邸雪峰，　吳松權(quán)，　樸　錦，　呂龍石

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院,吉林 延吉 133002)

?

人參莖愈傷組織的誘導(dǎo)和分化研究

邸雪峰，吳松權(quán)，樸錦，呂龍石*

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院,吉林 延吉 133002)

摘要：以4年生人參莖為外植體，探討了最適的消毒方法；以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，用均勻設(shè)計(jì)的方法探討了2,4-D和6-BA不同濃度組合對(duì)人參愈傷組織誘導(dǎo)率的影響；用2,4-D和6-BA不同濃度組合探討了對(duì)人參莖愈傷組織分化成再生苗的影響。結(jié)果表明：人參莖部最好的消毒方法為自來(lái)水沖洗2 h，無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)70%酒精溶液浸泡30 s，再用0.1%升汞溶液浸泡 4 min；最適合人參莖外植體誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基為MS+2.57 mg/L 2,4-D+0 mg/L 6-BA,誘導(dǎo)率可達(dá)64.75%；人參莖愈傷組織分化成試管苗的最好培養(yǎng)基為MS+2.00 mg/L 2,4-D+0.05 mg/L 6-BA，分化率達(dá)22.22%。

關(guān)鍵詞：人參；莖；消毒；愈傷組織；分化

人參(PanaxginsengC. A. Mey.)作為百草之王，又名神草、血參、人微[1]。人參系被子植物門(mén)雙子葉植物綱離瓣花亞綱五加科，多年生草本植物，生長(zhǎng)于深林，分布在東北三省和河北省北部深山中[2-3]。人參含有多種人參皂苷、氨基酸、多糖及人參酶，具有大補(bǔ)元?dú)猓a(bǔ)脾益肺，養(yǎng)陰清熱，安神經(jīng)，定魂魄等其他很多療效[4-5]。

然而人參自然生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期過(guò)于緩慢，對(duì)新品種培育和大規(guī)模生產(chǎn)造成了很大困難[6]。人們希望通過(guò)組織培養(yǎng)的途徑使人參生產(chǎn)脫離限制性的自然環(huán)境條件，縮短生長(zhǎng)時(shí)間，同時(shí)達(dá)到快速繁殖新品種的目的[7]。人參組織培養(yǎng)，自本世紀(jì)60年代初開(kāi)展以來(lái)，已經(jīng)有越來(lái)越多的研究者投身于這一研究領(lǐng)域[8]。早在1964年羅士韋就開(kāi)始了人參愈傷組織的研究，并取得初步結(jié)果[9]。朱蔚華等1975年開(kāi)始人參組織培養(yǎng)的系統(tǒng)研究[10]，杜令閣等(1987)誘導(dǎo)出人參花粉單倍體植株并建立了體細(xì)胞無(wú)性系[11]，雷秀娟(2013)誘導(dǎo)出人參花藥愈傷組織并建立植株再生體系[12]。人參組織培養(yǎng)雖起步較早，但進(jìn)展緩慢。人參愈傷組織誘導(dǎo)率較低，分化更加困難，尚未見(jiàn)從人參莖愈傷組織分化出人參再生苗的研究報(bào)道。

本文以人參莖為外植體，探討了人參莖外植體的最好消毒方法；采用均勻設(shè)計(jì)探討了不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑(2,4-D和6-BA)濃度處理組合對(duì)人參莖愈傷組織誘導(dǎo)率的影響；以不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑(2,4-D和6-BA)濃度處理組合探討了人參莖愈傷組織的分化率，為人參組培快繁體系的建立打下基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

采用無(wú)病4年生人參莖，由延邊大陽(yáng)參業(yè)有限公司提供。

1.2方法

1.2.1人參莖外植體的消毒方法

取無(wú)病人參單株的莖，分成數(shù)段，先用自來(lái)水沖洗2 h，清除表面泥土，然后用濾紙吸干水分，放入干凈的燒杯中移至無(wú)菌操作臺(tái)。將人參莖外植體先用70%酒精溶液浸泡30 s，期間不停搖晃，無(wú)菌水沖洗2～3次，再用2%次氯酸鈉溶液或0.1%升汞溶液浸泡后，無(wú)菌水沖洗3～4次。切去兩端并分成1 cm左右的小段接種于MS+2,4-D 2.0 mg/L+BA 0.05 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂10 mg/L,pH值為5.8的培養(yǎng)基中。消毒液類型與處理時(shí)間如表1。每處理20個(gè)培養(yǎng)皿(ф=90 mm)，每個(gè)培養(yǎng)皿接種1個(gè)人參莖外植體，培養(yǎng)室溫度(25±2) ℃，暗室培養(yǎng)。從接種第2天開(kāi)始統(tǒng)計(jì)污染、褐變和存活情況，1個(gè)月之后觀察人參愈傷組織的生長(zhǎng)情況，并計(jì)算出各個(gè)處理的污染率、褐變率和存活率。

