任明，許真真 (鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院中藥學(xué)部，鄭州 450001)

?

HPLC-UV切換波長(zhǎng)法同時(shí)測(cè)定復(fù)方甘草合劑中甘草苷、異甘草苷、甘草素和甘草酸

任明，許真真 (鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院中藥學(xué)部，鄭州 450001)

摘要：目的建立同時(shí)測(cè)定復(fù)方甘草合劑中甘草苷、異甘草苷、甘草素和甘草酸的含量的評(píng)價(jià)方法。方法3批復(fù)方甘草合劑(批號(hào)：130112、130113、130201)。制備甘草苷、異甘草苷、甘草素和甘草酸混合對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性供試品溶液(復(fù)方甘草合劑缺甘草的陰性樣品)。采用Venusil XBP-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱，0.4%冰醋酸-甲醇梯度洗脫，體積流量為1.0 mL/min，運(yùn)用HPLC-UV切換波長(zhǎng)法檢測(cè)3種溶液。結(jié)果甘草苷、異甘草苷、甘草素和甘草酸分別在44.20～1 326、8.92～267.6、13.68～410.4和148.40～4 452 ng范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好(r分別為0.999 2、0.999 1、0.999 2、0.999 6)，加樣回收率分別為98.63%(RSD=1.12%)、99.13%(RSD=1.04%)、98.65%(RSD=1.06%)和99.10%(RSD=0.90%)。批號(hào)為130112的復(fù)方甘草合劑中甘草苷、異甘草苷、甘草素、甘草酸含量分別為67.22、17.00、24.82、2 881.93 μg/mL，RSD分別為1.32%、0.87%、2.34%、2.17%；批號(hào)為130113的復(fù)方甘草合劑中甘草苷、異甘草苷、甘草素、甘草酸含量分別為68.59、16.99、23.74、2 798.72 μg/mL，RSD分別為1.99%、1.33%、1.69%、1.86%；批號(hào)為130201的復(fù)方甘草合劑中甘草苷、異甘草苷、甘草素、甘草酸含量分別為67.91、15.98、24.16、2 824.55 μg/mL，RSD分別為2.17%、2.21%、1.77%、0.97%。結(jié)論HPLC-UV切換波長(zhǎng)法可用于同時(shí)測(cè)定復(fù)方甘草合劑中甘草苷、異甘草苷、甘草素和甘草酸的含量。

關(guān)鍵詞：復(fù)方甘草合劑；HPLC-UV切換波長(zhǎng)法；甘草苷；異甘草苷；甘草素；甘草酸

復(fù)方甘草合劑是由甘草流浸膏、復(fù)方樟腦酊、愈創(chuàng)木酚甘油醚及甘油等藥物組成的中藥制劑，可祛痰鎮(zhèn)咳，主要用于治療咳嗽和上呼吸道感染。甘草苷、異甘草苷、甘草素和甘草酸是合劑中主藥甘草的重要活性成分[1,2]。近年諸多相關(guān)研究多對(duì)甘草中甘草酸進(jìn)行了含量測(cè)定，而其他成分少見(jiàn)報(bào)道。為更好地確定本品質(zhì)量穩(wěn)定性，本實(shí)驗(yàn)依據(jù)相關(guān)資料[3,4]，采用高效液相色譜儀器聯(lián)用紫外檢測(cè)器通過(guò)變波長(zhǎng)法(HPLC-UV切換波長(zhǎng)法)對(duì)復(fù)方甘草合劑中甘草苷、異甘草苷、甘草素和甘草酸的含量進(jìn)行測(cè)定，并進(jìn)行相應(yīng)的方法學(xué)考察，以期為該合劑的質(zhì)量控制提供簡(jiǎn)易可靠的定量評(píng)價(jià)方法。

1材料

Waters高效液相色譜儀系統(tǒng)(Waters2695 Separations Module，Waters 2996 Photodiode Array Detector Madein Singapore，美國(guó)Waters);XS105型電子分析天平;Kp200DB型超聲波清洗器;SHE-D(III)循環(huán)水式真空泵。甘草苷對(duì)照品(批號(hào)：111610-201106)購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，甘草酸對(duì)照品(批號(hào)：1405-86-3)，異甘草苷對(duì)照品(批號(hào)：120526)和甘草素對(duì)照品(批號(hào)：100927)均購(gòu)自四川成都曼思特生物科技公司；復(fù)方甘草合劑購(gòu)自廣西廣明藥業(yè)(批號(hào)：130112、130113、130201)；甲醇(Fisher Scientific)，屈臣氏純凈水。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件色譜柱：Venusil XBP-C18(5 μm，4.6 mm×250 mm，博納艾杰爾)，流動(dòng)相為0.4%冰醋酸(A)-甲醇(B)，梯度洗脫A為50%→25%→25%→50%→50%，相應(yīng)時(shí)間周期為0→15→30→35→40 min，體積流量為1.0 mL/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為276 nm(0～12 min)、370 nm(12～23 min)、276 nm(23～40 min)，柱溫30 ℃，進(jìn)樣體積10 μL。

