摘 要：本文按著《中國藥典》2010年版的檢測方法，對我公司生產(chǎn)的氨酚曲馬多分散片進(jìn)行微生物方法學(xué)驗證，以確定檢測方法是否可行。

關(guān)鍵詞：氨酚曲馬多分散片；微生物限度檢查；方法學(xué)驗證

《中國藥典））2010版二部[1]規(guī)定，當(dāng)建立產(chǎn)品的微生物限度檢査法時，應(yīng)進(jìn)行細(xì)菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法的驗證，以確認(rèn)所采用的方法適合于該產(chǎn)品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌數(shù)的測定。若產(chǎn)品的組分或原檢驗條件發(fā)生改變可能影響檢驗結(jié)果時，計數(shù)方法應(yīng)重新驗證。驗證時，按供試液的制備和細(xì)菌、霉菌及酵母菌計數(shù)所規(guī)定的方法及下列要求進(jìn)行。對各試驗菌的回收率應(yīng)逐一進(jìn)行驗證。依據(jù)《中國藥典》2010年版二部附錄XIJ“微生物限度檢查法”，對氨酚曲馬多分散片的微生物限度檢查法進(jìn)行了方法學(xué)驗證，驗證結(jié)果如下：

1 試驗材料

1.1 儀器：二級生物安全柜、壓力蒸汽滅菌器、電熱鼓風(fēng)干燥箱、生化培養(yǎng)箱等。

1.2 供試樣品：氨酚曲馬多分散片，本公司生產(chǎn)，規(guī)格：鹽酸曲馬多37.5mg，對乙酰氨基酚325mg，批號：20140106。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)菌種：金黃色葡萄球菌CMCC（B）26003；大腸埃希菌CMCC（B）44102；枯草芽孢桿菌CMCC（B）63501；白色念珠菌CMCC（F）98001；黑曲霉菌CMCC（F）98003。

1.4 試驗用培養(yǎng)基：營養(yǎng)瓊脂對照培養(yǎng)基，批號：135003-201103；玫瑰紅鈉瓊脂對照培養(yǎng)基，批號：135005-201103；膽鹽乳糖對照培養(yǎng)基，批號：135006-201104；營養(yǎng)肉湯對照培養(yǎng)基，批號：135004-201103；改良馬丁對照培養(yǎng)基，批號：135002-201002；曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基，批號：051020；以上培養(yǎng)基均從中檢院購進(jìn)。

1.5 菌液制備

取金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，30-35℃培養(yǎng)18-24小時，接種白色念珠菌的新鮮斜面培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中，于23-28℃培養(yǎng)24小時，分別取上述培養(yǎng)液用0.9%的無菌氯化鈉溶液稀釋至10-6、10-7、10-5，10-5備用。取黑曲霉菌的新鮮斜面培養(yǎng)物，加5ml0.9%無菌氯化鈉水溶液，將孢子洗下，吸取菌液1ml至無菌比色管中，加適量0.9%的氯化鈉溶液，與標(biāo)準(zhǔn)比濁管比濁，取比濁后的菌懸液用0.9%的氯化鈉溶液稀釋至10-4，備用。

1.6 供試液制備

稱取本品10g，加入pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100ml，分散混勻使溶解，制成1：10供試液。

2 方法學(xué)驗證試驗[2]

2.1 細(xì)菌計數(shù)方法驗證

2.1.1 試驗組：取1：10供試液10ml，置無菌條件下離心（500轉(zhuǎn)/分）5分鐘，取上清液置無菌試管中，用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液補足10ml，再從中取1ml加適量稀釋劑，依《中國藥典》2010年版二部附錄XIJ“微生物限度檢查法”中薄膜過濾法過濾，沖洗量300ml并在最后一次沖洗液中加入1ml相應(yīng)的陽性試驗菌，取出濾膜，膜面朝上，貼于營養(yǎng)瓊脂平板上，按規(guī)定培養(yǎng)，測定氨酚曲馬多分散片的細(xì)菌數(shù)。

2.1.2 菌液組：取稀釋好的各菌液1ml，加9ml稀釋劑，低速離心——薄膜過濾（方法同試驗組）測定所加的試驗菌數(shù)。

2.1.3 供試品對照組：按試驗組方法，測定供試品本底細(xì)菌數(shù)。

2.1.4 稀釋劑對照組：取稀釋劑替代供試液，按試驗組的方法測定其菌數(shù)。

2.2 霉菌及酵母菌計數(shù)方法驗證

2.2.1 試驗組：取1：10供試液1ml加入陽性試驗菌1ml，立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，置規(guī)定條件培養(yǎng)，每種試驗菌平行制備二個平皿，測定其霉菌及酵母菌數(shù)。

2.2.2 菌液組：取稀釋好的各菌液1ml，方法同試驗組，分別加入平皿中，加入玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，置規(guī)定條件培養(yǎng)，測定所加的試驗菌數(shù)。

2.2.3 供試品對照組：取規(guī)定量供試液，按菌落計數(shù)法測定供試品本底菌數(shù)。

2.2.4 稀釋劑對照組：取稀釋劑替代供試液，方法同試驗組。

試驗組菌回收率（%）= ■×100%

稀釋劑對照組菌回收率（%）=■×100%

試驗結(jié)果見表1。

2.3 控制菌檢查方法的驗證：常規(guī)法。

2.3.1 菌種

2.3.1.1 陽性菌：大腸埃希菌（44102）

2.3.1.2 陰性菌：金黃色葡萄球菌（26003）

2.3.2 試驗方法

2.3.2.1 試驗組：取1：10供試液10ml，加入100ml膽鹽乳糖增菌液中，再加1ml陽性菌（即大腸埃希菌濃度同細(xì)菌數(shù)驗證），搖勻，置35-37℃培養(yǎng)18-48小時依《中國藥典》2010年版二部附錄XIJ“微生物限度檢查法”中控制菌檢查法，檢查其控制菌，即大腸埃希菌。

2.3.2.2 陰性對照組：方法同試驗組，加入1ml陰性菌（即金黃色葡萄球菌濃度同細(xì)菌數(shù)驗證）。

試驗結(jié)果見表2。

3 結(jié)果判斷

3.1 計數(shù)法驗證

在三次獨立的平行試驗中，稀釋劑對照組的菌回收率均大于70%，試驗組的菌回收率均大于70%，故可照該供試液制備方法和計數(shù)法測定氨酚曲馬多分散片的細(xì)菌、霉菌及酵母菌數(shù)。

3.2 控制菌檢查法驗證

陰性對照組未檢出陰性對照菌，試驗組檢出陽性試驗菌，故可以照此供試液制備法和控制菌檢查法進(jìn)行氨酚曲馬多分散片的控制菌檢查。

4 檢驗結(jié)果

表1 細(xì)菌、霉菌及酵母菌數(shù)驗證試驗（20140106）

表2 控制菌驗證試驗結(jié)果（20140106）

5 結(jié)論

經(jīng)以上微生物方法學(xué)驗證，確定《中國藥典》2010版二部的方法適合于氨酚曲馬多分散片的細(xì)菌、霉菌及酵母菌數(shù)的測定。

參考文獻(xiàn)

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典二部[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄107-116.

[2]中國藥品生物制品檢定所.中國藥品中國藥品檢驗標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范

[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：351-369.

作者簡介：孫巍（1981，11-），女，漢族，齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院，制藥工程專業(yè)工程師，多多藥業(yè)有限公司從事藥品質(zhì)量管控工作。