解朋 黃建敏 張芳 潘莉萍

050051石家莊，河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科

99Tcm-MAG3-isoDGR-2C分子探針的制備與體內(nèi)分布的實驗研究

解朋 黃建敏 張芳 潘莉萍

050051石家莊，河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科

目的 摸索99Tcm-MAG3-isoDGR-2C分子探針的標(biāo)記條件并研究其在正常昆明小鼠體內(nèi)的生物學(xué)分布。方法 利用葡庚糖酸鹽（GH）轉(zhuǎn)換絡(luò)合法進行標(biāo)記，即首先用99Tcm標(biāo)記GH形成99TcmO-GH中間體，再進行99Tcm-MAG3-isoDGR-2C的標(biāo)記；考察pH值和溫度等因素對標(biāo)記率的影響，采用高效液相色譜法鑒定標(biāo)記物的放射化學(xué)純度；取30只昆明小鼠隨機分成6組，分別于注射99Tcm-MAG3-isoDGR-2C 15、30、60、120、240和360 min后測定其在小鼠體內(nèi)的分布情況。結(jié)果 pH值為4.6、反應(yīng)溫度為100℃時的標(biāo)記率最高（94.2%）。體內(nèi)分布研究顯示該標(biāo)記物能夠較快地從血液中清除，且心、肺、脾、胃、骨等組織的放射性攝取均很少。結(jié)論99Tcm-MAG3-isoDGR-2C標(biāo)記率高、血液清除快，具備一定的成為SPECT顯像劑的條件。

分子探針；同位素標(biāo)記；異天冬氨酸-甘氨酸-精氨酸；體內(nèi)分布

惡性腫瘤的發(fā)病率逐年上升，而對惡性腫瘤的早診斷和早治療是影響到惡性腫瘤預(yù)后的關(guān)鍵因素，因此，如何對惡性腫瘤進行早期診斷和治療是目前研究的熱點和難點。整合素αvβ3因在腫瘤新生血管中高度表達(dá)而在正常血管低表達(dá)或不表達(dá)，成為了腫瘤相關(guān)領(lǐng)域的研究熱點。通過噬菌體肽庫篩選得到的小分子多肽精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp，RGD）具有與整合素αvβ3特異性結(jié)合的能力，目前大量的研究用放射性核素131I、99Tcm等對RGD及其衍生模序進行標(biāo)記，針對惡性腫瘤進行靶向治療或顯像，研究結(jié)果表明其具有較好的優(yōu)越性和潛在的應(yīng)用價值[1-2]。

除RGD能夠與整合素αvβ3特異性結(jié)合外，天冬酰胺-甘氨酸-精氨酸（Asn-Gly-Arg，NGR）小肽分子中的天冬酰胺能夠通過脫酰胺作用形成異天冬氨酸（isoAsp，isoD），使NGR變?yōu)閕soDGR，從而被整合素αvβ3特異性識別并結(jié)合[3]。Curnis等[4]通過將含有isoDGR序列的CisoDGRC與TNF融合形成isoDGR-TNF，結(jié)果發(fā)現(xiàn)無論是單獨使用還是聯(lián)合化療藥物，極低劑量的isoDGR-TNF（1～10 pg）即可以產(chǎn)生對荷淋巴瘤或纖維肉瘤裸鼠的抗腫瘤作用，這種抗腫瘤作用可以通過同時加入過量的游離CisoDGRC得到充分的抑制，而且isoDGR-TNF的抗腫瘤活性明顯強于單純的TNF。因此作者認(rèn)為isoDGR是一種能夠與αvβ3結(jié)合的模序。131I標(biāo)記的isoDGR兔VX2惡性腫瘤SPECT顯像研究也表明isoDGR對惡性腫瘤具有一定的靶向性[5]。本研究用99Tcm標(biāo)記MAG3-isoDGR-2C（其中，MAG3為β-N-巰基乙?；?甘氨酰-甘氨酰-甘氨酰；C為Cys），探討最佳標(biāo)記條件，測定標(biāo)記物體外穩(wěn)定性及在正常小鼠體內(nèi)的生物學(xué)分布，為后期的顯像和治療實驗提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1材料與儀器

材料：99Mo/99Tcm發(fā)生器由北京原子高科核技術(shù)應(yīng)用股份有限公司提供；MAG3-isoDGR-2C（圖1）由北京中科亞光生物科技有限公司合成，純度為97．03%；葡庚糖酸鹽（glucoheptonate，GH）藥盒由北京師宏藥物研制中心提供；乙腈（色譜純）購自北京依諾凱試劑有限公司；三氟乙酸、醋酸、醋酸鈉等試劑均購自北京化工廠；聚酰胺薄膜購自浙江臺州市路橋四甲生化塑料廠；昆明小鼠（雌性，清潔級，體重18～20 g）購自北京興隆養(yǎng)殖場。

