霍小東 王慧星 閻衛(wèi)亮 焦玲 張文藝 鄭廣鈞 王俊杰 于振濤 柴樹(shù)德

300211，天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院胸外科（霍小東、閻衛(wèi)亮、鄭廣鈞、柴樹(shù)德），疼痛科（王慧星）；300192天津，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所，天津市放射醫(yī)學(xué)與分子核醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（焦玲、張文藝）；100191，北京大學(xué)第三醫(yī)院腫瘤治療中心放療科（王俊杰）；300060，天津醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院食管腫瘤科，天津市腫瘤防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（于振濤）

血管內(nèi)皮抑制素對(duì)125I近距離照射裸鼠肺癌移植瘤的增敏效應(yīng)研究

霍小東 王慧星 閻衛(wèi)亮 焦玲 張文藝 鄭廣鈞 王俊杰 于振濤 柴樹(shù)德

300211，天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院胸外科（霍小東、閻衛(wèi)亮、鄭廣鈞、柴樹(shù)德），疼痛科（王慧星）；300192天津，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所，天津市放射醫(yī)學(xué)與分子核醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（焦玲、張文藝）；100191，北京大學(xué)第三醫(yī)院腫瘤治療中心放療科（王俊杰）；300060，天津醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院食管腫瘤科，天津市腫瘤防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（于振濤）

目的 探討重組人血管內(nèi)皮抑制素對(duì)125I粒子植入治療裸鼠肺癌移植瘤模型的輻射增敏效應(yīng)。方法 建立裸鼠移植瘤模型，隨機(jī)分成對(duì)照組（A組）、125I植入組（B組）、重組人血管內(nèi)皮抑制素組（C組）和125I植入聯(lián)合重組人血管內(nèi)皮抑制素組（D組），每組20只。移植瘤直徑達(dá)2 cm時(shí)行125I粒子植入，處方劑量20 Gy，采用治療計(jì)劃系統(tǒng)計(jì)算移植瘤的體積及接受劑量。按每只裸鼠每天給予20 mg/kg重組人血管內(nèi)皮抑制素，連續(xù)給藥14 d，觀察并記錄腫瘤生長(zhǎng)的速度和瘤體體積的變化，分別于第15、30天時(shí)處死裸鼠，并通過(guò)免疫組化方法檢測(cè)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的表達(dá)和微血管密度（MVD），通過(guò)RT-PCR分別檢測(cè)各組腫瘤組織中αvβ3 mRNA水平。結(jié)果 第15、30天時(shí)，D組的重量抑瘤率和體積抑瘤率與B、C組相比明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，B組和D組第30天時(shí)的重量抑瘤率和體積抑瘤率均較第15天時(shí)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。免疫組化結(jié)果顯示，第15、30天時(shí)，D組與A、B、C組VEGF、MVD差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中，C組與A、B組VEGF、MVD差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，C組第30天時(shí)的VEGF表達(dá)水平和MVD較第15天時(shí)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。RT-PCR結(jié)果顯示，第15、30天時(shí)，與A組相比，B組αvβ3 mRNA的表達(dá)有所增加，并隨時(shí)間的延長(zhǎng)增加更明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而C組和D組αvβ3 mRNA的表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 重組人血管內(nèi)皮抑制素對(duì)肺癌移植瘤的近距離輻射增敏作用明確，VEGF、MVD、αvβ3 mRNA的表達(dá)變化是其重要機(jī)制。

內(nèi)皮抑素類(lèi)；肺腫瘤；輻射增敏藥；近距離放射療法

Fund programs:National Natural Science Foundation of Tianjin（15JCYBJC28400）;Science Foundation of Tianjin Medical University（2014KYQ27）