2.2樣品溶液的制備

2.2.1混合對(duì)照品溶液的制備精密稱(chēng)取甘草苷、異甘草苷、甘草素和甘草酸對(duì)照品適量置于10 mL容量瓶中，70%乙醇稀釋并定容，制成各對(duì)照品儲(chǔ)備液。甘草苷、異甘草苷、甘草素和甘草酸質(zhì)量濃度分別為221.00、223.00、171.00、742.00 μg/mL。精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液于量瓶中，70%乙醇稀釋并定容，制成混合對(duì)照品溶液，甘草苷、異甘草苷、甘草素和甘草酸質(zhì)量濃度分別為44.20、8.92、13.68、148.40 μg/mL。

2.2.2供試品溶液的制備精密量取復(fù)方甘草合劑1 mL，水浴蒸干，殘?jiān)?jīng)甲醇超聲處理，功率300 W，頻率40 kHz，30 min使其溶解，放冷，收集溶解液及洗液于2 mL容量瓶，加甲醇至刻度，搖勻并濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3陰性供試品溶液的制備制備復(fù)方甘草合劑缺甘草的陰性樣品，按“2.2.2”項(xiàng)供試品溶液的制備方法處理得缺甘草的陰性樣品溶液。

2.3專(zhuān)屬性將混合對(duì)照品、陰性供試品溶液及供試品溶液分別注入高效液相色譜儀，按照上述色譜條件進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示各待測(cè)成分對(duì)應(yīng)保留時(shí)間處無(wú)其他吸收峰，表明陰性無(wú)干擾。

2.4甘草苷、異甘草苷、甘草素和甘草酸的線(xiàn)性關(guān)系精密吸取混合對(duì)照品溶液1、5、10、20、30 μL注入液相色譜儀，按照上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，色譜峰峰面積為縱坐標(biāo)，計(jì)算回歸方程與相關(guān)系數(shù)并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，結(jié)果表明甘草苷、異甘草苷、甘草素和甘草酸在檢測(cè)范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好(r分別為0.999 2、0.999 1、0.999 2、0.999 6)，線(xiàn)性范圍分別為44.20～1 326、8.92～267.6、13.68～410.4、148.40～4 452 ng。

2.5復(fù)方甘草合劑穩(wěn)定性試驗(yàn)精密吸取新制備的同一供試品溶液(批號(hào)：130112)，于0、2、4、6、8、10、12 h進(jìn)樣10 μL進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果顯示，甘草苷、異甘草苷、甘草素和甘草酸含量分別為68.44、17.83、24.06和2 917.86 μg/mL，RSD分別為1.68%、0.87%、2.89%和2.98%。

2.6復(fù)方甘草合劑中間精密度試驗(yàn)取復(fù)方甘草合劑(批號(hào)：130112)6份，分別由兩人在不同的時(shí)間按照“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液方法進(jìn)行制備，注入高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示甘草苷、異甘草苷、甘草素和甘草酸平均含量分別為68.14、16.28、24.18和2 902.40 μg/mL，RSD值分別為2.50%、0.72%、2.81%和2.65%。結(jié)果表明精密度良好，符合定量分析要求。

2.7復(fù)方甘草合劑重復(fù)性試驗(yàn)取復(fù)方甘草合劑(批號(hào)：130112)5份，分別由兩人在不同的時(shí)間按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液并進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示甘草苷、異甘草苷、甘草素和甘草酸平均含量分別為67.32、17.46、23.76和2 946.24 μg/mL，RSD值分別為1.84%、2.21%、2.82%、2.85%和2.53%。結(jié)果表明精密度良好，符合定量分析要求。

2.8復(fù)方甘草合劑耐用性考察對(duì)液相測(cè)定中一些變動(dòng)因素進(jìn)行考察。

2.8.1不同體積流量精密吸取供試品和混合對(duì)照品溶液入液相色譜儀進(jìn)行含量測(cè)定，體積流量分別設(shè)定為0.8、1.0、1.2 mL/min，測(cè)得甘草苷、異甘草苷、甘草素和甘草酸平均含量分別為70.42、16.66、23.92和300.24 μg/mL，RSD值分別為1.58%、1.12%、2.16%和1.97%。