儀器：FM-2000锝分析儀購自西安凱普機電有限責(zé)任公司；Waters 500 TR液相色譜儀購自美國Waters公司；FJ-391型同位素活度計購自北京核儀器廠。

圖1 MAG3-isoDGR-2C的分子結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Molecular structure of MAG3-isoDGR-2C

1．2 MAG3-isoDGR-2C水溶液的配置

1 mg MAG3-isoDGR-2C中加入1 mL注射用水，配置成1 mg/mL的水溶液。

1．399TcmO-GH中間體的制備

利用GH轉(zhuǎn)換絡(luò)合法行99Tcm標(biāo)記MAG3-isoDGR-2C前先進行99TcmO-GH中間體的制備。GH藥盒中加入1 mL新鮮的Na99TcmO4溶液（240．5 MBq），搖勻后室溫放置15 min即可得到99TcmO-GH。采用薄層色譜法鑒定其放射化學(xué)純度，展開劑分別為生理鹽水和乙腈，支撐物為聚酰胺薄膜。

1．4 反應(yīng)溫度對標(biāo)記率的影響

2 mL離心管中加入10 μL MAG3-isoDGR-2C溶液后，加入200 μL pH值為4．6的醋酸-醋酸鈉（HAc-NaAc）緩沖液，再加入99TcmO-GH中間體（2．405 MBq），充分搖勻后分別在室溫（24℃）及沸水浴（100℃）條件下反應(yīng)15 min。

采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法進行放射化學(xué)純度的鑒定，流動相為：A相，H2O（含0．1%三氟乙酸）；B相，乙腈（含0．1%三氟乙酸）。淋洗梯度如表1所示。

表1 HPLC法對標(biāo)記物進行放化純鑒定的淋洗梯度Table 1 Gradient elution of HPLC in determining the radiation chemical purity of MAG3-isoDGR-2C

1．5 pH值對標(biāo)記率的影響

2 mL離心管中加入10 μL MAG3-isoDGR-2C溶液后，分別加入200 μL的HAc-NaAc緩沖液（pH值分別為8、6、5．8、4．6），然后加入10 μL99TcmO-GH中間體（2．405 MBq），充分搖勻后100℃反應(yīng)15 min。參照1．4的方法對其進行鑒定。

1．6 室溫穩(wěn)定性的研究

將標(biāo)記好的99Tcm-MAG3-isoDGR-2C在室溫中分別放置30、60、120、240和360 min后，采用HPLC進行放化純的鑒定，觀察其體外的穩(wěn)定性。

1．799Tcm-MAG3-isoDGR-2C在正常小鼠體內(nèi)的生物學(xué)分布研究

將30只昆明小鼠隨機分為6組，每組5只，分別經(jīng)尾靜脈注射0．1 mL標(biāo)記成功的99Tcm-MAG3-isoDGR-2C（11．1 MBq），分別于注射后15、30、60、120、240、360 min將小鼠斷頸處死，迅速收集血液，解剖并取出心臟、肝臟、肺、腎臟、脾臟、胃、骨骼、肌肉、腸道、甲狀腺等，分別稱重并用锝分析儀測定計數(shù)，計算各臟器的放射性攝取率（%ID/g）。

2 結(jié)果

2．199TcmO-GH中間體的制備

本研究主要采用薄層色譜法對99TcmO-GH中間體進行鑒定，各組分的比移值如表2所示。在兩種薄層色譜體系下，各組分的比移值各不同，可以用于鑒定99TcmO-GH中間體。鑒定結(jié)果表明，99TcmOGH中間體的放化純?yōu)?6．28%，可用于后續(xù)多肽的標(biāo)記。

表2 99TcmO、99TcmO2·nH2O和99TcmO-GH在不同層析體系中的比移值Table 2 Flow rate of the materials in different chromatography systems

表2 99TcmO、99TcmO2·nH2O和99TcmO-GH在不同層析體系中的比移值Table 2 Flow rate of the materials in different chromatography systems

層析體系 99TcmO－4 99TcmO2·nH2O 99TcmO-GH聚酰胺-生理鹽水 0～0．1 0～0．1 0．8～1．0聚酰胺-乙腈 0．3～0．6 0～0．1 0～0．1

2．2 溫度對99Tcm-MAG3-isoDGR-2C標(biāo)記率的影響

實驗結(jié)果表明，在室溫條件下反應(yīng)15 min時，HPLC圖上未明顯顯示出保留時間為24 min的峰，說明在該條件下，MAG3-isoDGR-2C不能夠與99TcmO-GH進行配體交換；而在沸水?。?00℃）條件下反應(yīng)15 min時，在保留時間為24 min附近出現(xiàn)了較高的放射性峰，說明在該條件下能得到99Tcm-MAG3-isoDGR-2C配合物，且標(biāo)記率為94．2%（圖2）。