血管內(nèi)皮抑制素與外放療聯(lián)合應(yīng)用的基礎(chǔ)研究已有報(bào)道，內(nèi)皮抑素對(duì)小鼠肺癌移植瘤、裸鼠人直結(jié)腸癌移植瘤以及對(duì)射線抗拒的移植瘤等均具有放射增敏作用[1]。但在多數(shù)研究中，血管內(nèi)皮抑制素僅與外放療聯(lián)合，對(duì)于聯(lián)合125I低劑量率近距離放療是否具有增敏作用尚缺少研究報(bào)道。重組人血管內(nèi)皮抑制素作為一種血管內(nèi)皮抑制素，其聯(lián)合125I低劑量率近距離照射是否對(duì)裸鼠肺癌移植瘤的輻射增敏有效果，是本研究的意義所在。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)及裸鼠模型建立

細(xì)胞株采用A549肺癌細(xì)胞系，由天津市腫瘤研究所公共實(shí)驗(yàn)室提供。培養(yǎng)液選取RPMI1640，加入10%胎牛血清、100 IU/mL青霉素、100 mg/mL鏈霉素，置于37℃、5%CO2的孵育箱中培養(yǎng)。80只雌性BALB/c裸鼠由天津市腫瘤研究所提供，先在實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)1～2 d（空氣層流室飼養(yǎng)，室溫為26～28℃，相對(duì)濕度50%）以適應(yīng)室內(nèi)環(huán)境，腫瘤移植時(shí)小鼠為4～6周齡，體重為15～20 g。飼料、墊料、籠具及飲水等物品均經(jīng)高壓蒸氣滅菌，并在無(wú)菌條件下更換。每只裸鼠皮下接種指數(shù)生長(zhǎng)期A549細(xì)胞，待細(xì)胞接種成功的移植瘤長(zhǎng)徑達(dá)2 cm時(shí)，分離瘤組織，用剪刀將組織塊修剪成直徑約2 mm的小塊，用25號(hào)接種針將其種植于BALB/c裸鼠前肢腋窩組織內(nèi)，整個(gè)腫瘤組織塊的制備和種植均在無(wú)菌條件下進(jìn)行。

1.2 瘤體大小的測(cè)量

記錄皮下移植瘤的長(zhǎng)徑、短徑，按V（mm3）=（D×d2）/2計(jì)算腫瘤體積（V），其中，D是腫瘤表面最長(zhǎng)徑，d是腫瘤表面最短徑。待裸鼠皮下種植的腫瘤組織塊生長(zhǎng)至腫瘤體積達(dá)500 mm3后開(kāi)始給藥及植入粒子。將裸鼠隨機(jī)分為4組：對(duì)照組（A組）、125I植入組（B組）、重組人血管內(nèi)皮抑制素組（C組）、125I植入聯(lián)合重組人血管內(nèi)皮抑制素組（D組），每組20只。

1.3 植入粒子及給藥

在無(wú)菌條件下，實(shí)驗(yàn)人員穿鉛衣，戴護(hù)目鏡、鉛手套，先將裸鼠固定，消毒裸鼠前肢腋下直徑約1．5 cm范圍的皮膚3遍。以遠(yuǎn)離選定點(diǎn)1 cm處為穿刺點(diǎn)刺入，植入針經(jīng)皮下穿過(guò)直至消毒皮膚中心，拔出針芯，將粒子放入植入針，用針芯將粒子慢慢推入預(yù)定點(diǎn)。CT掃描確定植入部位是否準(zhǔn)確，將CT圖像輸入治療計(jì)劃系統(tǒng)，計(jì)算劑量。粒子植入成功后，待裸鼠蘇醒，送返動(dòng)物飼養(yǎng)室繼續(xù)飼養(yǎng)。根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，重組人血管內(nèi)皮抑制素總的給藥劑量為每只裸鼠每天20 mg/kg，質(zhì)量濃度約為200（80～450）μg/mL（0．9%生理鹽水稀釋?zhuān)?，注射? h內(nèi)，避光，在超凈臺(tái)內(nèi)進(jìn)行配制。通過(guò)裸鼠皮下進(jìn)行注射，每日更換不同注射部位，連續(xù)注射14 d。

