曹智麗，周俊英，王娟，王艷，王維，張文雙

(1河北北方學(xué)院附屬第二醫(yī)院，河北張家口075100；2河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院)

酒精性肝病大鼠肝組織PPARα表達(dá)及意義

曹智麗1，周俊英2，王娟1，王艷1，王維1，張文雙1

(1河北北方學(xué)院附屬第二醫(yī)院，河北張家口075100；2河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院)

目的 探討過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARα)在酒精性肝病發(fā)生、發(fā)展中的作用。方法 選擇Wistar大鼠50只，隨機取40只采用乙醇灌胃法制備酒精性肝病模型，根據(jù)造模時間不同分為模型4、8、12、16周組。至造模結(jié)束，共成模35只，模型4、8、12、16周組分別10、9、8、8只；剩余10只作為正常對照組，不予任何處理。各組處死后留取肝組織標(biāo)本。采用免疫組化染色法、Western blotting法、RT-qPCR法檢測PPARα蛋白及mRNA表達(dá)。結(jié)果 免疫組化染色顯示，PPARα蛋白定位于肝細(xì)胞胞質(zhì)，呈棕黃色染色。正常對照組肝細(xì)胞PPARα蛋白表達(dá)豐富；隨著造模時間的延長，各模型組肝組織PPARα蛋白表達(dá)逐漸減少，模型16周組肝組織僅見少量PPARα蛋白表達(dá)。Western blotting、qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，各模型組PPARα蛋白及mRNA表達(dá)均低于正常對照組(P均<0.05)；隨著造模時間的延長，PPARα蛋白及mRNA表達(dá)逐漸降低(P均<0.05)。結(jié)論 PPARα可能參與酒精性肝病的發(fā)生、發(fā)展。

酒精性肝??；過氧化物酶體增殖物激活受體α；大鼠

近年來，酒精性肝病的發(fā)病率逐年升高，已成為繼病毒性肝炎后導(dǎo)致肝損傷的第二大病因。酒精性肝病的病理變化最初主要為肝細(xì)胞脂肪變性，隨后進(jìn)展為脂肪性肝炎、肝纖維化，最終導(dǎo)致肝硬化。過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARs)是核激素受體家族中的配體激活受體，分為α、β、γ三種亞型，其中PPARα可通過多種途徑參與脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)。但其在酒精性肝病發(fā)病過程中作用的研究鮮見報道。2013年12月～2014年12月，我們觀察了酒精性肝病大鼠肝組織PPARα表達(dá)，現(xiàn)分析結(jié)果并探討其在酒精性肝病發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性Wistar大鼠50只，清潔級，3月齡，體質(zhì)量(200±20)g，由河北醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供，動物許可證號：SCXK(冀)2008-1-003。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度(22±2)℃，濕度(70±5)%。主要儀器：UV-2550PCX型紫外分光光度計，寧波新芝生物科技股份有限公司；ABI7500型實時熒光定量PCR儀，美國ABI公司；電泳儀，美國Hoefer公司；5417R型臺式高速冷凍離心機，德國EP公司。主要試劑：TRIzol試劑，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒、PPARα上下游引物、β-actin上下游引物，美國Invitrogen公司；PPARα抗體，美國Epitomics公司；β-actin抗體，杭州華安生物有限公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗，美國KPL公司；ECL發(fā)光液，美國Santa Cruz公司；RIPA細(xì)胞裂解液，北京索萊寶科技有限公司；PVDF膜，美國Millpore公司。

1.2 模型制備及干預(yù) 所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機取40只采用乙醇灌胃法[1]建立酒精性肝病模型。根據(jù)造模時間不同分為模型4、8、12、16周組，每組10只。1～4周給予30%乙醇5.0 g/(kg·d)灌胃，5～8周給予40%乙醇6.0 g/(kg·d)灌胃，9～12周給予50%乙醇7.0 g/(kg·d)灌胃，13～16周給予60%乙醇8.0 g/(kg·d)灌胃。每日9：00灌胃，1次/d。模型制備過程中5只大鼠因乙醇誤吸入氣管窒息死亡，模型4、8、12、16周組分別有10、9、8、8只成模。各組造模結(jié)束禁食12 h處死，留取肝組織標(biāo)本。剩余10只作為正常對照組，不予任何處理，直接處死留取肝組織標(biāo)本。