圖2 溫度為100℃、pH=4．6時99Tcm-MAG3-isoDGR-2C的高效液相色譜圖Fig.2 Highperformanceliquidchromatogramtodeterminethe radiation chemical purity of MAG3-isoDGR-2C underoptimal conditions

2．3 pH值對99Tcm-MAG3-isoDGR-2C放射化學(xué)純度的影響

實驗結(jié)果表明，當(dāng)pH值逐漸減小時，放射化學(xué)純度逐漸增加，即：當(dāng)pH=8．0和pH=6．0時，99Tcm-MAG3-isoDGR-2C的HPLC圖均為多重峰；當(dāng)pH=5．8時，99Tcm-MAG3-isoDGR-2C的放射化學(xué)純度為86．78%；當(dāng)pH=4．6時，99Tcm-MAG3-isoDGR-2C的放射化學(xué)純度為94．2%。

2．499Tcm-MAG3-isoDGR-2C的體外穩(wěn)定性

標(biāo)記成功的99Tcm-MAG3-isoDGR-2C在室溫中放置360 min后，雖然放射化學(xué)純度有所降低，但仍能夠保持在90%以上（圖3），表明該標(biāo)記物在室溫條件下穩(wěn)定性較好。

圖3 99Tcm-MAG3-isoDGR-2C在室溫條件下的穩(wěn)定性Fig.3 Stability of99Tcm-MAG3-isoDGR-2C in vitro

2．599Tcm-MAG3-isoDGR-2C在正常小鼠體內(nèi)的生物學(xué)分布

99Tcm-MAG3-isoDGR-2C在正常小鼠體內(nèi)的生物學(xué)分布結(jié)果如表3所示。由表3可以看出，99Tcm-MAG3-isoDGR-2C在小鼠體內(nèi)的血液清除較快，在60和120 min時血液里只有0．48和0．33%ID/g，而到240 min時僅剩下0．17%ID/g。各個時間點腎臟的放射性攝取均是最多的，但隨著時間的延長，其放射性攝取逐漸減低；而肝臟和腸道的攝取都相對較多，60min時的攝取分別是2．44%ID/g和1．69%ID/g；其余器官的放射性攝取均較低，心臟、肺、脾、胃、骨骼在60 min時的攝取率分別為0．23、0．41、0．19、0．27和0．27%ID/g。

表3 99Tcm-MAG3-isoDGR-2C在正常小鼠體內(nèi)的生物學(xué)分布[（±s）%ID/g,n=5]Table 3 Biodistribution of99Tcm-MAG3-isoDGR-2C in normal mice[（±s）%ID/g,n=5]

表3 99Tcm-MAG3-isoDGR-2C在正常小鼠體內(nèi)的生物學(xué)分布[（±s）%ID/g,n=5]Table 3 Biodistribution of99Tcm-MAG3-isoDGR-2C in normal mice[（±s）%ID/g,n=5]

組織或器官 15 min 30 min 60 min 120 min 240 min 360 min心臟 0.67±0.07 0.41±0.12 0.23±0.01 0.17±0.12 0.08±0.03 0.07±0.03肝臟 4.79±0.46 3.38±0.78 2.44±0.22 2.29±0.37 1.75±0.14 1.74±0.39肺1.68±0.24 0.99±0.21 0.41±0.03 0.35±0.08 0.18±0.03 0.18±0.08腎臟 8.02±1.38 5.95±1.96 3.60±0.32 2.85±0.42 2.11±0.44 2.01±0.96脾0.59±0.06 0.38±0.11 0.19±0.04 0.17±0.05 0.12±0.01 0.07±0.01胃0.49±0.11 0.35±0.10 0.27±0.05 0.25±0.15 0.17±0.31 0.12±0.32骨骼 0.98±0.21 0.65±0.12 0.27±0.07 0.25±0.04 0.16±0.03 0.15±0.05肌肉 0.49±0.07 0.41±0.11 0.16±0.02 0.11±0.03 0.06±0.01 0.04±0.01腸道 2.67±0.61 2.26±0.96 1.69±0.17 0.62±1.03 0.46±0.13 0.20±0.08血2.14±0.31 1.16±0.28 0.48±0.06 0.33±0.03 0.17±0.02 0.15±0.02甲狀腺 1.74±0.10 1.20±0.13 0.78±0.05 0.67±0.29 0.46±0.16 0.45±0.24