1．4 裸鼠移植瘤的瘤重及體積抑瘤率的測(cè)定

各組荷瘤裸鼠經(jīng)不同處理后，于第15、30天各處死5只，經(jīng)解剖分離并摘下瘤組織，測(cè)量其體積，并稱(chēng)重。腫瘤體積抑瘤率=（對(duì)照組平均體積－治療組平均體積）/對(duì)照組平均體積×100%；腫瘤重量抑瘤率=（對(duì)照組平均瘤重－治療組平均瘤重）/對(duì)照組平均瘤重×100%。

1．5 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)腫瘤組織中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表達(dá)和微血管密度（microvesseldensity，MVD）

各組荷瘤裸鼠經(jīng)不同處理后，分別于第15、30天各處死5只，取瘤組織做組織切片，通過(guò)對(duì)移植瘤組織進(jìn)行染色及免疫組化二步法來(lái)檢測(cè)VEGF、MVD的表達(dá)情況。根據(jù)免疫組化結(jié)果，在400倍視野下選取具有代表性的區(qū)域，在每個(gè)選定區(qū)域中隨機(jī)選取150～200個(gè)細(xì)胞，根據(jù)視野內(nèi)的陽(yáng)性細(xì)胞比例進(jìn)行評(píng)分。當(dāng)陽(yáng)性細(xì)胞比例為≤5%、6%～25%、26%～50%、51%～75%、＞75%時(shí)，分別得到0分、1分、2分、3分、4分。根據(jù)顯色程度為無(wú)色、淺黃色、棕黃色、棕褐色可分別得到0分、1分、2分、3分。以上兩項(xiàng)得分相乘為該視野的總分。每張切片所得分是該切片選取的所有視野得分的均值。最后將切片的得分分為4個(gè)等級(jí)：0～1分表示陰性（－），2～4分為（+），5～8分為（++），9分以上為（+++）。

1．6 RT-PCR檢測(cè)αvβ3 mRNA表達(dá)差異

在約100 mg組織中加入1 mL Trizol，勻漿器勻漿，直到看不到大塊的組織，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。使用的引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，β-actin上游引物序列：5′-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3′，下游引物序列：5′-TAAAGACCTCTATGCCAACACAG-3′，片段長(zhǎng)度265 bp，退火溫度58℃；αvβ3上游引物序列：5′-GCTCATTGGCCTTGCTACTC-3′，下游引物序列：5′-CCCGGTAGGTAGGTGATATTGGTG-3′，片段長(zhǎng)度167 bp，退火溫度60℃。

1．7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

腫瘤生長(zhǎng)的平均相對(duì)體積、瘤重等計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）來(lái)表示。各組數(shù)據(jù)組間比較采用單因素方差分析。分析率的比較運(yùn)用Fisher’s確切檢驗(yàn)或卡方檢驗(yàn)，P＜0．05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 各組裸鼠移植瘤的重量及體積抑瘤率的比較

第30天時(shí)，D組的重量抑瘤率與B、C組相比明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=12．9、50．0，P均＜0．05），D組體積抑瘤率與B、C組相比明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=13．7、46．1，P均＜0．05）；第30天時(shí)，D組的重量抑瘤率與B、C組相比明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=10．8、63．2，P均＜0．05），D組體積抑瘤率與B、C組相比明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=9．1、63．2，P均＜0．05）；B組第30天時(shí)的重量抑瘤率和體積抑瘤率較第15天時(shí)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7．3、5．2，P均＜0．05）；D組第30天時(shí)的重量抑瘤率和體積抑瘤率較第15天時(shí)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2= 4．3、4．6，P均＜0．05）；而C組第30天時(shí)的重量抑瘤率和體積抑瘤率較第15天時(shí)無(wú)明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=2．3、3．2，P均＞0．05）。詳見(jiàn)表1。

2．2 粒子植入后瘤體接受劑量

粒子植入后用治療計(jì)劃系統(tǒng)進(jìn)行粒子重建，導(dǎo)出劑量體積直方圖驗(yàn)證靶區(qū)瘤體接受的覆蓋90%靶體積時(shí)的劑量（D90）為（20．3±2．2）Gy，被90%劑量覆蓋的靶體積百分比（V90）為98．3%±8．2%，匹配周邊劑量為20．1 Gy。覆蓋90%靶體積時(shí)的劑量大于匹配周邊劑量。

