李麗 馬記磊 任易 謝紅 田丹 南晶 俞琦 田茂鵬 景玉凱 范雄林 王衛(wèi)華

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·論著·

初治涂陽肺結(jié)核患者治療前后結(jié)核分枝桿菌毒力變化的探討

李麗 馬記磊 任易 謝紅 田丹 南晶 俞琦 田茂鵬 景玉凱 范雄林 王衛(wèi)華

目的 分析初治涂陽肺結(jié)核患者經(jīng)抗結(jié)核藥物治療前后結(jié)核分枝桿菌(MTB)的毒力變化情況。方法 收集2014—2015年入選“武漢市初治涂陽肺結(jié)核免費(fèi)隔離治療項(xiàng)目”的患者中初治涂陽肺結(jié)核且經(jīng)抗結(jié)核治療2周后痰涂片仍未轉(zhuǎn)陰者(未轉(zhuǎn)陰組)治療前、治療1周后及治療2周后分離的MTB(15株)；初治涂陽肺結(jié)核經(jīng)抗結(jié)核藥物治療后2周內(nèi)痰涂片轉(zhuǎn)陰患者(轉(zhuǎn)陰組)治療前分離的MTB(4株)；耐多藥結(jié)核病患者(對照組)治療前分離的MTB(1株)。將上述不同類別患者不同時間點(diǎn)痰培養(yǎng)分離的MTB菌株于體外分別感染巨噬細(xì)胞3 h和96 h后，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測巨噬細(xì)胞早期凋亡水平，同時計(jì)數(shù)菌落數(shù)量，分析其變化情況。結(jié)果 未轉(zhuǎn)陰組治療前、治療1周后、治療2周后分離的MTB菌株感染巨噬細(xì)胞3 h后，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞早期凋亡率分別為(2.95±1.13) %、(4.21±1.92) %、(3.73±1.36) %，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=3.38，P=0.086)；感染巨噬細(xì)胞96 h后，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞早期凋亡率分別為(4.25±0.48) %、(5.69±2.03) %、(5.06±1.25) %，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.69，P=0.245)。未轉(zhuǎn)陰組、轉(zhuǎn)陰組及對照組患者治療前痰培養(yǎng)分離的MTB菌株感染巨噬細(xì)胞3 h后誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞早期凋亡率分別為(2.95±1.13) %、(4.05±1.87) %、(4.38±0.29) %，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.94，P=0.380)；感染巨噬細(xì)胞96 h后，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞早期凋亡率分別為(4.25±0.48) %、(4.11±0.26) %、(5.39±0.24) %，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=11.97，P=0.003)。各組不同治療時間所分離的MTB菌株感染巨噬細(xì)胞后菌落數(shù)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 初治涂陽肺結(jié)核經(jīng)抗結(jié)核治療后2周痰涂片仍未轉(zhuǎn)陰患者所攜帶的MTB菌株毒力在治療前后沒有變化。

結(jié)核, 肺； 分枝桿菌，結(jié)核； 毒力； 評價研究

結(jié)核病是三大傳染性疾病之一，結(jié)核分枝桿菌(MTB)是導(dǎo)致結(jié)核病的病原菌。宿主巨噬細(xì)胞凋亡可殺死寄生于其內(nèi)的MTB，阻止其在體內(nèi)播散，同時可有助于激活適應(yīng)性免疫應(yīng)答，因此，被認(rèn)為有助于機(jī)體控制MTB的繁殖和播散[1]。低毒力MTB感染人體時，可促發(fā)免疫保護(hù)機(jī)制，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的凋亡；而高毒力MTB則引起巨噬細(xì)胞的壞死?？梢?，不同毒力MTB菌株對宿主轉(zhuǎn)歸的影響完全不同[2]?；诖耍P者收集初治涂陽且經(jīng)抗結(jié)核藥物治療2周后痰菌未轉(zhuǎn)陰的肺結(jié)核患者治療前后不同時間點(diǎn)的MTB臨床分離株，抗結(jié)核藥物治療2周內(nèi)轉(zhuǎn)陰患者及耐多藥結(jié)核病患者治療前的MTB臨床分離株，比較各類菌株感染巨噬細(xì)胞后誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞早期凋亡的水平及計(jì)數(shù)MTB菌株數(shù)量，研究MTB菌株的毒力是否有改變。