3 討論

isoDGR-2C為小分子肽，其相對分子質(zhì)量為839.79，與大分子蛋白質(zhì)及多肽相比，其相對分子質(zhì)量小，具有以下優(yōu)點：（1）與受體的親和力可能比受體和受體片段更強；（2）易于合成、易于結(jié)構(gòu)修飾；（3）很少引起免疫反應(yīng)；（4）能夠有效地避免肝臟、脾臟及腎臟的過度攝取，而且快速的血液清除可以提供高靶與非靶比值，改善顯像質(zhì)量。在isoDGR兩端加入半胱氨酸是為了保護核心多肽（isoDGR）的穩(wěn)定性，而在小分子肽的分子結(jié)構(gòu)中引入螯合基團MAG3并不影響它們與受體結(jié)合的特性，而且更加容易標(biāo)記。

雖然目前已經(jīng)有研究者對核素標(biāo)記的isoDGR進行了相關(guān)的研究和報道，但研究使用的放射性核素為131I，而99Tcm與131I比較具有以下優(yōu)越性[6-7]：99Tcm是臨床上最常用的放射性核素，其具有優(yōu)良的核素性能，是純γ光子發(fā)射體，得到的SPECT圖像質(zhì)量更加清晰；99Tcm半衰期為6.02 h，為前期放射性顯像劑的合成預(yù)留了足夠時間；通過99Mo/99Tcm發(fā)生器制備，容易獲得；標(biāo)記過程相對簡單。另外，131I進行標(biāo)記的過程中還需要對標(biāo)記物進行純化，這不利于后期試驗的開展。

采用轉(zhuǎn)換絡(luò)合法進行放射性核素99Tcm對多肽的標(biāo)記具有能夠較好地保持多肽的生物學(xué)活性的優(yōu)點[8-10]，因此，本研究采用GH轉(zhuǎn)換絡(luò)合法進行放射性核素99Tcm標(biāo)記MAG3-isoDGR-2C，在對標(biāo)記條件進行優(yōu)化后，得到了放射化學(xué)純度達(dá)到94%以上的配合物，且標(biāo)記方法相對簡單，體外穩(wěn)定性好。

體內(nèi)生物學(xué)分布的研究顯示了該標(biāo)記物能夠較快地從血液中清除；腎臟的放射性攝取在各個時間點都是最多的，但隨著時間的延長，其放射性攝取也在逐漸降低，說明該標(biāo)記物主要經(jīng)泌尿系統(tǒng)排泄，這可能與其具有較高的水溶性有關(guān)；而肝臟和腸道的攝取都相對較多，這可能是因為該標(biāo)記物需要從肝臟進行代謝，進而通過腸道排出體外所致；心臟、肺、脾、胃、骨骼等的放射性攝取都很少，這能夠有效地減低本底的攝取。

總之，99Tcm-MAG3-isoDGR-2C具備一定的成為SPECT顯像劑的基礎(chǔ)，而本研究為后續(xù)的該標(biāo)記物在荷瘤鼠體內(nèi)的生物學(xué)分布以及SPECT顯像研究提供了基礎(chǔ)和實驗準(zhǔn)備。

利益沖突 本研究由署名作者按以下貢獻聲明獨立開展，不涉及任何利益沖突。

作者貢獻聲明 解朋、黃建敏負(fù)責(zé)研究命題的提出、設(shè)計、論文起草；張芳、潘莉萍負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)的獲取、研究過程的實施。

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Labeling MAG3-isoDGR-2C with99Tcmand its biodistribution in mice

Xie Peng,Huang Jianmin, Zhang Fang,Pan Liping
Department of Nuclear Medicine,the Third Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang 050051,China

Huang Jianmin,Email：jm_huang2003@126.com

ObjectiveTo analyze the feasibility of labeling MAG3-isoDGR-2C with99Tcmand investigate the biodistribution of the tracer in normal mice.MethodsGlucoheptonate was initially labeled with99Tcmas the intermediate,followed by MAG3-isoDGR-2C.High-performance liquid chromatography was employed to determine the radiochemical purity.The biodistribution of99Tcm-MAG3-isoDGR-2C was studied at 15,30,60,120,240 and 360 min after caudal vein injection in normal mice.ResultsMAG3-isoDGR-2C was successfully labeled with99Tcm,and the radiochemical purity was 94.2%.The biodistribution revealed that the tracer was rapidly cleared out from the blood with mild activity in the heart,lung,spleen,stomach,and bone.Conclusions MAG3-isoDGR-2C was labeled with99Tcmwith high radiochemical purity,and the tracer could be cleared out quickly.Therefore,MAG3-isoDGR-2C is a potential molecular tracer in the study of early cancer diagnosis.

Molecular probes;Isotope labeling;IsoAsp-Gly-Arg;BiodistributionFund program：Natural Science Foundation of Hebei Province（H2014206286）

黃建敏，Email：jm_huang2003@126.com

10.3760/cma.j.issn.1673-4114.2016.05.004

河北省自然科學(xué)基金（H2014206286）

2016-07-29）