2．3 免疫組化檢測(cè)移植瘤VEGF表達(dá)、MVD情況

免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示：第15天時(shí)，D組VEGF表達(dá)水平與A、B、C組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=11．9、12．6、3．3，P均＜0．05），D組MVD與A、B、C組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=48．8、31．2、4．4，P均＜0．05）。第30天時(shí)，D組VEGF表達(dá)水平與A、B、C組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=10．5、9．5、3．1，P均＜0．05），D組MVD與A、B、C組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=45．1、26．9、11．8，P均＜0．05）。其中，C組第15天時(shí)VEGF表達(dá)水平與A、B組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=11．5、12．2，P均＜0．05），C組MVD與A、B組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=39．1、25．8，P均＜0．05）；C組第30天時(shí)VEGF表達(dá)水平與A、B組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7．0、6．2，P均＜0．05），C組MVD與A、B組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=34．4、18．3，P均＜0．05）；C組第30天時(shí)VEGF表達(dá)水平和MVD較第15天時(shí)增加，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3．8、4．3，P均＜0．05）。詳見(jiàn)表2。

表1 不同處理方法組中裸鼠移植瘤的體積及重量抑瘤率（%）Table 1 Volume，weight and growth inhibitory rate of the transplanted tumor in different treatment groups（%）

表2 不同處理方法組中裸鼠移植瘤的VEGF表達(dá)和MVD比較Table 2 Expression of VEGF and MVD in different treatment groups

2．4 不同處理方法對(duì)移植瘤αvβ3mRNA表達(dá)的影響

RT-PCR結(jié)果顯示：第15、30天時(shí)，與A組相比，B組αvβ3 mRNA的表達(dá)有所增加，并隨時(shí)間的延長(zhǎng)增加更明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6．6、15．4，P＜0．05），而C組和D組αvβ3 mRNA的表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（C vs．A：t=16．1、16．5，P均＜0．05；D vs．A：t=9．4、12．9，P均＜0．05）。說(shuō)明重組人血管內(nèi)皮抑制素聯(lián)合125I粒子照射可以抑制腫瘤細(xì)胞內(nèi)αvβ3 mRNA的表達(dá)，D組最明顯（表3）。

表3 不同處理方法組中移植瘤αvβ3mRNA的表達(dá)比較Table 3 αvβ3 mRNA expression of transplanted tumor in different treatment groups

3 討論

肺癌是世界范圍內(nèi)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其病死率在惡性腫瘤中居前位[2－3]。在我國(guó)，肺癌也是病死率最高的腫瘤，80%確診時(shí)往往已屬中晚期[4]，失去了根治性手術(shù)切除的機(jī)會(huì)，而只能采用放射治療。放射性粒子植入治療腫瘤是局部適形內(nèi)放療。國(guó)內(nèi)外多位學(xué)者研究報(bào)道了經(jīng)CT引導(dǎo)下125I粒子植入治療中晚期肺癌，均取得了一定的療效，但對(duì)大多數(shù)惡性腫瘤患者的長(zhǎng)期生存率并沒(méi)有明顯地提高，主要原因是大多數(shù)腫瘤細(xì)胞對(duì)射線的敏感性較差或產(chǎn)生耐受[5－6]。因此，探求具有射線增敏作用的藥物具有重要的意義。VEGF抑制劑在正常血管系統(tǒng)中廣泛表達(dá)，但對(duì)腫瘤新生血管的形成起著負(fù)性調(diào)節(jié)的作用，同時(shí)對(duì)原始內(nèi)皮細(xì)胞的分化、血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖及腫瘤生長(zhǎng)均有抑制作用。經(jīng)過(guò)近40年的探索，近年來(lái)已經(jīng)有幾十種新生血管抑制劑進(jìn)入Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期臨床研究，其中最引人注目的便是目前發(fā)現(xiàn)的最廣譜的血管生成抑制劑——Endostatin。Endostatin能作用于VEGF的受體KDR/Flk-1，阻止VEGF與內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合，直接阻斷VEGF的作用[7]。重組人血管內(nèi)皮抑制素聯(lián)合化療治療中晚期非小細(xì)胞肺癌已經(jīng)在我國(guó)完成了Ⅲ期臨床試驗(yàn)并取得了可喜成果[8]。