2.8.2不同色譜柱精密吸取供試品和混合對(duì)照品溶液，分別使用3種不同型號(hào)的色譜柱(Agela，V9520525ck0063；Sepax,02040917032；Waters,WAT045905)進(jìn)行檢測(cè)，其他按上述條件進(jìn)行測(cè)定，甘草苷、異甘草苷、甘草素和甘草酸RSD值分別為1.37%、2.91%、1.36%、2.11%。

2.9復(fù)方甘草合劑加樣回收率檢測(cè)取已測(cè)得含量的復(fù)方甘草合劑樣品(批號(hào)：130112)0.5 mL共3份，按照0.5 mL樣品成分含量的80%、100%、120%分別精密加入各對(duì)照品儲(chǔ)備液，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液并進(jìn)行含量測(cè)定，計(jì)算回收率。甘草苷、異甘草苷、甘草素和甘草酸的平均回收率分別為98.63%、99.13%、98.65%、99.10%，RSD值分別為1.12%、1.04%、1.06%、0.90%。

2.10復(fù)方甘草合劑中甘草苷、異甘草苷、甘草素、甘草酸含量測(cè)定取3批復(fù)方甘草合劑(批號(hào)：130112、130113、130201)，每批各3份，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，注入高效液相色譜儀進(jìn)行含量測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1　不同批號(hào)復(fù)方甘草合劑中甘草苷、異甘草苷、甘草素、甘草酸含量及RSD

3討論

復(fù)方甘草合劑由甘草流浸膏、復(fù)方樟腦酊、愈創(chuàng)木酚甘油醚及甘油等藥物組成。樟腦酊則是中樞性鎮(zhèn)咳藥，輔料甘油有助于將藥物附于咽喉部并起到滋潤(rùn)作用，尤其適用于痰多的咳嗽患者[5～9]。臨床研究[10,11]表明，服用復(fù)方甘草合劑可使患者咯痰咳嗽等癥狀和胸部體征得到明顯改善，理化檢查趨于正常。復(fù)方甘草合劑推廣多年，是經(jīng)諸多臨床驗(yàn)證的鎮(zhèn)咳藥。主藥甘草性甘、平，歸心、肺、脾、胃經(jīng)，可調(diào)和諸藥，益氣補(bǔ)脾，祛痰止咳，清熱解毒。甘草根表皮以?xún)?nèi)部位含有的大量甘草苷、異甘草苷、甘草素和甘草酸等黃酮類(lèi)物質(zhì)是其重要的活性物質(zhì)，具有顯著的末梢鎮(zhèn)咳作用，對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量控制對(duì)保持復(fù)方甘草合劑臨床療效的穩(wěn)定性有非常重要的作用[12～14]。

在原標(biāo)準(zhǔn)中藥品中沒(méi)有甘草流浸膏的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，關(guān)于本品的相關(guān)研究中多對(duì)單一一種物質(zhì)進(jìn)行質(zhì)量控制，沒(méi)有同時(shí)對(duì)這四種成分進(jìn)行含量測(cè)定。本實(shí)驗(yàn)參考相關(guān)資料，采用高效液相色譜儀器聯(lián)用紫外檢測(cè)器通過(guò)變波長(zhǎng)法對(duì)這4種成分進(jìn)行含量測(cè)定，并進(jìn)行相應(yīng)的方法學(xué)考察，以期為該合劑的質(zhì)量控制提供簡(jiǎn)易可靠的定量評(píng)價(jià)方法。甘草流浸膏中4種成分性質(zhì)相似，但含量卻有較大差異。經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，甘草素、甘草酸與甘草苷在270 nm范圍處有最大吸收，而異甘草苷在360 nm處有較大吸收，吸收波長(zhǎng)有較大差異，因此采用變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，依據(jù)藥物保留時(shí)間變化檢測(cè)波長(zhǎng)，能更準(zhǔn)確地對(duì)4種物質(zhì)的含量進(jìn)行檢測(cè)。中藥成分多且復(fù)雜，等梯度洗脫未能獲得較好的分離效果，待測(cè)物質(zhì)吸收峰易受干擾，因此選用了梯度洗脫。本研究在流動(dòng)相選擇的過(guò)程中對(duì)甲醇-冰醋酸緩沖液、甲醇-水、乙腈-磷酸鹽緩沖液等流動(dòng)相的洗脫進(jìn)行比較，結(jié)果顯示流動(dòng)相選用甲醇-0.4%冰醋酸時(shí)峰形良好且分離效果最佳。在進(jìn)行系統(tǒng)流速考察時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)流速為0.8 mL/min時(shí)色譜峰偶見(jiàn)拖尾且洗脫時(shí)間延長(zhǎng)，當(dāng)流速為1.2 mL/min時(shí)系統(tǒng)壓力稍升高且待測(cè)物質(zhì)色譜峰與雜質(zhì)峰分離度較低，流速為1.0 mL/min時(shí)峰形良好且洗脫時(shí)間適當(dāng)，因此在含量測(cè)定中選用流速為1.0 mL/min。另外，復(fù)方甘草合劑屬于中藥制劑，不同制備工藝、不同批號(hào)、不同儲(chǔ)存環(huán)境等因素均會(huì)對(duì)其有效成分產(chǎn)生一定的影響，導(dǎo)致含量測(cè)定結(jié)果不一樣。