材料和方法

1.對象：選取2014—2015年入選“武漢市初治涂陽肺結(jié)核免費(fèi)隔離治療項(xiàng)目”的患者作為研究對象。根據(jù)抗結(jié)核藥物治療2周后痰涂片鏡檢結(jié)果將患者分為兩類：抗結(jié)核藥物治療后2周痰涂片鏡檢仍未轉(zhuǎn)陰、且培養(yǎng)陽性的患者作為未轉(zhuǎn)陰組，共5例；抗結(jié)核藥物治療2周內(nèi)痰涂片鏡檢轉(zhuǎn)陰患者作為轉(zhuǎn)陰組，共4例。收集未轉(zhuǎn)陰組患者治療前、治療后1周及治療2周后痰培養(yǎng)分離的MTB菌株共15株；收集轉(zhuǎn)陰組患者治療前痰培養(yǎng)分離的MTB菌株共4株。篩選同時耐異煙肼和利福平的耐多藥結(jié)核病患者治療前痰培養(yǎng)分離的1株MTB作為對照。

2.儀器與試劑：Sigma 3K15離心機(jī)(購自德國Sigma公司)、BD Calibur流式細(xì)胞儀(購自美國BD公司)、Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(購自南京凱基生物科技有限公司)、7H11瓊脂培養(yǎng)基(購自美國BD Pharmingen公司)、U937細(xì)胞(購自上海中國科學(xué)院細(xì)胞庫)、BSA-V牛血清白蛋白(購自安徽Biosharp公司)。

3.U937細(xì)胞培養(yǎng)：將1640+10%胎牛血清(FBS)培養(yǎng)基放入37 ℃水浴鍋內(nèi)復(fù)溫，打開紫外燈照射30 min；取生長48 h、狀態(tài)良好的U937細(xì)胞置于已經(jīng)準(zhǔn)備好的生物安全柜中，吸取細(xì)胞懸液，加入到無菌的15 ml離心管內(nèi)，500×g離心5 min；棄上清，加入4 ml 1640+10%FBS完全培養(yǎng)基，吹打數(shù)次，使細(xì)胞均勻分散。按照1∶4的比例傳代，取1 ml 細(xì)胞懸液和4 ml 1640+10%FBS完全培養(yǎng)基，加入到新的培養(yǎng)瓶中，輕輕晃動培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞均勻分布；做好標(biāo)記，把培養(yǎng)瓶置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

4.細(xì)菌培養(yǎng)：打開生物安全柜內(nèi)紫外燈照射30 min，取-40 ℃保存的MTB菌種各100 μl，加入至新鮮配制的7H11平板中，輕輕搖晃平板使菌液均勻分布，做好相應(yīng)標(biāo)記，用封口膠封口，放置37 ℃溫箱中培養(yǎng)3周左右。7H11培養(yǎng)基制備采用7H11 Broth(肉湯)21 g，甘油5 ml加雙蒸水溶解，定容至900 ml，121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min，待溫度降至55 ℃，將牛血清白蛋白-葡萄糖-過氧化氫酶(ADC)和7H11瓊脂溶液按照1∶9比例配置混勻，分裝至無菌的培養(yǎng)皿，凝固后分裝備用。