重組人血管內(nèi)皮抑制素聯(lián)合放療處理A549肺腺癌細(xì)胞[9]及移植瘤[10-11]、Lewis肺癌細(xì)胞移植瘤[12]、H520肺鱗癌細(xì)胞[13]的相關(guān)研究均證實(shí)重組人血管內(nèi)皮抑制素聯(lián)合放療與單純放療相比顯著提高了對(duì)移植瘤及腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，具有放射增敏作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，D組對(duì)腫瘤的抑制作用最強(qiáng)，較A、B和C組更加明顯，而VEGF表達(dá)和MVD的變化為不同處理組抑制作用的差異提供了解釋。

125I作為一種低劑量率輻射源，半衰期為60.2 d。近距離治療的劑量率是按治療區(qū)內(nèi)參考點(diǎn)單位時(shí)間（h）所受到的放射劑量來(lái)決定的。劑量率直接影響放射治療時(shí)的生物效應(yīng)。125I的劑量率為7.72 cGy/h。研究發(fā)現(xiàn)在較低范圍內(nèi)的不同劑量率照射下，細(xì)胞的反應(yīng)也會(huì)出現(xiàn)不同的結(jié)果，從而產(chǎn)生不一樣的劑量率效應(yīng)[14]。本研究采用125I低劑量率照射，B組和D組第30天時(shí)的重量抑瘤率和體積抑瘤率較第15天時(shí)均明顯增加，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明隨著照射時(shí)間的延長(zhǎng)，腫瘤所接受的劑量增加，細(xì)胞死亡增多，重量及體積減小。但D組較B組第15、30天時(shí)的重量抑瘤率和體積抑瘤率增加，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Jain[15-16]提出了“腫瘤血管正?；钡母拍?，即抗血管生成藥物將腫瘤血管系統(tǒng)重新組織，使其結(jié)構(gòu)能重塑并接近正常，功能得到改善，氧合作用增強(qiáng)，組織間液的壓力降低，可提高放療對(duì)抗腫瘤的療效。因此，考慮重組人血管內(nèi)皮抑制素作為一種抗血管生成藥物，能顯著改善腫瘤血管乏氧狀態(tài)，使“腫瘤血管正?；?，降低腫瘤細(xì)胞對(duì)射線的抵抗性。本研究中處方劑量選定20 Gy主要考慮更低劑量不一定能對(duì)移植瘤產(chǎn)生明確的抑制效果，而更高的劑量可能對(duì)腫瘤產(chǎn)生過(guò)強(qiáng)的抑制作用，進(jìn)而掩蓋重組人血管內(nèi)皮抑制素的療效，反而不利于實(shí)驗(yàn)觀察。

整合素αvβ3 mRNA在內(nèi)皮細(xì)胞中過(guò)度表達(dá)，主要參與內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和存活，促進(jìn)新生血管的生長(zhǎng)。本研究顯示125I植入組αvβ3 mRNA表達(dá)增高，Abdollahi等[17]在αvβ3 mRNA拮抗劑聯(lián)合外放療對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，隨著照射劑量的增加，內(nèi)皮細(xì)胞αvβ3 mRNA的表達(dá)升高，這表明整合素αvβ3 mRNA對(duì)腫瘤微血管免受放射誘導(dǎo)的損傷起著保護(hù)作用。本研究顯示重組人血管內(nèi)皮抑制素聯(lián)合低劑量率放療抑制αvβ3 mRNA的作用顯著，其原因可能是在使用重組人血管內(nèi)皮抑制素后腫瘤組織αvβ3 mRNA表達(dá)降低，使腫瘤新生血管減少，改善了腫瘤組織乏氧；另外，低劑量率放療增加了腫瘤組織αvβ3 mRNA的表達(dá)，使腫瘤細(xì)胞對(duì)重組人血管內(nèi)皮抑制素的抗αvβ3作用靶點(diǎn)增多，從而起到增敏作用。

