金亞香，沈玉杰，趙毅，房學(xué)東(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，長(zhǎng)春 30033； 長(zhǎng)春職業(yè)技術(shù)學(xué)院)

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葉酸與八聚精氨酸雙修飾脂質(zhì)體的制備及其功效觀察

金亞香1，沈玉杰1，趙毅2，房學(xué)東1(1吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，長(zhǎng)春 130033；2 長(zhǎng)春職業(yè)技術(shù)學(xué)院)

摘要：目的制備葉酸與穿膜肽八聚精氨酸(R8)雙修飾的脂質(zhì)體，并觀察其功效。方法采用注入法制備葉酸與穿膜肽R8雙修飾的脂質(zhì)體(FA-R8-LPs)，采用激光粒度分析儀對(duì)脂質(zhì)體粒徑和電位進(jìn)行測(cè)定，采用瓊脂糖凝膠電泳方法考察脂質(zhì)體與VEGF siRNA的結(jié)合度，分別采用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法、激光共聚焦顯微鏡觀察及Western blotting法觀察載有VEGF siRNA脂質(zhì)體對(duì)口腔癌KB細(xì)胞的抗腫瘤效果。結(jié)果葉酸與穿膜肽R8雙修飾的脂質(zhì)體粒徑為(112.5±3.7)nm，電位為(3.23±0.88)mV。FA-R8-LPs已基本完全與VEGF siRNA結(jié)合(FA-R8-LPs-siRNA)。FA-R8-LPs-siRNA對(duì)KB細(xì)胞的抑制率為44.5%，平均熒光強(qiáng)度值是未修飾脂質(zhì)體的5倍左右。FA-R8-LPs與未修飾的脂質(zhì)體相比明顯提高了轉(zhuǎn)染效率。結(jié)論成功制備了葉酸與穿膜肽R8雙修飾的脂質(zhì)體，該脂質(zhì)體能增強(qiáng)VEGF siRNA的抗腫瘤效果。

關(guān)鍵詞：葉酸；穿膜肽；八聚精氨酸；脂質(zhì)體

目前，核酸類(lèi)藥物是治療惡性腫瘤的有效手段，但其具有容易被核酸酶降解、與細(xì)胞膜相互排斥、跨膜能力弱等特點(diǎn)[1～3]，高效率、低成本、低毒的藥物載體是解決以上問(wèn)題的關(guān)鍵。細(xì)胞穿膜肽又稱(chēng)蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域，具有攜帶比自身大100倍的物質(zhì)穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞的能力。八聚精氨酸(R8)是由8個(gè)精氨酸組成的穿膜肽，能夠穿過(guò)與之相接觸的任何細(xì)胞的細(xì)胞膜，具有高效的穿膜作用，能夠應(yīng)用于核酸藥物的傳遞過(guò)程[4,5]。葉酸是一種水溶性維生素，能特異性結(jié)合葉酸受體，是公認(rèn)的對(duì)于腫瘤細(xì)胞具有靶向性的配體[6～8]，將葉酸與R8兩種配體結(jié)合，制備雙修飾的脂質(zhì)體，裝載核酸類(lèi)藥物，以增強(qiáng)核酸類(lèi)藥物的抗腫瘤效果鮮有報(bào)道。本研究將葉酸和穿膜肽R8連接到脂質(zhì)體的表面，制備雙修飾的脂質(zhì)體，并觀察其功效。

1材料與方法

1.1儀器與試劑BP221S型電子天平(德國(guó)賽多利斯)；Mastersizer 2000型激光粒度分析儀(英國(guó)馬爾文儀器有限公司)；710 LSMNLO型激光共聚焦顯微鏡(德國(guó)卡爾·蔡司公司股份公司)；EPICS XL型流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckman Coulter公司)；Synergy4型多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)BioTek公司)。R8 peptide(Cys-RRRRRRRR，成都凱捷生物科技有限公司)；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)siRNA和5′-Cy3-VEGF siRNA(百奧邁科有效公司)；FA-PEG2000-DSPE(美國(guó)nanocs公司)；蛋黃卵磷脂(EPC，廣州漢方有限公司)；膽固醇(北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司)；其他試劑均為分析純。