5.細(xì)菌懸液制備：打開生物安全柜內(nèi)紫外燈照射30 min，挑取7H11平板上生長的菌落，置于無菌已稱量過的Eppendorf(EP)管中，稱量EP管中不同細(xì)菌的重量，按照干重1 mg細(xì)菌所含的細(xì)菌個數(shù)為1×107計(jì)算細(xì)菌總數(shù)，把EP管中的細(xì)菌轉(zhuǎn)移至勻漿器，加入一定量的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)，研磨細(xì)菌，使細(xì)菌均勻分散。

6.細(xì)菌感染細(xì)胞：按照細(xì)菌感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)值為10感染U937細(xì)胞，4 h 后吸取細(xì)胞懸液加入到15 ml離心管中，500×g離心5 min，加入5 ml PBS重懸細(xì)胞，反復(fù)離心洗滌5次，充分去除細(xì)胞外未感染細(xì)胞的細(xì)菌，加入2 ml的新鮮完全培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

7.巨噬細(xì)胞荷菌量分析：細(xì)菌分別感染巨噬細(xì)胞3 h和96 h，收集細(xì)胞：500×g離心5 min，收集U937細(xì)胞，PBS緩沖液重懸細(xì)胞，洗滌3次，用1 ml PBS 重懸細(xì)胞；其中500 μl 用于菌落計(jì)數(shù)，剩余500 μl 用于流式分析細(xì)胞凋亡和死亡。吸取100～900 μl無菌1×PBS緩沖液，并依此進(jìn)行倍比稀釋至10-4梯度；從各個梯度稀釋液中吸取100 μl液體加至制備好的7H11瓊脂培養(yǎng)基三格平板的每個格子中，并做好標(biāo)記；將涂布完成的平板置于37 ℃培養(yǎng)箱中，待液體吸收完全后倒置培養(yǎng)3周。3周后記錄每個平板上菌落數(shù)量。根據(jù)稀釋度換算得到每個孔中所包含的菌落總數(shù)。每孔巨噬細(xì)胞荷菌量以log10菌落形成單位(CFU)表示。

8.巨噬細(xì)胞凋亡和壞死檢測：收集未轉(zhuǎn)陰組患者治療前、治療后1周及治療后2周痰培養(yǎng)分離的MTB，按照細(xì)菌MOI值為10感染U937細(xì)胞3 h和96 h，利用凋亡檢測試劑盒進(jìn)行染色，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡水平并利用FlowJo軟件進(jìn)行分析。500×g離心5 min，收集5×105個上述經(jīng)PBS洗滌的巨噬細(xì)胞；每管加入500 μl的結(jié)合緩沖液(binding buffer)重懸細(xì)胞；加入5 μl膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(annexin V-FITC)，充分混勻，加入5 μl 碘化丙碇(propidium iodide，PI)，混勻；室溫、避光、放置5～15 min，annexin V-FITC/PI染色，1 h內(nèi)應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況，應(yīng)用Cellquest軟件獲取數(shù)據(jù)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)原理，annexin V單陽性為早期凋亡細(xì)胞，annexin V和PI雙陽性者為晚期凋亡及壞死細(xì)胞，雙陰性者為活細(xì)胞。

9. 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行分析，未轉(zhuǎn)陰組患者不同治療時間分離MTB感染巨噬細(xì)胞后細(xì)胞早期凋亡率的組間比較采用配對t檢驗(yàn)，以P<0.025為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。不同組別患者治療前分離MTB菌株感染巨噬細(xì)胞后細(xì)胞早期凋亡率的比較采用方差分析。菌落計(jì)數(shù)的比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.MTB誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡水平：未轉(zhuǎn)陰組治療前痰培養(yǎng)分離MTB感染3 h后，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞早期凋亡率為(2.95±1.13) %，治療1周后痰培養(yǎng)分離MTB誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞早期凋亡率為(4.21±1.92) %，治療2周后痰培養(yǎng)分離MTB誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞早期凋亡率為(3.73±1.36) %。治療前、治療1周后、治療2周后分離菌株誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。未轉(zhuǎn)陰組治療前痰培養(yǎng)分離MTB感染96 h后，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞早期凋亡率為(4.25±0.48) %，治療1周后誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞早期凋亡率為(5.69±2.03) %，治療2周后誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞早期凋亡率為(5.06±1.25) %。治療前、治療1周后、治療2周后分離菌株誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。治療前、治療1周后、治療2周后分離菌株，分別感染巨噬細(xì)胞不同時間(3、96 h)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