綜上所述，抗血管生成治療的主要靶點(diǎn)是腫瘤血管，近距離放射治療的主要靶點(diǎn)是腫瘤細(xì)胞。兩者之間存在協(xié)同作用機(jī)制從而提高放射治療的療效[18]。也有學(xué)者認(rèn)為，放射治療可誘導(dǎo)腫瘤組織中血管生長(zhǎng)因子VEGF的表達(dá)，增加腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的放射抵抗，刺激腫瘤血管生長(zhǎng)；而抗血管藥物可抑制VEGF的表達(dá)，同時(shí)抑制新生血管生成，從而預(yù)防或延遲了腫瘤的局部復(fù)發(fā)[19]。本研究結(jié)果提示，重組人血管內(nèi)皮抑制素對(duì)肺癌移植瘤的近距離輻射增敏作用明確，VEGF、MVD、αvβ3 mRNA的表達(dá)變化是其重要機(jī)制，本研究為臨床中應(yīng)用重組人血管內(nèi)皮抑制素聯(lián)合125I粒子治療非小細(xì)胞肺癌提供了理論依據(jù)。

利益沖突 本研究由署名作者按以下貢獻(xiàn)聲明獨(dú)立開(kāi)展，不涉及任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明 霍小東負(fù)責(zé)研究命題的提出、設(shè)計(jì)及論文起草；王慧星、閻衛(wèi)亮負(fù)責(zé)研究過(guò)程的實(shí)施；焦玲、張文藝、鄭廣鈞負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)的獲取、提供與分析；王俊杰、于振濤負(fù)責(zé)研究命題的總體提出并進(jìn)行監(jiān)督工作；柴樹(shù)德負(fù)責(zé)研究命題的提出、設(shè)計(jì)以及論文審核。

［1］楊林,王金萬(wàn),湯仲明,等.重組人血管內(nèi)皮抑制素Ⅰ期臨床研究[J].中國(guó)新藥雜志,2004,13（6）：548-553.DOI.10.3969/j. issn.1673-5552.2006.08.036. Yang L,Wang JW,Tang ZM,et al.Human recombinant endostatinⅠperiodclinicalresearch[J].ChinJNewDrugs,2004,13（6）：548-553.

［2］Yang P,Allen MS,Aubry MC,et al.Clinical features of 5,628 primary lung cancer patients：experience at Mayo Clinnic from 1997 to 2003[J].Chest,2005,128（1）：452-462.DOI：10.1378/chest.128. 1.452.

［3］Goeckenjan G.Lung cancer-historical development,current status, future prospects[J].Pneumologie,2010,64（9）：555-559.DOI：10. 1055/s-0030-1255636.

［4］Wang T,Nelson RA,Bogardus A,et al.Five-year lung cancer survival：which advanced stage nonsmall cell lung cancer patients attain long-term survival?[J].Cancer,2010,116（6）：1518-1525. DOI：10.1002/cncr.24871.

［5］張福君,李傳行,吳沛宏,等.125I粒子組織間植入治療局部晚期肺癌的對(duì)比研究.中華醫(yī)學(xué)雜志,2007,87（46）：3272-3275. DOI：10.3760/j.issn:0376-2491.2007.46.009. Zhang FJ,Li CX,Wu PH,et al.CT guided radioactive125I seed implantation in treating localized advanced pulmonary carcinoma[J]. Natl Med J China,2007,87（46）：3272-3275.

