(fù)雜、鑒定成本高，難以達(dá)到快速有效準(zhǔn)確地判定。近年來越來越多的研究表明MIRS技術(shù)對摻假牛奶進(jìn)行定量分析的準(zhǔn)確度更高，能夠達(dá)到實(shí)時(shí)快速的鑒定和分析[31-33]。Sivakesava等[31]使用NIRS和MIRS技術(shù)對牛奶中四環(huán)素的含量進(jìn)行測定，采用偏最小二乘法建立預(yù)測模型。結(jié)果顯示MIRS技術(shù)對預(yù)測牛奶中四環(huán)素含量的預(yù)測準(zhǔn)確度更高，預(yù)測值和化學(xué)分析值的相關(guān)系數(shù)最大值為0.93，且相關(guān)系數(shù)會(huì)隨著樣本中四環(huán)素含量的增加而提高。Santos等[32]采用MIRS分析技術(shù)對牛奶中不同殘雜物(水、乳清、過氧化氫、尿素、合成奶和合成尿)進(jìn)行定量分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)MIRS對各類摻雜物建立預(yù)測模型的相關(guān)系數(shù)在0.90～0.98之間，標(biāo)準(zhǔn)誤差在0.014～2.33之間，具有較高的預(yù)測、鑒定能力。另外，Santos等[33]比較了NIRS和MIRS分析技術(shù)對上述6種混有摻雜物的牛奶定量分析時(shí)的預(yù)測準(zhǔn)確度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，6種摻雜物在MIRS光譜區(qū)具有更為明顯的吸收峰，能夠建立更為準(zhǔn)確的定量預(yù)測模型。因此，采用MIRS分析技術(shù)除了能夠?qū)εＤ讨兄舅岷偷鞍踪|(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確地定量分析之外，牛奶中礦物質(zhì)元素以及其他潛在的有害物質(zhì)也能夠通過MIRS建立預(yù)測模型來進(jìn)行準(zhǔn)確測定、鑒別和分析。這種方法操作簡單、定量分析準(zhǔn)確度高，而且能夠?qū)崿F(xiàn)實(shí)時(shí)快速的定量分析，能夠有效替代傳統(tǒng)的基于色譜、質(zhì)譜、免疫、微生物等方法建立起來的檢測方法。

5奶牛營養(yǎng)、健康與生殖狀況預(yù)測和評估

采用MIRS除了能夠?qū)εＤ讨谐Ｒ?guī)的營養(yǎng)物質(zhì)成分進(jìn)行快速準(zhǔn)確地分析之外，通過篩選合適的待測物質(zhì)來建立MIRS預(yù)測模型能夠?qū)崿F(xiàn)對奶牛自身營養(yǎng)、健康、生殖狀況的有效預(yù)測、篩選和管理。例如，圍產(chǎn)期高產(chǎn)奶牛處于能量負(fù)平衡時(shí)，血液和牛奶中β-羥丁酸、丙酮和乙酰乙酸含量會(huì)隨之升高，最終導(dǎo)致酮病、脂肪肝等能量代謝障礙性疾病的發(fā)生。Heuer等[34]采用MIRS分析技術(shù)和氣相色譜法測定牛奶中丙酮的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在1 239～1 370 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)丙酮有較高的吸收峰，其MIRS預(yù)測值與化學(xué)分析值之間的相關(guān)系數(shù)為0.66，預(yù)測均方根誤差為0.21 mmol，預(yù)測模型的準(zhǔn)確度顯著高于氣象色譜法，能夠采用MIRS來對奶牛是否患有酮病進(jìn)行有效鑒定和區(qū)分。Hansen[35]發(fā)現(xiàn)在964～1 581 cm-1、1 697～1 812 cm-1和2 699～2 969 cm-1這3個(gè)MIRS波數(shù)范圍內(nèi)丙酮都有較高的吸收峰，經(jīng)偏最小二乘法建立的預(yù)測模型的相關(guān)系數(shù)為0.81，預(yù)測均方根誤差為0.27 mmol。Van Knegsel等[36]和Van Der Drift等[37]比較了MIRS分析技術(shù)和試劑盒法測定血液和牛奶樣品中丙酮和β-羥丁酸的含量，試驗(yàn)結(jié)果也表明經(jīng)MIRS分析技術(shù)獲得的預(yù)測值較傳統(tǒng)的試劑盒法更為準(zhǔn)確和快捷，能夠?qū)崿F(xiàn)對高血酮病奶牛的有效篩選。