比較未轉(zhuǎn)陰組、轉(zhuǎn)陰組及對照組患者治療前痰培養(yǎng)分離MTB感染巨噬細(xì)胞3 h和96 h后誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞早期凋亡水平。MTB感染巨噬細(xì)胞3 h后，未轉(zhuǎn)陰組、轉(zhuǎn)陰組、對照組分離MTB誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞早期凋亡水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。感染巨噬細(xì)胞96 h后，未轉(zhuǎn)陰組、轉(zhuǎn)陰組、對照組分離MTB誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞早期凋亡水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但未轉(zhuǎn)陰組與轉(zhuǎn)陰組相比誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞早期凋亡水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。

2.MTB感染巨噬細(xì)胞后菌落數(shù)量變化情況：MTB感染巨噬細(xì)胞3 h和96 h后，去除細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)MTB 3周后，記錄每個平板上菌落數(shù)量。根據(jù)稀釋度換算得到每個孔中每毫升菌液所包含的菌落總數(shù)[lg(CFU)]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，未轉(zhuǎn)陰組患者治療前分離MTB初始感染巨噬細(xì)胞菌量為7.01±0.37、感染3 h后菌量為5.75±0.30、感染96 h后菌量為6.75±0.34；治療1周后初始感染菌量為7.10±0.29、感染3 h后菌量為5.81±0.50、感染96 h后菌量為6.82±0.43；治療2周后初始感染菌量為7.02±0.31、感染3 h后菌量為5.70±0.34、感染96 h后菌量為6.70±0.34。對未轉(zhuǎn)陰組治療前、治療后1周及治療后2周菌量進(jìn)行Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，結(jié)果顯示感染不同時間點(diǎn)，治療前、治療后1周、治療后2周組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(K-W值=0.62，P=0.733)。

表1 未轉(zhuǎn)陰組患者不同治療時間MTB分離株感染巨噬細(xì)胞后細(xì)胞早期凋亡率的比較

表2 不同組別患者治療前MTB分離株感染

比較未轉(zhuǎn)陰組、轉(zhuǎn)陰組及對照組患者實(shí)際感染巨噬細(xì)胞的細(xì)菌數(shù)量、感染3 h和96 h菌落數(shù)量變化情況，結(jié)果表明，未轉(zhuǎn)陰組治療前初始感染菌量為7.01±0.37、感染3 h后菌量為5.75±0.30、感染96 h后菌量為6.75±0.34；轉(zhuǎn)陰組治療前初始感染菌量為7.11±0.36、感染3 h后菌量為5.81±0.24、感染96 h后菌量為6.98±0.17；對照組治療前初始感染菌量為6.97±0.03、感染3 h后菌量為5.46±0.05、感染96 h后菌量為6.75±0.18；Kruskal-Wallis檢驗(yàn)結(jié)果顯示，抗結(jié)核治療2周未轉(zhuǎn)陰者、抗結(jié)核治療2周內(nèi)轉(zhuǎn)陰者及耐多藥結(jié)核病患者組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(K-W值=1.28，P=0.528)。