［6］霍小東,鄭廣鈞,柴樹(shù)德,等.CT引導(dǎo)下125I放射性粒子植入治療Ⅲ期非小細(xì)胞肺癌療效分析[J].中華放射醫(yī)學(xué)與防護(hù)雜志, 2012,32（2）：199-203.DOI.10.3760/cma.j.issn.0254-5098. 2012.02.023. Huo XD,Zheng GJ,Chai SD,et al.Clinical efficacy of CT-guided125l radioactive seeds implantation for stageⅢ o f non-small cell lung cancer[J].Chin J Radiol Med Prot,2012,32（2）：199-203.

［7］Kim YM,Hwang S,Kim YM,et al.Endostatin blocks vascular endothelial growth factor-mediated signaling via direct interaction with KDR/Flk-1[J].J Biol Chem,2002,277（31）：27872-27879. DOI：10.1074/jbc.M202771200.

［8］王金萬(wàn),孫燕,劉永煜,等.重組人血管內(nèi)皮抑素聯(lián)合NP方案治療晚期NSCLC隨機(jī)、雙盲、對(duì)照、多中心Ⅲ期臨床研究[J].中國(guó)肺癌雜志,2005,8（4）：283-290. Wang JW,Sun Y,Liu YY,et al.Resultsof randomized,multicenter,double-blind phaseⅢtrial of rh-endostatin（YH-16）in treatment of advanced non-small cell lung cancer patients[J].Chin J Lung Cancer,2005,8（4）：283-290.

［9］Zhang L,Ge W,Hu K,et al.Endostar down-regulates HIF-1 and VEGF expression and enhances the radioresponse to human lung adenocarcinoma cancer cells[J].Mol Biol Rep,2012,39（1）：89-95.DOI：10.1007/s11033-011-0713-6.

［10］Wen QL,Meng MB,Yang B,et al.Endostar,a recombined humanized endostatin,enhances the radioresponse for human nasopharyngeal carcinoma and human lung adenocarcinoma xenografts in mice[J].Cancer Sci,2009,100（8）：1510-1519.DOI：10.1111/j. 1349-7006.2009.01193.x.

［11］Jiang XD,Dai P,Wu J,et al.Inhibitory effect of radiotherapy combined with weekly endostatin on the human pulmonary adenocarcinoma A549 xenografts in nude mice[J].Lung Cancer,2011,72（2）：165-171.DOI：10.1016/j.lungcan.2010.09.003.

［12］Meng MB,Jiang XD,Deng L,et al.Enhanced radioresponse with a novel endostatin protein via tumor vasculature remodeling：experimental and clinical evidence[J].Radiother Oncol,2013,106（1）：130-137.DOI：10.1016/j.radonc.2012.10.022.

［13］You ZY,Zhao Y,Liu F,et al.The radiosensitization effects of Endostar on human lung squamous cancer cells H-520[J/OL].Cancer Cell Int,2010,10：17[2016-04-14].http：www.cancerci.com/ content/10/1/17.DOI：10.1186/1475-2867-10-17.

［14］Sugihara T,Magae J,Wadhwa R,et al.Dose and dose-rate effects of low-dose ionizing radiation on activation of Trp53 in immortalized murine cells[J].Radiat Res,2004,162（3）：296-307.

［15］Jain RK.Normalization of tumor vasculature：an emerging concept in antiangiogenic therapy[J].Science,2005,307（576）：58-62. DOI：10.1126/science.1104819.

［16］Jain RK.Normalizing tumor microenvironment to treat cancer：bench to bedside to biomarkers[J].J Clin Oncol,2013,31（17）：2205-2218.DOI：10.1200/JCO.2012.46.3653.

［17］Abdollahi A,Griggs DW,Zieher H,et al.Inhibition of αvβ3 integrin survival signaling enhances antiangiogenic and antitumor effects of radiotherapy[J].Clin Cancer Res,2005,11（17）：6270-6279.DOI：10.1158/1078-0432.CCR-04-1223.

［18］Peng F,Xu Z,Wang J,et al.Recombinant human endostatin normalizes tumor vasculature and enhances radiation response in xenografted human nasopharyngeal carcinoma models[J/OL].PLoS One,2012,7（4）：e34646[2016-04-14].https：//www.ncbi.nlm. nih.gov/pmc/articles/PMC3322143.DOI：10.1371/journal.pone. 0034646.