當(dāng)高產(chǎn)奶牛長期處于能量負(fù)平衡時(shí)，動(dòng)物整體的生產(chǎn)性能、抗病能力和繁殖性能都會(huì)受到較大的損害。以往的研究一般采用以下3種方法來預(yù)測奶牛的能量平衡情況：一是通過測定奶牛日常能量攝入和產(chǎn)出來計(jì)算能量平衡值；二是考察奶牛體重和體況評分的變化來預(yù)測奶牛能量平衡[38]；三是利用血液或牛奶中特定物質(zhì)(酮體、胰島素、脂肪、蛋白質(zhì)和糖類等)的含量變化來預(yù)測能量利用情況[39]。由于前2種考察方法步驟繁瑣、工作量大，結(jié)果準(zhǔn)確度低等問題，近年來越來越多的研究采用MIRS來對奶牛能量狀況進(jìn)行預(yù)測和分析[40-42]。McParland等[40]使用MIRS分析技術(shù)對蘇格蘭地區(qū)1 145個(gè)牛奶樣品中的脂肪和蛋白質(zhì)含量，產(chǎn)奶量，干物質(zhì)采食量，體重以及體況評分進(jìn)行分析，建立對奶牛能量平衡、體組織能量含量和有效能量采食量的定量預(yù)測模型。試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，預(yù)測模型對這3項(xiàng)指標(biāo)的預(yù)測相關(guān)系數(shù)分別為0.78，0.64和0.88，具有較高的準(zhǔn)確度，能夠在規(guī)?；膛ｐB(yǎng)殖過程中作為評價(jià)奶牛能量狀況的有效手段。McParland等[41]從英國和愛爾蘭分別收集了1 218和1 586頭荷斯坦奶牛的生產(chǎn)數(shù)據(jù)及其牛奶樣品，通過MIRS分析技術(shù)來建立奶牛能量狀況的預(yù)測模型。結(jié)果表明奶牛的有效能量采食量、能量平衡和體組織的預(yù)測相關(guān)系數(shù)分別為0.88、0.75和0.62，與McParland等[40]結(jié)果類似，經(jīng)MIRS分析技術(shù)建立的預(yù)測模型能夠?qū)崿F(xiàn)對奶牛能量狀況的有效預(yù)測和分析。此外，由于奶牛的剩余采食量和能量平衡之間存在顯著的相關(guān)關(guān)系(相關(guān)系數(shù)為0.85)，也有研究發(fā)現(xiàn)能夠通過預(yù)測剩余采食量來鑒定和分析奶牛的能量利用情況[42]。McParland等[5]通過采用MIRS分析技術(shù)對牛奶中的營養(yǎng)物質(zhì)(蛋白質(zhì)、脂肪和糖類含量)進(jìn)行定量分析，并結(jié)合奶牛的生長狀況指標(biāo)(體重和體況評分)來預(yù)測奶牛的剩余采食量。結(jié)果表明，經(jīng)MIRS分析技術(shù)建立的剩余采食量預(yù)測模型的相關(guān)系數(shù)為0.70，表明MIRS分析技術(shù)能夠?qū)δ膛ＪＳ嗖墒沉窟M(jìn)行準(zhǔn)確預(yù)測，從而實(shí)現(xiàn)對奶牛能量利用情況的準(zhǔn)確判別。因此，在采用MIRS分析技術(shù)對牛奶中營養(yǎng)物質(zhì)和其他潛在的有害物質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確地定量分析之外，利用MIRS分析技術(shù)建立的預(yù)測模型結(jié)合奶牛自身特點(diǎn)，能夠?qū)崿F(xiàn)對奶牛自身營養(yǎng)、健康、生殖狀況的有效預(yù)測、篩選和管理。