討 論

MTB是典型的胞內(nèi)致病菌，主要在巨噬細(xì)胞等宿主免疫系統(tǒng)細(xì)胞內(nèi)存活和繁殖。MTB感染人體后，主要被宿主巨噬細(xì)胞吞噬，未被機(jī)體免疫系統(tǒng)清除而潛伏下來的MTB也主要寄生于宿主巨噬細(xì)胞內(nèi)。MTB感染的后果及結(jié)核病的發(fā)生與否與宿主巨噬細(xì)胞密切相關(guān)。MTB感染后，可誘導(dǎo)宿主巨噬細(xì)胞產(chǎn)生不同的轉(zhuǎn)歸——凋亡或壞死[3]。凋亡可使巨噬細(xì)胞靜止地將抗原提呈給T細(xì)胞，誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答，消除MTB賴以生存的環(huán)境，阻止其傳播；而壞死可使宿主巨噬細(xì)胞膜破裂，使宿于其中的MTB被釋放出來，重新感染周圍宿主巨噬細(xì)胞，造成感染的播散。由此可見，宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)歸對MTB感染的控制極其關(guān)鍵。研究表明，不同毒力的MTB感染巨噬細(xì)胞后可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生不同的轉(zhuǎn)歸：高毒力MTB株H37Rv能夠抑制細(xì)胞凋亡，在胞內(nèi)存活、繁殖、擴(kuò)散，導(dǎo)致細(xì)胞壞死，進(jìn)而引發(fā)炎癥反應(yīng)、細(xì)菌擴(kuò)散；而H37Ra、卡介苗(BCG)等減毒株則能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生大量凋亡[4]。

不同于利用小鼠模型進(jìn)行的MTB毒力檢測實(shí)驗(yàn)[5]，結(jié)果表明，對于入組的5例初治涂陽肺結(jié)核患者，相比抗結(jié)核治療前，抗結(jié)核治療1周或2周后分離的結(jié)核分枝桿菌誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞早期凋亡水平均有不同程度的上升，但不同患者結(jié)果間表現(xiàn)出異質(zhì)性。MTB感染巨噬細(xì)胞3 h后，5例中有4例患者抗結(jié)核治療1周及2周后巨噬細(xì)胞凋亡水平較治療前均有不同程度上升。未轉(zhuǎn)陰組患者，在抗結(jié)核治療1周或2周后分離的MTB較治療前誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡水平均有上升，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。究其原因，可能由于本研究納入患者數(shù)量及MTB臨床分離株較少，有必要增加樣本量做進(jìn)一步研究。此外，由于筆者僅收集了抗結(jié)核藥物治療1周或2周后的MTB，若繼續(xù)收集抗結(jié)核藥物治療后更長時間的菌株，可能會發(fā)現(xiàn)其誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞早期凋亡水平的明顯變化，即隨著抗結(jié)核藥物治療的延續(xù)，細(xì)菌的毒力會呈現(xiàn)明顯下降，這對結(jié)核病患者的臨床治療及結(jié)核病傳染源的管理具有重要提示意義。

此外，筆者針對初治涂陽結(jié)核病患者抗結(jié)核藥物治療2周后痰涂片未轉(zhuǎn)陰患者、轉(zhuǎn)陰患者及耐多藥結(jié)核病患者化療前收集的MTB誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡水平進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，未轉(zhuǎn)陰患者、轉(zhuǎn)陰患者及耐多藥患者的MTB臨床分離株感染巨噬細(xì)胞3 h后，其誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的早期凋亡的水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而感染巨噬細(xì)胞96 h后，三組菌株誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞早期凋亡水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，耐多藥組菌株誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞早期凋亡水平高于未轉(zhuǎn)陰組和轉(zhuǎn)陰組，而轉(zhuǎn)陰組與未轉(zhuǎn)陰組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