［19］Liu J,Zhang Y,Sun P,et al.Enhanced therapeutic efficacy of adenovirus-mediated interleukin-24 gene therapy combined with ionizing radiotherapy for nasopharyngeal carcinoma[J].Oncol Rep,2013, 30（3）：1165-1174.DOI：10.3892/or.2013.2550.

Sensitization effect of endostatin for125I brachytherapy on transplanted tumor in nude mice

Huo Xiaodong,Wang Huixing,Yan Weiliang,Jiao Ling,Zhang Wenyi,Zheng Guangjun,Wang Junjie,Yu Zhentao,Chai Shude
Department of Thoracic Surgery,the Second Hospital of Tianjin Medical University,Tianjin 300211,China（Huo XD,Yan WL,Zheng GJ,Chai SD）;Pain Management Center,the Second Hospital of Tianjin Medical University,Tianjin 300211,China（Wang HX）;Tianjin Key Laboratory of Radiation Medicine and Molecular Nuclear Medicine,Institute of Radiation Medicine,Chinese Academy of Medical Sciences, Tianjin 300192,China（Jiao L,Zhang WY）;Department of Radiation Oncology,Peking University Third Hospital,Beijing 100191,China（Wang JJ）;Tianjin Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy,Department of Esophageal Oncology,Cancer Institute and Hospital of Tianjin Medical University,Tianjin 300060,China（Yu ZT）

Chai Shude,Email：chaishude@126.com

ObjectiveTo investigate the radiation sensitization effect of endostatin on transplanted tumors in nude mice with125I radioactive seed.MethodsMice were randomly assigned to four groups（n=20）：control group（group A）,125I radioactive seed group（group B）,endostatin group（group C）,and125I radioactive seed combined with endostatin group（group D）.When the diameter of the transplanted tumor was greater than 2 cm,125I radioactive particles were implanted.The prescription dose was 20 Gy. Treatment planning system was used to calculate the target area and size of tumors.Endostatin was injected intraperitoneally at 20 mg/kg once every day for 14 days,and the changes in tumor growth and size were observed.The animals were sacrificed at 15 and 30 days.The expression levels of vascular endothelial growth factor（VEGF）and microvessel density（MVD）in tumor tissues were detected by immunohistochemistry,whereas αvβ3 mRNA levels were determined by RT-PCR.ResultsCompared with groups B and C,the tumor size,tumor weight,and tumor growth inhibitory rate of group D significantly increased at 15 and 30 days.The tumor size,tumor weight,and tumor growth inhibitory rate of groups B and D significantly increased at 30 days compared with those at 15 days.Immunohistochemical staining revealed that the expression levels of VEGF and MVD in group D were significantly different at 15 and 30 days compared with those in groups A,B,and C.The expression of VEGF and MVD in group C was significantly different at 15 and 30 days compared with that in groups A and B.VEGF and MVD in group C were significantly up-regulated at 30 days compared with those at 15 days.RT-PCR analysis demonstrated that the expression of αvβ3 mRNA in group B obviously increased with time compared with that in group A.Compared with group A,αvβ3 mRNA in group B was up-regulated,whereas αvβ3 mRNA in groups C and D was significantly down-regulated.Compared with groups C and B,group D exhibited a statistically significant difference.ConclusionEndostatin is helpful to brachytherapy of lung tumor with radiosensitizing enhancement effects.Changes in VEGF,MVD,and αvβ3 mRNA may be the rational treatment mechanism.

Endostatins;Lung neoplasms;Radiation-sensitizing agents;Brachytherapy

柴樹(shù)德，Email：chaishude@126.com

10.3760/cma.j.issn.1673-4114.2016.05.006

天津市自然科學(xué)基金（15JCYBJC28400）；天津醫(yī)科大學(xué)科學(xué)基金（2014KYQ27）

2016-04-14）