馬英麗，趙樺，楊秋琛，陳曉玲（陜西理工學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西漢中723000）

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蜜楝不同部位綠原酸積累變化分析研究

馬英麗，趙樺*，楊秋琛，陳曉玲
（陜西理工學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西漢中723000）

摘要：利用高效液相色譜法分析測定了不同生長時期蜜楝葉、花和果實中綠原酸的含量。色譜條件為：色譜柱為Inertsil ODS-3C18（4.6×150mm，5μm）柱，以乙腈-0.2%磷酸溶液（8∶92）為流動相，流速1.0 mL/min，檢測波長327 nm，柱溫30℃。綠原酸在30.4 μg/mL～152 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，Y=27.335X-7.67（R2=0.999 8），平均加樣回收率100.77 %，RSD為1.58 %（n=6）。分析結(jié)果表明，在蜜楝植物不同部位中綠原酸的含量不同，其中葉含量在4.69 mg/g～8.90 mg/g之間，花中含量在14.59 mg/g～27.30 mg/g之間，果實中含量在8.79 mg/g～16.70 mg/g之間，在同一部位綠原酸的積累隨生長時間的不同而表現(xiàn)出一定的變化。研究結(jié)果表明，蜜楝的花及果實可作為提取制備綠原酸成分的一種資源，具有一定開發(fā)利用價值。

關(guān)鍵詞：蜜楝；綠原酸；積累變化；含量分析

蜜楝Evodia lenticellata Huang為蕓香科（Rutaceae）吳茱萸屬（Evodia Forst.）植物，主要分布于我國陜西南部和四川等地[1-3]。該植物近成熟果實在民間可入藥，功效同吳茱萸果實。目前，關(guān)于蜜楝果實中藥用成分的研究尚不多見，本實驗室曾對其果實中脂溶性成分和多糖成分及其生物學(xué)活性進(jìn)行了研究報道[4-6]，本文采用HPLC法，對蜜楝不同生長階段的葉片、花和果實中綠原酸成分進(jìn)行分析研究，以期為蜜楝資源的開發(fā)利用提供參考。

綠原酸（chlorogenic acid）又名3-咖啡?？鼘幩幔窃S多中草藥如金銀花、杜仲、茵陳等的重要有效成分之一，具有抗菌、抗病毒、升高白細(xì)胞、保肝利膽、抗腫瘤、降血壓、降血脂、清除自由基和興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)等作用等多種藥理活性[7-9]。此外，綠原酸還具有很好的清除自由基抗氧化作用，可抑制氧自由基對機(jī)體的損傷。綠原酸作為一種新型高效的酚型天然抗氧化劑，近年來受到人們廣泛的關(guān)注，研究工作者先后對多種植物中所含綠原酸進(jìn)行了分析研究[8-14]。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

綠原酸對照品：購自由上海同田生物技術(shù)股份有限公司（批號：14031321）；蜜楝果實藥材：采自陜西省漢中市漢臺區(qū)雷家巷；乙腈、甲醇均為色譜純；磷酸為分析純；水為自制超純水。

1.2儀器與設(shè)備

Agilente 1260高效液相色譜儀（包括四元泵，真空脫氣機(jī)，柱溫箱，二級管陣列檢測器），Empower色譜工作站：美國惠普公司；UV-2550紫外分光光度計：日本島津；AB204-S電子分析天平：瑞士Mettler Toledo公司；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗機(jī)：昆山市超聲儀器有限公司；IKARV 10D型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：德國IKA公司；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；101-2型電熱鼓風(fēng)干燥箱：北京科偉永興有限公司；FW-177型中藥粉碎機(jī)、DK98-11A型數(shù)顯恒溫水浴鍋：天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3色譜條件

Agilente 1260高效液相色譜儀；Inertsil ODS-3C18（4.6×150 mm，5 μm）柱；二級管陣列檢測器。流動相：乙腈-0.4 %磷酸水溶液（8：92），流速1 mL/min，檢測波長327 nm，柱溫30℃，進(jìn)樣量10 μL。

1.4檢測波長的選擇

利用適當(dāng)濃度的綠原酸對照品溶液，以超純水做空白，在200 nm～400 nm范圍內(nèi)掃描，在327 nm處有最大吸收。因此，選擇327 nm作為檢測波長。

1.5樣品溶液的制備

取蜜楝藥材，在55℃條件下烘干，粉碎過65目篩。稱取約1 g，精密稱定，置于具塞100 mL錐形瓶中，加40 mL 50 %的甲醇溶液，準(zhǔn)確稱重。在超聲功率為240 W、超聲頻率為40 kHz，溫度為60℃條件下，超聲輔助提取30min，取出，放冷，稱重，用50 %的甲醇溶液補(bǔ)齊重量，進(jìn)樣前用0.45 μm的濾膜過濾。