本研究首次利用體外細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)初步探討了抗結(jié)核藥物治療后不同時間點(diǎn)MTB毒力的變化，發(fā)現(xiàn)隨著抗結(jié)核藥物治療的進(jìn)行，細(xì)菌毒力未見明顯變化。究其原因，可能由于納入患者例數(shù)較少，同時，若延長抗結(jié)核藥物治療后收集各時間點(diǎn)的MTB臨床分離株，可能會出現(xiàn)細(xì)菌毒力的明顯改變。由此也提示，在臨床上，肺結(jié)核患者或許需要更長時間的住院或隔離治療才能有效地避免細(xì)菌在人群中的傳播。很多研究報(bào)道MTB成分能有效抑制或促進(jìn)巨噬細(xì)胞凋亡[6-9]，也有關(guān)于細(xì)菌毒力變化的相關(guān)分子水平研究[10-12]。本研究并未涉及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的具體成分或機(jī)制，這也需要進(jìn)一步地進(jìn)行分子或基因水平研究，通過干預(yù)和調(diào)控宿主巨噬細(xì)胞的凋亡進(jìn)程，為結(jié)核病的預(yù)防、控制和根除提供新的靶點(diǎn)，同時也為結(jié)核病臨床治療策略或結(jié)核病傳染源管理提供理論依據(jù)。

[1] 陳思靜, 盧賢瑜. 結(jié)核分枝桿菌調(diào)控巨噬細(xì)胞凋亡機(jī)理的研究進(jìn)展. 國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志, 2005, 26(5):276-278．

[2] Sohn H, Lee KS, Kim SY, et al. Induction of cell death in human macrophages by a highly virulent Korean isolate ofMycobacteriumtuberculosisand the virulent strain H37Rv. Scand J Immunol, 2009, 69(1):43-50．

[3] Bocehino M, Galati D, Sanduzzi A, et al. Role of mycobacteria-induced monocyte/macrophage apoptosis in the pathogenesis of human tuberculosis. Int J Tuberc Lung Dis, 2005, 9(4): 375-383.

[4] Brightbill HD, Libraty DH, Krutzik SR, et al. Host defense mechanisms triggered by microbial lipoproteins through toll-like receptors. Science, 1999, 285(5428): 732-736.

[5] Smith KL, Saini D, Bardarov S, et al. Reduced virulence of an extensively drug-resistant outbreak strain ofMycobacteriumtuberculosisin a murine model. PLoS One, 2014, 9(4): e94953.

[6] Yuk JM, Shin DM, Yang CS, et al. Role of apoptosis-regulating signal kinase 1 in innate immune responses by Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guérin. Immunol Cell Biol, 2009, 87(1): 100-107.

[7] 史會連, 虞勝鐳, 路蟬伊, 等. 不同毒力結(jié)核桿菌的純化蛋白衍生物對人巨嗡細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)及其與Toll樣受體-2的相關(guān)性. 中華傳染病雜志, 201l, 29(1):6-10．

[8] 夏飛, 劉勝武, 魏雅雅, 等. 結(jié)核分枝桿菌誘導(dǎo)宿主巨噬細(xì)胞凋亡機(jī)制初探.中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志, 2005, 25(6): 463-468．

[9] Yokobori N, Sabio y García CA, Geffner L, et al. Differential induction of macrophage cell death by antigens of a clustered and a non-clustered multidrug-resistantMycobacteriumtuberculosisstrain from Haarlem family. FEMS Immunol Med Microbiol, 2012, 66(3): 363-371.

[10] 薛玉, 劉毅, 張旭霞, 等. 分枝桿菌中原核類泛素蛋白化靶蛋白的功能分析. 中國防癆雜志, 2014, 36(6):509-513.

[11] 張國良, 詹森林, 鐘紅劍, 等. 結(jié)核分枝桿菌感染對Ⅰ型干擾素受體基因表達(dá)的影響及其在結(jié)核病患者外周血表達(dá)的意義. 中國防癆雜志, 2014, 36(6): 482-486.

[12] 馬峻, 陳高瞻, 董潔莉, 等. 武漢地區(qū)耐異煙肼結(jié)核分枝桿菌臨床分離株katG基因突變的分子特征分析. 中國防癆雜志, 2015, 37(1): 95-97.

