張秋墨 洪華 金丹

【摘要】[目的]觀察奇林古丹液對(duì)免疫功能低下模型小鼠的影響，探究奇林古丹液的免疫調(diào)節(jié)作用。[方法]選用昆明種小鼠，隨機(jī)分3組，正常對(duì)照組、模型組和實(shí)驗(yàn)組，模型組和實(shí)驗(yàn)組小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺注射液，建立免疫功能低下模型，觀察奇林古丹液對(duì)血清半數(shù)溶血素值及脾臟細(xì)胞生成抗體功能的影響。[結(jié)果]奇林古丹液明顯提高血清半數(shù)溶血素值，提升脾臟細(xì)胞生成抗體的功能。[結(jié)論]奇林古丹液能明顯增強(qiáng)免疫功能低下小鼠的免疫功能。

【關(guān)鍵詞】奇林古丹液；免疫功能低下；溶血素

1 材料與方法

1.1 材料

奇林古丹液，由原河南省微生物學(xué)會(huì)腫瘤免疫治療研究所提供。昆明種小鼠，雄性，6～7周，體重18～22g，由延邊大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。注射用環(huán)磷酰胺為江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司產(chǎn)品，紅細(xì)胞裂解液購(gòu)于Beyotime公司，豚鼠血清購(gòu)于北京solarbio公司，都氏試劑（碳酸氫鈉1.0g，氰化鉀0.8g，高鐵氰化鉀0.2g， 蒸水至1L），核蛋白定量分析儀：美國(guó)Bio-Rad公司生產(chǎn)，電熱恒溫培養(yǎng)箱：美國(guó)SHELLAB公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與給藥

將小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組，模型組和實(shí)驗(yàn)組，將小鼠的胸前區(qū)和兩側(cè)前肢腕部去毛后，涂抹奇林古丹液1號(hào)液，胸前區(qū)70 l，前肢各25l，共120l/只。對(duì)照組和模型組涂抹生理鹽水。實(shí)驗(yàn)第 6 天涂抹奇林古丹液2號(hào)液，方法同前。模型組和實(shí)驗(yàn)組小鼠在實(shí)驗(yàn)第7天腹腔注射環(huán)磷酰胺100 mg/kg，連續(xù)3天，正常對(duì)照組注射等量生理鹽水。

1.2.2 血清溶血素的測(cè)定

造模前一天，給小鼠腹腔注射20%綿羊紅細(xì)胞懸液200l/只。48h后取血，室溫放置1h，2000rpm/min，離心20min，收集血清。用生理鹽水稀釋200倍，取稀釋的血清1ml于試管中，依次加入5%綿羊紅細(xì)胞懸液0.5ml，1：10稀釋的豚鼠血清1ml，搖勻。將試管置37℃電熱恒溫箱中1h。取出后立即放入冰浴中，終止反應(yīng)。各試管2000rpm/min，離心20min，取1ml上清液移入另一試管中后再加入3ml都氏試劑，混勻，置室溫10min。以1ml的生理鹽水代替血清樣本，其余操作均相同，此試管做樣品空白對(duì)照。取5%綿羊紅細(xì)胞懸液0.25ml，加入3.75ml都氏試劑，混勻，置室溫10min，此試管做為綿羊紅細(xì)胞的半數(shù)溶血管。以對(duì)照管做空白，測(cè)定各管光密度值A(chǔ)540。血清溶血素含量以半數(shù)溶血（HC50）來(lái)表示。

1.2.3定量溶血分光光度法

造模前一天給小鼠腹腔注射2%綿羊紅細(xì)胞懸液200l/只。造模完成48h后，處死小鼠，取脾臟，用生理鹽水制備2×106 細(xì)胞/ml的脾細(xì)胞懸液。另取試管，每個(gè)試管中依次加入脾細(xì)胞懸液、0.2%綿羊紅細(xì)胞懸液、1：10稀釋的補(bǔ)體1ml，充分混勻，置37℃水浴箱，溫育1h后，3000rpm/min，離心10min，取上清液，測(cè)定光密度A413值。

1.2.4 脾臟細(xì)胞懸液的制備

頸椎脫臼法處死小鼠，取出脾臟，置于盛有適量生理鹽水的培養(yǎng)皿中，反復(fù)研磨得單細(xì)胞懸液后，移入50ml離心管中，1000rpm離心15min，棄上清，吹打混勻，加入5倍量（約2ml）紅細(xì)胞裂解液裂解6min，用適量生理鹽水終止裂解后，1000rpm離心10min，棄上清，吹打混勻，過(guò)70μm細(xì)胞篩，細(xì)胞計(jì)數(shù)，配制成2×106 細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)值均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，采用SPSS20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，組間的比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，當(dāng)P<0.05時(shí)，證明組間存在顯著性差異，反之則沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)免疫功能低下小鼠血清溶血素的影響

實(shí)驗(yàn)組（4.49 0.65）和模型組（3.16 0.37）小鼠血清溶血素均低于正常組（15.52 0.87），實(shí)驗(yàn)組明顯高于模型組有顯著性差異（P0.01）（見(jiàn)圖1）。

圖1：奇林古丹液對(duì)免疫低下小鼠血清溶血素的影響.（n=6， #表示與正常組比較 P<0.01，*表示實(shí)驗(yàn)組與模型組比較 P<0.01）

2.2對(duì)免疫功能低下小鼠分泌抗體的影響

實(shí)驗(yàn)組（3.03 0.012）和模型組（0.28 0.003）小鼠脾臟細(xì)胞分泌抗體能力明顯低于正常組（0.31 0.003），有顯著性差異（P0.01）。但實(shí)驗(yàn)組與模型組比較抗體產(chǎn)生細(xì)胞明顯增加，有顯著性差異（P0.05）（見(jiàn) 圖 2）。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用免疫功能低下小鼠模型觀察了奇林古丹液的免疫效應(yīng)，研究結(jié)果顯示，奇林古丹液可有效提高環(huán)磷酰胺所致免疫功能低下小鼠的HC50值和脾臟細(xì)胞中抗體分泌細(xì)胞水平，表明奇林古丹液有增強(qiáng)體液免疫功能。

本研究所用的奇林古丹液給藥途徑操作簡(jiǎn)便，用藥劑量少，給藥時(shí)間短，說(shuō)明該藥使用于臨床上，患者可得到提高機(jī)體免疫功能的效果。研究結(jié)果提示，奇林古丹液作為免疫增強(qiáng)劑，具有巨大的研究?jī)r(jià)值與應(yīng)用前景，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

【參考文獻(xiàn)】

[1]李儀奎.中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社， 1991： 155-156.

[2]HG沃格爾，WH沃格爾.藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)指南-新藥發(fā)現(xiàn)和藥理學(xué)評(píng)價(jià)[M]. 北京： 科學(xué)出版社， 2001： 583

[3]徐叔云，卞如濂，陳修.藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社， 1991： 1233.