1.6對照品溶液的制備

精密稱取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品15.2 mg，用50 %甲醇溶液定容至100 mL的棕色容量瓶中，得152 μg/mL綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液，以備用。

2　結(jié)果與分析

2.1線性關(guān)系考察

準(zhǔn)確量取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品母液2、4、6、8 mL，分別用50 %的甲醇溶液定容至10 mL的棕色容量瓶中，配制成濃度分別為30.4、60.8、91.2、121.6 μg/mL的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液，加上綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品母液共5種不同濃度的溶液分別進(jìn)樣，每個濃度分別進(jìn)樣3次，每次10 μL，進(jìn)樣前用0.45 μm的濾膜過濾，測定峰面積，以綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得綠原酸的回歸方程為Y=27.335X-7.67（R2= 0.999 8），在30.4 μg/mL～152 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。綠原酸工作曲線圖見圖1，其色譜圖見圖2。

圖1　綠原酸工作曲線圖Fig.1 The standard curve for chlorogenic acid

圖2　綠原酸對照品色譜圖Fig.2 Chromatogram of standard sample

2.2精密度試驗

用綠原酸對照品溶液重復(fù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣10μL，綠原酸峰面積分別為：1 680.5、1 688.8、1 689.5、1 684.8、1 692.9、1 671.8，RSD為0.45 %。

2.3重復(fù)性試驗

精密稱取同一蜜楝樣品5份，每份約1 g，均精密稱定。按1.5項方法制備供試液，按1.3項條件測定，每份進(jìn)樣3次，每次進(jìn)樣10 μL。5份樣品中綠原酸的峰面積分別為：3 415.4、3 441.13、3 382.9、3 242、3 481.2，RSD為2.68 %。說明本文方法有較好的重現(xiàn)性。

2.4穩(wěn)定性試驗

用某1份蜜楝樣品制備供試液，供試液分別于提取后0、1、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣。綠原酸的峰面積分別為：3 131.9、3 164.6、3 163.4、3 165、3 280.5、3 158.7、3 194.2，RSD為1.51 %。說明蜜楝樣品供試液中綠原酸在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5加樣回收率試驗

精密稱取同一蜜楝樣品6份，各約0.2 g。向6份樣品中分別加入1.2 mg綠原酸對照品，按本文方法制備供試液和測定綠原酸含量，并計算回收率。結(jié)果如表1。

表1　綠原酸加樣回收率試驗（n＝6）Table 1 Spiked recovery of chlorogenic acid（n＝6）

2.6樣品含量測定

稱取蜜楝不同時間的葉、花蕾、花和果實共18個樣品，其中：葉10份（1號～10號），花蕾及花3份（11號～13號），果實5份（14號～18號），每個樣品各取樣3份，每份約1 g，均精密稱定。按照1.5項下方法制備供試液，按照1.3項下條件測定，每份進(jìn)樣3次，每次進(jìn)樣10 μL。測得18個樣品中綠原酸含量在4.458 mg/g～27.296 mg/g之間。樣品含量測定色譜圖見圖3，其綠原酸含量和RSD見表2。

圖3　蜜楝花蕾供試品色譜圖Fig.3 Chromatogrem of tested sample from flower bud of Evodia lenticellata Huang注：1為綠原酸。

試驗分析結(jié)果表明，蜜楝的葉片、花蕾、花以及果實在其生長階段都含有綠原酸成分，其中早期花蕾和幼果中的含量最為豐富，分別可達(dá)27.296 mg/g和16.698 mg/g。相比之下，葉片中的綠原酸含量較低，而且在整個生長期內(nèi)（4月中旬幼葉期至10月下旬落葉期）的變化較小，含量在4.690 mg/g～8.901 mg/g之間，其中在8月中下旬的含量較高，可達(dá)8.901 mg/g，生長期內(nèi)葉片中綠原酸平均含量為5.67 mg/g。6月下旬至8月中上旬為蜜楝的花蕾期至盛花期，在此階段花中的綠原酸含量較高，其中花蕾未開放時其綠原酸含量可達(dá)27.296 mg/g，盛花階段的含量達(dá)14.594 mg/g。在8月底形成幼果時，其綠原酸含量可達(dá)16.698 mg/g，但隨著果實的發(fā)育長大，其綠原酸的含量慢慢降低，到10月中上旬果實近成熟時其含量為12.782 mg/g，到10月底果實成熟變色時，其綠原酸的含量降至8.786 mg/g。由此可見，在蜜楝的不同部位，花蕾中綠原酸的含量最高，幼果中次之，這兩個階段的材料可作為提取制備綠原酸的原料。考慮到原材料產(chǎn)量的因素，幼果期的收率更佳，這與種植者采收果實作為藥材的采收期基本吻合。