1.2.22,4-D和6-BA不同濃度配比對(duì)人參莖愈傷組織誘導(dǎo)率的影響

以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加蔗糖30 g/L,瓊脂粉10 g/L，pH值5.8，溫度為(25±2) ℃，暗室培養(yǎng)。將經(jīng)過(guò)最適消毒方法處理的人參莖外植體接種到附加不同濃度2,4-D和6-BA培養(yǎng)基中，2,4-D為1.0～3.5 mg/L，6-BA為0.05～0.30 mg/L,接種方法與數(shù)量同消毒處理。采用U12*(122)均勻設(shè)計(jì)表，進(jìn)行平滑后的實(shí)施方案見(jiàn)表2。所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.32,4-D和6-BA不同濃度配比對(duì)人參莖愈傷組織分化率的影響

以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加蔗糖30 g/L,瓊脂粉10 g/L，pH值5.8,添加不同濃度的2,4-D和6-BA構(gòu)成10種不同組合的分化培養(yǎng)基，其代碼為DF1～DF10(表3)。將長(zhǎng)勢(shì)較好的人參莖愈傷組織轉(zhuǎn)接至分化培養(yǎng)基上，每處理10個(gè)培養(yǎng)皿，每個(gè)培養(yǎng)皿接種9個(gè)人參愈傷組織，培養(yǎng)室溫度為(25±2) ℃，暗室培養(yǎng),45 d繼代培養(yǎng)1次，觀察愈傷組織分化情況。參照雷秀娟的方法，將分化出的人參小苗底部切斷轉(zhuǎn)接至壯苗培養(yǎng)基MS+TDZ 3 mg/L+IBA 0.2 mg/L+GA 3 mg/L繼代培養(yǎng)[12]。

2結(jié)果與分析

2.1不同消毒方法對(duì)人參莖外植體的消毒效果

分別用2%NaClO2溶液和0.1% HgCl2溶液以不同消毒時(shí)間處理人參莖外植體，所得褐變率、污染率及存活率的調(diào)查結(jié)果見(jiàn)表1。

表1　人參莖外植體的消毒處理效果

由表1可知，0.1% HgCl2溶液消毒效果好于2%NaClO2溶液。人參莖外植體消毒效果最好的處理是7號(hào)處理(0.1% HgCl24 min)，存活率達(dá)70%，其次為6號(hào)處理(0.1% HgCl22 min)和8號(hào)處理(0.1%HgCl26 min)，存活率均超過(guò)50%。

2.22,4-D和6-BA不同濃度配比對(duì)人參莖愈傷組織誘導(dǎo)率的影響

在MS培養(yǎng)基中添加不同濃度2,4-D和6-BA對(duì)人參莖外植體愈傷組織誘導(dǎo)率影響的調(diào)查結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　人參莖愈傷組織誘導(dǎo)率

2.32,4-D和6-BA不同濃度配比對(duì)人參莖愈傷組織分化率的影響

人參莖愈傷組織轉(zhuǎn)接至分化培養(yǎng)基，經(jīng)過(guò)3或4次繼代培養(yǎng)后，愈傷組織上部逐漸衰老(圖1-A)；在部分衰老愈傷組織上長(zhǎng)出不定根，并分化出白色芽點(diǎn)(圖1-B)；將其轉(zhuǎn)移至光下培養(yǎng)，芽點(diǎn)不斷膨大變綠，并分化出叢生芽，此時(shí)底部愈傷組織逐漸衰老死亡(圖1-C)；從叢生芽上分化出較多人參再生苗(圖1-D)；將其單個(gè)切取轉(zhuǎn)接到壯苗培養(yǎng)基，經(jīng)2次繼代培養(yǎng)，在個(gè)別人參再生苗上出現(xiàn)花蕾(圖1-E)并有開(kāi)花現(xiàn)象(圖1-F)。

在不同濃度2,4-D和6-BA的分化培養(yǎng)基上人參莖外植體愈傷組織分化成再生苗的調(diào)查結(jié)果如表3所示。

由表3可知，在10種分化培養(yǎng)基中，DF5、DF6和DF7培養(yǎng)基上成功分化出人參再生苗，DF6培養(yǎng)基的分化率最高，達(dá)到22.22%。

圖1　人參莖愈傷組織及其分化過(guò)程

表3　人參愈傷組織分化率

3討論與結(jié)論

消毒方法的研究結(jié)果表明：人參莖外植體最好的消毒方法為自來(lái)水沖洗2 h，無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)70%酒精溶液浸泡30 s，無(wú)菌水沖洗2～3次，再用0.1%升汞溶液浸泡4 min，無(wú)菌水沖洗3～4次。人參主根地下生長(zhǎng)，環(huán)境復(fù)雜，不僅表皮帶菌，各種菌物常常侵染至其內(nèi)部形成內(nèi)生菌。組織培養(yǎng)消毒劑多為表面消毒劑，若消毒時(shí)間過(guò)短，往往消毒不徹底；若消毒時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，常常殺死組培外植體。人參莖在地面生長(zhǎng)，帶菌較少，用表面消毒劑可較好的消除健康植株莖表面的菌物。