1.3 相關(guān)指標(biāo)觀察

1.3.1 肝組織PPARα蛋白表達(dá) ①采用免疫組化法。取各組肝組織，4%中性甲醛固定，石蠟包埋，常規(guī)方法制備組織切片，免疫組化染色，顯微鏡下觀察。②采用Western blotting法。取100 mg肝組織制備組織勻漿；提取蛋白并定量后，行SDS-PAGE電泳，蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜；將PPARα、β-actin一抗加入不同標(biāo)記的PVDF膜上，洗膜、定影，最后ECL顯影。應(yīng)用Image J軟件測定條帶灰度值，以目標(biāo)條帶與內(nèi)參條帶灰度的比值作為PPARα蛋白的相對表達(dá)量。

1.3.2 肝組織PPARα mRNA表達(dá) 采用RT-qPCR法。取部分肝組織以TRIzol法提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，應(yīng)用熒光定量PCR試劑盒、ABI7500型實時熒光定量PCR儀測定PPARα mRNA表達(dá)。引物由美國Invitrogen公司合成，PPARα：上游引物5′-CACGATGCTGTCCTCCTT-3′，下游引物5′-TCCAGTTCGAGGGCATTG-3′；β-actin：上游引物5′-CCATGTACGTAGCCATCC-3′，下游引物5′-CTCAGCTGTGGTGGTGAA-3′。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共40個循環(huán)。以2-ΔΔCt法計算PPARα mRNA的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

免疫組化染色顯示，PPARα蛋白定位于肝細(xì)胞胞質(zhì)，呈棕黃色染色。正常對照組肝細(xì)胞PPARα蛋白表達(dá)豐富(插頁Ⅱ圖5A)；隨著造模時間延長，各模型組肝組織PPARα蛋白表達(dá)逐漸減少(插頁Ⅱ圖5B、5C、5D)，至模型16周組時肝組織僅見少量PPARα蛋白表達(dá)(插頁Ⅱ圖5E)。

正常對照組肝組織PPARα蛋白及mRNA相對表達(dá)量均高于各模型組(P均<0.05)。隨著造模時間的延長，各模型組肝組織PPARα蛋白及mRNA相對表達(dá)量逐漸降低(P均<0.05)。各組肝組織PPARα蛋白及mRNA相對表達(dá)量比較見表1。

表1 各組肝組織PPARα蛋白及mRNA相對表達(dá)量比較

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與模型4周組比較，#P<0.05；與模型8周組比較，△P<0.05；與模型12周組比較，▲P<0.05。

3 討論

酒精性肝病是由于長期大量飲酒導(dǎo)致的肝臟疾病，隨著病程進(jìn)展，可逐漸發(fā)展為酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝硬化等[2]。酒精性肝病早期典型的病理變化是肝細(xì)胞脂肪變性，一旦去除乙醇誘因，脂肪變性往往能夠恢復(fù)正常。若脂肪合成、分解、代謝等出現(xiàn)異常，代謝紊亂會加重肝細(xì)胞損傷，且肝細(xì)胞損傷與肝臟脂肪沉積的程度密切相關(guān)。在乙醇引起肝細(xì)胞脂肪沉積的基礎(chǔ)上肝細(xì)胞受到氧化應(yīng)激作用，炎癥反應(yīng)加重，可進(jìn)一步加重肝臟的病理損傷[3，4]。