1.2細(xì)胞KB細(xì)胞為人口腔表皮癌細(xì)胞株，使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，并加入100 μg/mL、鏈霉素和100 U/mL青霉素，于37 ℃孵箱中培養(yǎng)，采用0.25%胰蛋白酶?jìng)鞔?/p>

1.3脂質(zhì)體的制備分別精密稱(chēng)取EPC、膽固醇、FA-PEG2000-DSPE適量溶于氯仿乙醇溶液(體積比為5∶1)中，超聲使之溶解。將上述磷脂溶液按照1∶9的體積比注入到Hepes緩沖液中，形成脂質(zhì)體溶液，將穿膜肽R8與磷脂摩爾比為3∶17的比例加入到上述脂質(zhì)體溶液中，制備葉酸與R8雙修飾的脂質(zhì)體(FA-R8-LPs)。按照同樣方法，分別制備R8修飾的脂質(zhì)體(R8-LPs)、葉酸修飾的脂質(zhì)體(FA-LPs)和空白無(wú)修飾脂質(zhì)體(C-LPs)。為了獲得載有VEGF siRNA的脂質(zhì)體，首先將上述脂質(zhì)體溶液過(guò)0.22 μm的濾膜除菌，將VEGF siRNA溶于焦碳酸二乙酯(DEPC)水中，將siRNA與脂質(zhì)體溶液在無(wú)菌條件下混合均勻，使得siRNA的終濃度為0.5 mmol/L，將上述載藥脂質(zhì)體超聲10 s，備用。分別取載有VEGF siRNA的上述脂質(zhì)體100 μL，用超純水稀釋至1 mL，采用激光粒度分析儀對(duì)粒徑和電位進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)樣品平行測(cè)定3次。采用瓊脂糖凝膠電泳方法考察脂質(zhì)體與siRNA的結(jié)合度。首先制備瓊脂糖凝膠，稱(chēng)取2 g瓊脂糖溶于100 mL TAE緩沖液中，加熱后冷卻，保證沒(méi)有氣泡，加入10 μL溴化乙錠溶液，輕搖使其混勻，倒入電泳膠槽，待冷卻后備用。制備脂質(zhì)體與siRNA溶液，用DEPC水將各樣品總體積補(bǔ)充到10 μL，每個(gè)樣品加入2 μL上樣緩沖液，加入上樣槽中，保持電壓在100 mV運(yùn)行20 min。最后將瓊脂糖膠放于紫外凝膠成像系統(tǒng)中分析。