表2　蜜楝不同部位中不同生長時期綠原酸含量測定（n＝3）Table 2 Quantitative determination of chlorogenic acidat different times in different parts of Evodia lenticellata Huang（n＝3）

3　結(jié)論

HPLC法測定不同植物中綠原酸含量時所用流動相不同，多為乙腈+0.4 %磷酸混合溶液，兩種溶液的比例有一定的變化?！吨袊幍洹罚?010版）在分析金銀花中綠原酸含量時采用的流動相為乙腈∶0.4 %磷酸二者為13∶87[15]。本試驗用乙腈+0.4 %磷酸混合溶液做為流動相，對兩種溶液的配比情況與綠原酸色譜峰的變化進(jìn)行了比較分析。在乙腈∶0.4 %磷酸二者為13∶87時供試液中綠原酸色譜峰的分離效果不佳，在減少乙腈、增加磷酸比例時綠原酸色譜峰分離效果漸漸好轉(zhuǎn)，當(dāng)將流動相比例調(diào)至8∶92時，綠原酸和其相鄰組分達(dá)到了很好的分離效果。故本試驗在分析蜜楝藥材中綠原酸使用的流動相最終確定為乙腈∶0.4 %磷酸的比例為8∶92。這可能是由于不同材料中所含成分不同而對綠原酸成分的影響不同所致。

從不同時期蜜楝葉、花和果中綠原酸含量分析可以看出，花蕾中綠原酸含量最高（27.296 mg/g），幼果中綠原酸含量次之（16.698 mg/g），近成熟果實中的含量有所下降（13.807 mg/g），葉中含量較低。同時，各部位綠原酸的含量都隨著其生長階段的不同有一定的變化。張萬明等曾對與蜜楝同屬的植物吳茱萸中綠原酸的含量進(jìn)行了分析測定[16]，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地吳茱萸果實中綠原酸含量在4.20 mg/g～11.65 mg/g之間。相比之下，蜜楝花蕾、花以及果實中綠原酸含量高于文獻(xiàn)報道的吳茱萸果實中綠原酸的含量，也高于文獻(xiàn)對艾葉（8.2 mg/g）中的綠原酸含量的報道[8]，與杜仲葉（17.8 mg/g）和胎菊（18.8 mg/g）中綠原酸的含量相當(dāng)[9-10]。因此，蜜楝的花蕾、花及果實可作為提取制備綠原酸成分的一種藥用資源，具有良好的開發(fā)利用價值。

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Research about the Accumulation of Chlorogenic Acid at Different Part of Evodia lenticellata Huang by HPLC

MA Ying-li，ZHAO Hua*，YANG Qiu-chen，CHEN Xiao-ling
（College of Biological Science and Engineering，Shaanxi University of Technology，Hanzhong 723000，Shaanxi，China）

Abstract：The contents of chlorogenic acid in Evodia lenticellata Huang in different times were determined by using HPLC.The chromatographic separation was carried out using Inertsil ODS-3 C18column（4.6 mm×150 mm，5 μm），the mobile phase was acetonitrile：0.2 % phosphoric acid（8∶92），the detection wavelength was set at 327 nm，the temperature was 30℃，and the flow rate was 1.0 mL/min.The calibration curve was linear in the range of 30.4 μg/mL -152 μg/mL and the regression equation for chlorogenic acid was Y=27.335X-7.67（R2= 0.999 8），the average recovery was 100.77 % with RSD of 1.58 %（n=6）.The result showed that there are some difference in the content of chlorogenic acid among different periods，the content of chlorogenic acid were range between 4.69 mg/g to 8.90 mg /g in the leaf，14.59 mg/g to 27.30 mg /g in the flower and 8.79 mg/g to 16.70 mg /g in the fruit.The accumulation of chlorogenic acid in the same parts of different time shows certain regularity.The study showed that the flower and fruit of E.lenticellata Huang can be used as a kind of resource to extract chlorogenic acid.

Key words：Evodia lenticellata Huang；chlorogenic acid；accumulation；contents analysis

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.05.004

基金項目：陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計劃項目（2015KTTSSF01-02）；陜西理工學(xué)院研究生創(chuàng)新基金項目（SLGYCX1512）

作者簡介：馬英麗（1988—），女（漢），在讀碩士研究生，研究方向：植物資源開發(fā)利用研究。

*通信作者：趙樺（1957—），男（漢），教授，碩士，研究方向：植物資源開發(fā)利用研究。

收稿日期：2015-01-22