人參莖愈傷組織分化率的研究結(jié)果表明：在DF5、DF6和DF73種培養(yǎng)基上分化出人參再生苗，在DF6處理組合(2,4-D 2 mg/L，6-BA 0.05 mg/L)的分化率最高，達(dá)22.22%。人參愈傷組織分化困難一直是阻礙人參組織培養(yǎng)的難關(guān)，本文初步摸索出人參莖愈傷組織再分化的2,4-D和6-BA的不同濃度組合，但尚未能分化出人參再生苗的根部，對(duì)此還有待于進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]彭亮亮,劉強(qiáng),董宇,等.人參的組織培養(yǎng)中通過(guò)對(duì)Whit、MS、FOX培養(yǎng)基分別加入10%椰乳然后接種誘導(dǎo)發(fā)生的情況變化研究[J].人參研究,2012(4):43.

[2]樸春驛，趙麗琴，李春英.人參不同部位無(wú)機(jī)元素含量測(cè)定[J].黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào),1998，10(1):68-69.

[][]

[3]安永輝,郭昶,孫振雷,等.人參的組織培養(yǎng)及快繁體系的建立[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2008,36(27):11656-11657.

[4]左北梅,高文遠(yuǎn),董艷艷,等. 藥用植物人參的組織培養(yǎng)研究進(jìn)展[J].中國(guó)現(xiàn)代中藥,2012, 14(1):34.

[5]李鵬飛，劉春瑩，郭俊瑩，等.不同種類人參莖葉中皂苷成分的比較[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38(24):13077-13079.

[6]劉賢旺.人參組織培養(yǎng)研究的進(jìn)展[J].江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),1993,5(2):51-54．

[7]史芳芳,汪泉,王小平.人參莖段組織培養(yǎng)研究[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技,2012(14):56.

[8]陸文梁，夏小娣.人參組織與細(xì)胞培養(yǎng)研究的進(jìn)展[J].植物學(xué)通報(bào)，1991，8(1)：14-21.

[9]羅士韋,黃文徽,曹?chē)?guó)儀,等.人參組織培養(yǎng)[J].植物生理學(xué)通訊,1964(2):26.

[10]朱蔚華,張蔭麟,李新蘭,等.人參愈傷組織培養(yǎng)的初步研究[J].藥學(xué)學(xué)報(bào),1979,14(9):541-547.

[11]杜令閣,侯艷華,常維春,等.人參花粉植株的誘導(dǎo)及體細(xì)胞無(wú)性系的建立[J].中國(guó)科學(xué)(B輯),1987(1):35-41.

[12]雷秀娟.人參花藥、雜種胚培養(yǎng)及基于皂苷含量的特性評(píng)價(jià)[D].長(zhǎng)春:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所,2013.

Study on Panax ginseng stem callus induction and the differentiation

(.*)

(AgriculturalCollegeofYanbianUniversity,YanjiJilin133002,China)

Abstract：Using four years’ old ginseng stems as explants, the optimum disinfection method was studied, and MS medium as basic medium, the effects of 2,4-D and 6-BA concentration on ginseng callus rate with uniform design and the effect of ginseng callus induction into plantlets with different concentrations of 2,4-D in combination with 6-BA were examined. The results showed that the best disinfection method of ginseng stems was that tap water kept washing 2 h, a sterile solution of 70% alcohol soaked console 30s, and then 0.1% mercuric chloride solution soaked 4min. The most suitable ginseng stem explants callus induction medium was MS + 2,4-D 2.57mg/L + 6-BA 0 mg/L, the inducing rate was 64.75%. The best ginseng callus differentiation into tube seedlings medium was MS + 2,4-D 2.00mg/ L + 6-BA 0.05 mg/L, the differentiation rate was 22.22%.

Key words:Panax ginseng；stem；disinfection；callus；differentiation

中圖分類號(hào)：S567.53

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1004-7999(2016)01-0031-04

DOI:10.13478/j.cnki.jasyu.2016.01.006

作者簡(jiǎn)介：邸雪峰(1990—)，女，吉林洮南人，在讀碩士，研究方向?yàn)橹兴幉脑耘嗯c育種。 呂龍石為通信作者，

收稿日期：2016-01-15基金項(xiàng)目：吉林省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目(吉教科合字[2009]第1號(hào)；吉教科合字[2010]第1號(hào))

E-mai：nxlls@ybu.edu.cn