1.4載有VEGF siRNA脂質(zhì)體對(duì)KB細(xì)胞的作用①脂質(zhì)體載體毒性檢測(cè)：將KB細(xì)胞計(jì)數(shù)后，稀釋至1×105/mL濃度，按每孔1×104個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，每組設(shè)6個(gè)平行孔，置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。24 h后，棄培養(yǎng)液，PBS洗3遍，分別設(shè)立空白對(duì)照組和樣品組，樣品組中未載有siRNA的脂質(zhì)體包括C-LPs、R8-LPs、FA-LPs和FA-R8-LPs，載有VEGF siRNA的脂質(zhì)體組樣品包括C-LPs-siRNA、R8-LPs-siRNA、FA-LPs-siRNA、FA-R8-LPs-siRNA，將上述樣品分別加入96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)4 h。棄培養(yǎng)基，加入新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后每孔加入10 μL的5 mg/mL的MTT溶液，置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h，吸掉溶液后加入100 μL的DMSO，混勻后于540 nm處用酶標(biāo)儀檢測(cè)。②KB細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)體的攝?。篴.采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。將KB細(xì)胞用無(wú)葉酸培養(yǎng)基稀釋至1×105/mL濃度，按每孔1×105個(gè)細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板中，每組設(shè)3個(gè)平行孔，置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。24 h后制備不同的VEGF siRNA脂質(zhì)體樣品，其中VEGF siRNA采用5′-Cy3(紅色熒光)進(jìn)行標(biāo)記。棄去培養(yǎng)液，PBS洗3遍，按順序加入制備好的脂質(zhì)體/siRNA體系樣品，同時(shí)設(shè)計(jì)游離的siRNA(Naked siRNA)組，即未加入任何載體的siRNA組作為對(duì)照。分別置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h后，消化細(xì)胞，離心后加入500 μL 4%的甲醛溶液固定，收集全部溶液置于流式細(xì)胞儀測(cè)定管中，樣品可在4 ℃避光條件下保存，待用。b.采用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察。轉(zhuǎn)染過(guò)程同a，加入Naked siRNA和FA-R8-LPs-siRNA樣品。轉(zhuǎn)染結(jié)束后，吸出培養(yǎng)液，洗3次，加入4%的甲醛進(jìn)行固定，洗去固定液。采用DAPI染色細(xì)胞核3 min，洗去染色液，再次用PBS洗3次，置于激光共聚焦顯微鏡下進(jìn)行拍照。③KB細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)體的攝取機(jī)制：將KB細(xì)胞用無(wú)葉酸培養(yǎng)基稀釋至1×105/mL濃度，按每孔1×105個(gè)細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h后加入不同的VEGF siRNA脂質(zhì)體樣品，同時(shí)加入蔗糖(網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用抑制劑)、制霉菌素(細(xì)胞膜介導(dǎo)的的內(nèi)吞作用)和細(xì)胞松弛素D(胞吞作用抑制劑)3種抑制劑與樣品同時(shí)孵育4 h。采用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度，初步探索脂質(zhì)體進(jìn)入細(xì)胞的攝取機(jī)制[9]。④KB細(xì)胞VEGF蛋白檢測(cè)：將KB細(xì)胞用無(wú)葉酸培養(yǎng)基稀釋至1×105/mL濃度，按每孔2×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h后加入不同的VEGF siRNA脂質(zhì)體樣品和無(wú)載體樣品Naked siRNA，孵育4 h后加入胎牛血清，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，采用細(xì)胞裂解液將KB細(xì)胞裂解，提取總蛋白，定量蛋白后，采用SDS電泳對(duì)蛋白進(jìn)行分離，轉(zhuǎn)膜后以GAPDH為內(nèi)標(biāo)，分別對(duì)GAPDH和VEGF蛋白進(jìn)行一抗、二抗孵育，顯影后觀察蛋白下調(diào)效果。

2結(jié)果

FA-R8-LPs、R8-LPs、FA-LPs和C-LPs脂質(zhì)體粒徑和電位測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。與Naked siRNA相比，4種脂質(zhì)體均與siRNA呈現(xiàn)了不同程度的結(jié)合，其中FA-R8-LPs和R8-LPs與siRNA結(jié)合效果較好，已基本完全與siRNA結(jié)合，C-LPs和FA-LPs與siRNA的結(jié)合效果相對(duì)較差，siRNA的亮度較明顯。

表1　4種脂質(zhì)體粒徑和電位比較±s)