6小結(jié)與展望

MIRS分析技術(shù)能夠?qū)Υ笠?guī)模牛奶樣品中各營養(yǎng)成分和其他潛在的有害物質(zhì)進(jìn)行快速準(zhǔn)確地定量分析，并通過建立預(yù)測模型來實(shí)現(xiàn)對牛奶營養(yǎng)、健康和生殖生理與繁殖狀況的鑒定和分析，在提高牛奶及奶制品附加值和奶牛養(yǎng)殖行業(yè)盈利性的同時(shí)，有助于實(shí)現(xiàn)畜牧業(yè)高效、健康和綠色生產(chǎn)。

盡管采用MIRS分析技術(shù)建立預(yù)測模型需要較大量的數(shù)據(jù)樣品、較為詳細(xì)的數(shù)據(jù)處理過程以及較為細(xì)致的模型驗(yàn)證模型，但隨著計(jì)算技術(shù)的發(fā)展和數(shù)學(xué)模型的優(yōu)化，采用MIRS分析技術(shù)在實(shí)際生產(chǎn)中將發(fā)揮舉足輕重的作用。另外，采用MIRS技術(shù)還能夠?qū)εＤ讨衅渌麪I養(yǎng)物質(zhì)成分進(jìn)行定量分析和預(yù)測。例如，牛奶中含有豐富的維生素A、B、C以及瘤胃內(nèi)甲烷的排放量進(jìn)行較為準(zhǔn)確地分析和預(yù)測。通過收集不同飼養(yǎng)和管理?xiàng)l件下不同遺傳特性和品種的奶牛數(shù)據(jù)來擴(kuò)大樣本的代表性和多樣性，從而提高預(yù)測模型的準(zhǔn)確度，將是MIRS技術(shù)的擴(kuò)展研究。毫無疑問地將MIRS分析技術(shù)與反芻動(dòng)物飼料利用效率、遺傳特性選擇等方面的內(nèi)容進(jìn)行集成，對推動(dòng)我國畜牧行業(yè)的高效、低碳和可持續(xù)性發(fā)展具有實(shí)際意義。

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(責(zé)任編輯王智航)

Application of Mid-Infrared Spectrometry in Milk Nutrient Components Prediction and Related Traits Analysis of Dairy Cows

DONG Lifeng1YAN Tianhai2TU Yan1DIAO Qiyu1*

(1. Key Laboratory of Feed Biotechnology of the Ministry of Agriculture, Feed Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China； 2. Agri-Food and Biosciences Institute, Hillsborough BT26 6DR, UK)

Abstract:In recent years, the mid-infrared spectrometry (MIRS) analysis of milk has been used as a potential tool for the rapid and accurate quantification of milk nutrient components, such as fatty acids, proteins and minerals, and potential harmful materials, such as adulteration and antibiotics. Furthermore, the MIRS prediction equations derived from the milk analysis can provide simultaneous detection of cows’ nutrition (feed conversion rate, energy utilization efficiency and methane emission), health (mammitis and metabolic diseases), reproduction physiology and fertility conditions. These researches may provide technical insurance for optimization of production mode, development of the innovative circular economy mode and realization of low carbon, healthy and sustainable development in animal husbandry industry. This paper mainly reviewed the use of MIRS to predict milk nutrient components and related traits analysis of dairy cows worldwide in recent years.[Chinese Journal of Animal Nutrition, 2016, 28(2)：326-334]

Key words:MIRS; prediction model; milk components; dairy cows

*Corresponding author, professor, E-mail: diaoqiyu@caas.cn

中圖分類號(hào)：S823

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1006-267X(2016)02-0326-09

作者簡介：董利鋒(1985—)，男，河南鞏義人，博士，從事反芻動(dòng)物營養(yǎng)與飼料科學(xué)研究。E-mail： Dong-L@email.ulster.ac.uk*通信作者：刁其玉，研究員，博士生導(dǎo)師，E-mail： diaoqiyu@caas.cn

基金項(xiàng)目：奶牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系北京市創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)營養(yǎng)評價(jià)與飼料配方崗位(BJNN-01)；華北農(nóng)區(qū)及北方大城市奶牛健康養(yǎng)殖生產(chǎn)技術(shù)集成及產(chǎn)業(yè)化示范(2012BAD12B06)

收稿日期：2015-08-24

doi：10.3969/j.issn.1006-267x.2016.02.004