(本文編輯：李敬文)

Analysis ofMycobacteriumtuberculosisvirulence before and after anti-tuberculosis treatment for smear positive pulmonary tuberculosis patients

LILi,MAJi-lei,RENYi,XIEHong,TIANDan,NANJing,YUQi,TIANMao-peng,JINGYu-kai,FANXiong-lin,WANGWei-hua.

WuhanInstituteforTuberculosisControl,WuhanPulmonaryHospital,Wuhan430030,China

s:WANGWei-hua,Email:drwang65@163.com;FANXiong-lin,Email:xlfan@hust.edu.cn

Objective Evaluation of virulence ofMycobacteriumtuberculosis(MTB) isolated before and after treatment for newly diagnosed smear positive pulmonary tuberculosis (TB) patients. Methods Patients were recruited from Project of Free Quarantined Hospital Treatment for Newly Diagnosed Smear Positive Pulmonary TB Patients in Wuhan during 2014-2015. Fifteen strains of MTB isolated from patients before the initiation of anti-TB treatment, after one week or two weeks of anti-TB treatment from smear positive pulmonary TB patients who are still sputum smear positive after 2 weeks of anti-TB treatment, four MTB strains from pulmonary TB patients who are sputum smear negative during 2 weeks of anti-TB treatment and one multidrug-resistant MTB strain before the initiation of anti-TB treatment. Macrophages were infected with the different MTB strains cultured from different time points of sputum isolated from the different types of patients mentioned above in vitro for 3 hours or 96 hours. Flow cytometry was conducted to detect the early apoptotic level of macrophages. At the same time, the number of MTB colonies was counted. Results The percentage of early apoptosis of macrophages infected with cultured MTB from sputum isolated before, after one week or two weeks of anti-TB treatment from smear positive pulmonary TB patients who were still sputum smear positive after 2 weeks of anti-TB treatment were (2.95±1.13) %,(4.21±1.92) % and (3.73±1.36) % repectively, after infection for 3 h，displaying no significant difference (F=3.38,P=0.086); (4.25±0.48) %, (5.69±2.03) %, (5.06±1.25) % after infection for 96 h, displaying no significant difference (F=1.69，P=0.245). The percentage of early apoptosis of macrophages infected with cultured MTB from sputum isolated before treatment from smear positive pulmonary TB patients who were still sputum smear positive after treatment were (2.95±1.13) %,(4.05±1.87) % for who were negative after treatment and (4.38±0.29) % for MDR MTB after infection for 3 h, displaying no significant difference (F=1.94，P=0.380). The percentage were (4.25±0.48) %, (4.11±0.26) % and (5.39±0.24) % after infection for 96 h respectively, displaying no significant difference (F=11.97,P=0.003). No significant difference was observed as to the count of MTB colonies. Conclusion The virulence of MTB isolated is not significantly changed from MTB patients who are still sputum smear positive after 2 weeks of anti-TB treatment.

Tuberculosis, pulmonary;Mycobacteriumtuberculosis; Virulence; Evaluation studies

10.3969/j.issn.1000-6621.2016.11.016

武漢市初治涂陽肺結(jié)核免費(fèi)隔離治療項(xiàng)目(2012年7月)；武漢市中青年醫(yī)學(xué)骨干人才培養(yǎng)工程(武衛(wèi)生計(jì)生通〔2015〕9號)；武漢市黃鶴英才(醫(yī)療衛(wèi)生)計(jì)劃(武人才辦〔2016〕1號)

430030 武漢市結(jié)核病防治所 武漢市肺科醫(yī)院(李麗、任易、謝紅、田丹、南晶、王衛(wèi)華)；華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室(馬記磊、俞琦、田茂鵬、景玉凱、范雄林)

王衛(wèi)華，Email：drwang65@163.com；范雄林，Email：xlfan@hust.edu.cn

2016-07-01)

注：李麗、馬記磊對本文有同等貢獻(xiàn)，為并列第一作者