注：與C-LPs脂質(zhì)體比較，*P<0.01。

MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，C-LPs、R8-LPs、FA-LPs和FA-R8-LPs各脂質(zhì)體對(duì)KB細(xì)胞無(wú)明顯毒性，細(xì)胞存活率分別為98.545%、96.334%、97.546%、96.387%。與空白對(duì)照組相比，C-LPs-siRNA、R8-LPs-siRNA、FA-LPs-siRNA、FA-R8-LPs-siRNA對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率分別為11.446%、25.666%、27.453%、44.527%，后三者與空白對(duì)照組比較，P均<0.01。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組和Naked siRNA相比，C-LPs-siRNA、R8-LPs-siRNA、FA-LPs-siRNA和FA-R8-LPs-siRNA均有明顯的熒光遷移，其中遷移程度由大到小分別為FA-R8-LPs-siRNA、FA-LPs-siRNA、R8-LPs-siRNA和C-LPs-siRNA。C-LPs-siRNA、R8-LPs-siRNA、FA-LPs-siRNA和FA-R8-LPs-siRNA的平均熒光強(qiáng)度值分別為4.533±0.802、8.467±1.050、11.467±1.504、20.400±2.326，高于空白對(duì)照組(0.367±0.058)和Naked siRNA組(2.500±0.854)，P均<0.01。激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)A-R8-LPs-siRNA較Naked siRNA將大量siRNA轉(zhuǎn)染進(jìn)入到KB細(xì)胞內(nèi)，使得腫瘤細(xì)胞的熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)。

與無(wú)抑制劑相比，制霉菌素和細(xì)胞松弛素D處理的KB細(xì)胞熒光強(qiáng)度值未見(jiàn)明顯變化，而蔗糖作為抑制劑顯著降低了KB細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度，見(jiàn)表2。與空白對(duì)照組相比，Naked siRNA、C-LPs-siRNA、R8-LPs-siRNA、FA-LPs-siRNA和FA-R8-LPs-siRNA均對(duì)VEGF蛋白有一定的抑制效果(P均<0.01)，VEGF蛋白相對(duì)下調(diào)量分別為11.68%、23.69%、57.77%、54.10%、60.86%。

表2　3種抑制劑處理的KB細(xì)胞熒光強(qiáng)度比較±s)

注：與無(wú)抑制劑相比，*P<0.01。

3討論

VEGF是最有效的促血管生長(zhǎng)因子，對(duì)腫瘤新生血管形成及腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移起重要作用[10～12]。以VEGF及其受體為靶點(diǎn)，抑制腫瘤的發(fā)生與發(fā)展是抗癌藥物研究的熱點(diǎn)。本研究制備了葉酸與穿膜肽R8雙修飾的脂質(zhì)體，同時(shí)對(duì)一種VEGF siRNA進(jìn)行裝載，對(duì)其功效進(jìn)行了系統(tǒng)的評(píng)價(jià)，同時(shí)對(duì)轉(zhuǎn)染機(jī)制進(jìn)行了初步考察。希望通過(guò)該載體高效地將VEGF siRNA轉(zhuǎn)染進(jìn)入到腫瘤細(xì)胞，發(fā)生RNA干擾[13]現(xiàn)象，降低VEGF的表達(dá)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡或死亡的現(xiàn)象，提高抗腫瘤效果。

首先，為了評(píng)價(jià)制備脂質(zhì)體的性質(zhì)是否適用于進(jìn)入到腫瘤部位，對(duì)制備的幾種脂質(zhì)體進(jìn)行粒徑和電位進(jìn)行評(píng)價(jià)，雙修飾脂質(zhì)體粒徑為(112.5±3.7)nm，粒徑有利于載體在腫瘤部位的富集，同時(shí)具有較強(qiáng)的正電荷，因此利于與帶負(fù)電荷的siRNA結(jié)合，轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞，進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤功效。脂質(zhì)體與siRNA結(jié)合度考察結(jié)果顯示，雙修飾的脂質(zhì)體能夠較好地與siRNA結(jié)合，進(jìn)而有利于進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，而葉酸單修飾的脂質(zhì)體與siRNA的結(jié)合能力較弱，可能由于與siRNA產(chǎn)生了陰離子競(jìng)爭(zhēng)。