本實(shí)驗(yàn)采用HPLC-UV切換波長(zhǎng)法同時(shí)測(cè)定了復(fù)方甘草合劑中甘草苷、異甘草苷、甘草素和甘草酸的含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明此方法靈敏簡(jiǎn)便、重現(xiàn)性好，且有較高的準(zhǔn)確性，可為甘草合劑質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供參考依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1] Wang G, Niu X, Shi G, et al. Functionalized graphene quantum dots loaded with free radicals combined with liquid chromatography and tandem mass spectrometry to screen radical-scavenging natural antioxidants from Licorice and Scutellariae[J]. J Sep Sci, 2014,5(8):67-69.

[2] Xu T, Yang M, Li Y, et al. An integrated exact mass spectrometric strategy for comprehensive and rapid characterization of phenolic compounds in licorice[J]. Rapid Commun Mass Spectrom, 2013,27(21):2297-2309.

[3] Fujii S, Morinaga O, Uto T, et al. Development of a monoclonal antibody-based immunochemical assay for liquiritin and its application to the quality control of licorice products[J]. J Agric Food Chem, 2014,62(15):3377-3383.

[4] Mekhralieva SD. Working out of technology and rationing quality of "Glysocal" granules[J]. Georgian Med News, 2011,8(191):68-72.

[5] Ajagannanavar SL, Battur H. Effect of aqueous and alcoholic licorice (glycyrrhiza glabra) root extract against streptococcus mutans and lactobacillus acidophilus in comparison to chlorhexidine: an in vitro study[J]. J Int Oral Health, 2014,6(4):29-34.

[6] Makino ET, Mehta RC, Banga A, et al. Evaluation of a hydroquinone-free skin brightening product using in vitro inhibition of melanogenesis and clinical reduction of ultraviolet-induced hyperpigmentation[J]. J Drugs Dermatol, 2013,12(3):16-20.

[7] Wang M, Zhang M, Tang Q, et al. Influence of honey-roasting on the main pharmacological activities and the water-soluble active glycosides of licorice[J]. Afr J Tradit Complement Altern Med, 2011,9(2):189-196.

[8] Zhang J, Gao W, Yan S, et al. Effects of space flight on the chemical constituents and anti-inflammatory activity of licorice (glycyrrhiza uralensis fisch)[J]. Iran J Pharm Res, 2012,11(2):601-609.

[9] Kim HJ, Seo JY, Suh HJ, et al. Antioxidant activities of licorice-derived prenylflavonoids[J]. Nutr Res Pract, 2012,6(6):491-498.

[10] Jayaprakasam B, Doddaga S, Wang R, et al. Licorice flavonoids inhibit eotaxin-1 secretion by human fetal lung fibroblasts in vitro[J]. J Agric Food Chem, 2009,57(3):820-825.

[11] Ohno H, Miyoshi S, Araho D, et al. Efficient utilization of licorice root by alkaline extraction[J]. In Vivo, 2014,28(5):785-794.

[12] Leskinen MH, Hautaniemi EJ, Tahvanainen AM, et al. Daily liquorice consumption for two weeks increases augmentation index and central systolic and diastolic blood pressure[J]. PLoS One, 2014,9(8):e105607.

[13] Momeni A, Rahimian G, Kiasi A. Effect of licorice versus bismuth on eradication of Helicobacter pylori in patients with peptic ulcer disease[J]. Pharmacognosy Res, 2014,6(4):341-344.

[14] Al-Bachir M, Al-Adawi M. Comparative effect of irradiation and heating on the microbiological properties of licorice(Glycyrrhiza glabra L.) root powders[J]. Int J Radiat Biol, 2014,8(3):1-19.

(收稿日期：2015-08-28)

中圖分類(lèi)號(hào)：R917

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-266X(2016)11-0035-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.11.013

基金項(xiàng)目：河南省科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(132102310156)。