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，雙修飾后的脂質(zhì)體載體能夠較高效率地將siRNA轉(zhuǎn)染進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)凋亡或者死亡現(xiàn)象，腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率明顯上升，而未載藥的脂質(zhì)體無(wú)明顯毒性，表明脂質(zhì)體載體安全可靠。流式細(xì)胞儀檢測(cè)、激光共聚焦顯微鏡觀察KB細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)體的攝取實(shí)驗(yàn)中，雙修飾的脂質(zhì)體進(jìn)入腫瘤細(xì)胞明顯，直觀地反映了制備的載體能夠?qū)EGF siRNA裝載進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，釋放核酸藥物，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)抗腫瘤效果。同時(shí)采用了Western blotting實(shí)驗(yàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的VEGF蛋白進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)采用雙修飾脂質(zhì)體裝載siRNA對(duì)腫瘤細(xì)胞的VEGF蛋白起到明顯下調(diào)效果，這也是導(dǎo)致MTT實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞出現(xiàn)凋亡或死亡現(xiàn)象的主要原因。

為了對(duì)本研究制備的體系進(jìn)入腫瘤細(xì)胞的過(guò)程進(jìn)行探討，進(jìn)行了細(xì)胞內(nèi)吞機(jī)制的初步研究，可初步判斷，脂質(zhì)體的攝取可能是通過(guò)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用。這也為今后對(duì)于該載體的進(jìn)一步體內(nèi)研究提供了一定的參考和依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1] Avolio TM, Lee Y, Feng N, et al. RNA interference targeting the R2 subunit of ribonucleotide reductase inhibits growth of tumor cells in vitro and in vivo[J]. Anticancer Drugs, 2007,18(4):377-388.

[2] Lee M, Kim SW. Polyethylene glycol-conjugated copolymers for plasmid DNA delivery[J]. Pharm Res, 2005,22(1):1-10.

[3] Yan Y, Johnston AP, Dodds SJ, et al. Uptake and intracellular fate of disulfide-bonded polymer hydrogel capsules for Doxorubicin delivery to colorectal cancer cells[J]. ACS Nano, 2010,4(5):2928-2936.

[4] 何笑冬,舒小鐳,李少林.雙功能RGD-R8修飾阿霉素脂質(zhì)體的制備及其體外評(píng)價(jià)[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2014,36(20):2103-2106.

[5] 張楠,白銀,趙景狀,等.多聚精氨酸融合增強(qiáng)型綠色熒光蛋白制備方法及穿膜效果[J].生物工程學(xué)報(bào),2013,29(11):1644-1653.

[6] 張奇,張友九,楊科亞,等.葉酸受體陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞對(duì)Folate-PGA偶聯(lián)酶的特異性結(jié)合[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2007,23(6):746-750.

[7] 閆穎,齊憲榮.以葉酸受體為靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì)體的制備與性質(zhì)考察[J].藥學(xué)學(xué)報(bào),2008,43(11):1134-1139.

[8] 趙潔,夏亞丹,劉艷艷.葉酸偶聯(lián)白蛋白納米粒的應(yīng)用研究進(jìn)展[J].山東醫(yī)藥,2015,55(22):97-99.

[9] Zhang Y, Zhou C, Kwak KJ, et al. Efficient siRNA delivery using a polyamidoamine dendrimer with a modified pentaerythritol core[J]. Pharm Res, 2012,29(6):1627-1636.

[10] 楊輝,徐笑紅.靶向VEGF-C的siRNA表達(dá)載體對(duì)人乳腺癌細(xì)胞VEGF-C基因表達(dá)的影響[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)生,2015,53(10):1-3.

[11] 黃秋林,劉璇,陽(yáng)勇,等.靶向肝癌HepG2細(xì)胞VEGF基因siRNA表達(dá)載體裸鼠成瘤抑制作用[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)藥雜志,2013,23(14):18-19.

[12] Takahashi S. Vascular endothelial growth factor (VEGF), VEGF receptors and their inhibitors for antiangiogenic tumor therapy[J]. Biol Pharm Bull, 2011,34(12):1785-1788.

[13] Morille M, Passirani C, Vonarbourg A, et al. Progress in developing cationic vectors for non-viral systemic gene therapy against cancer[J]. Biomaterials, 2008,29:3477-3496.

(收稿日期：2015-08-27)

中圖分類(lèi)號(hào)：R318

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-266X(2016)11-0038-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.11.014

通信作者：房學(xué)東(E-mail: fangxdooo@sina.com)