PPARα是一種參與調(diào)節(jié)脂肪酸氧化和運輸?shù)暮思に厥荏w，其參與脂質(zhì)代謝的各個環(huán)節(jié)，包括脂肪酸在細(xì)胞內(nèi)結(jié)合、脂肪酸透膜吸收、脂蛋白合成與轉(zhuǎn)運等，其表達(dá)與肝臟乙醇代謝和脂質(zhì)代謝密切相關(guān)[5]。有研究證實，乙醇通過抑制PPARα的表達(dá)及破壞PPARα蛋白的功能，干預(yù)脂肪酸的氧化及轉(zhuǎn)運途徑，抑制甘油三酯合成，最終引起脂質(zhì)代謝障礙[6]；而脂質(zhì)代謝失衡可導(dǎo)致肝內(nèi)脂質(zhì)聚集過多，超過肝負(fù)荷，即引起肝細(xì)胞脂肪變性，肝組織內(nèi)過量脂質(zhì)浸潤可引起線粒體損傷、氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步加重肝損傷[7]。Lebrun等[8]研究發(fā)現(xiàn)，隨著酒精性肝病造模時間延長，肝組織脂肪沉積逐漸增多，至造模結(jié)束時肝細(xì)胞內(nèi)已呈彌漫小泡性脂肪變性。Nakajima等[9]研究發(fā)現(xiàn)，乙醇長期喂養(yǎng)可降低小鼠肝組織PPARα mRNA和蛋白的表達(dá)，下調(diào)PPARα的靶基因表達(dá)，如?；o酶α氧化酶、中鏈?；o酶α脫氫酶、脂肪酸結(jié)合蛋白等；有研究還發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用乙醇誘導(dǎo)PPARα基因敲除的小鼠比野生型小鼠更易發(fā)生肝損傷，說明PPARα表達(dá)可被乙醇抑制，從而導(dǎo)致脂肪酸β氧化減少，促進(jìn)脂肪酸和甘油三酯的合成，進(jìn)一步導(dǎo)致肝細(xì)胞脂肪變性的發(fā)生[10～14]。Sahebkar等[15]研究也證實，隨著乙醇代謝產(chǎn)物乙醛生成量的增多，PPARα表達(dá)逐漸減少，肝細(xì)胞所受傷害和毒性作用相繼出現(xiàn)，如線粒體損傷、炎性損傷等。

本研究各模型組PPARα蛋白及mRNA表達(dá)均低于正常對照組；隨著造模時間延長，各模型組肝組織PPARα蛋白及mRNA表達(dá)逐漸降低。推測激活PPARα受體可促進(jìn)脂肪酸氧化基因、脂質(zhì)合成基因的表達(dá)，從而改善乙醇引起的脂質(zhì)代謝紊亂，減輕肝細(xì)胞脂肪累積[16～19]。

綜上所述，我們認(rèn)為PPARα可能參與酒精性肝病的發(fā)生、發(fā)展，其具體作用機制尚不清楚，仍需進(jìn)一步研究。

[1] 周俊英，周東方，王瑋.酒精直接灌胃法建立大鼠酒精性肝病模型[J].河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2009，30(4)：328-330.

[2] 中華醫(yī)學(xué)會肝病學(xué)分會脂肪肝和酒精性肝病學(xué)組.酒精性肝病診療指南(2010年修訂版)[J].中華肝臟病雜志，2010，18(3)：167-170.

[3] Keller JM, Collet P, Bianchi A, et al. Implications of peroxisome proliferator-activated receptors(PPARS)in development, cell life status and disease[J]. Int J Dev Biol, 2000,44(5):429-442.

[4] Kong L, Ren W, Li W, et al. Activation of peroxisome proliferator activated receptor alpha ameliorates ethanol induced steatohepatitis in mice[J]. Lipids Health Dis, 2011(10):246.

[5] Konig B, Koch A, Spielmann J, et al. Activation of PPAR alpha lowers synthesis and concentration of cholesterol by reduction of nuclear SREBP-2[J]. Biochem Pharmacol, 2007,73(4):574-585.

[6] 楊輝，李瑜元，聶玉強，等.過氧化物酶體增殖因子活化受體-基因多態(tài)性與非酒精性脂肪性肝病及脂聯(lián)素的關(guān)系[J].中華消化雜志，2008，28(2)：113-115.

[7] Nan YM, Kong LB, Ren WG, et al. Activation of peroxisome proliferator activated receptorα ameliorates ethanol mediated 1iver fibrosis in mice[J]. Lipids Health Dis, 2013(12):21.

[8] Lebrun V, Molendi-Coste O, Lanthier N, et al. Impact of PPAR-α induction on glucose homoeostasis in alcohol-fed mice[J]. Clin Sci(Lond), 2013,125(11):501-511.

[9] Nakajima T, Kamijo Y, Tanaka N, et al. Peroxisome proliferator-activated receptor a protects against alcohol-induced liver damage[J]. Hepatology, 2004,40(4):972-980.

[10] 陸璐，錢建成，胡晨波，等.過氧化物酶體增殖物激活受體γC161-T、細(xì)胞色素P450ⅡE1基因多態(tài)性與脂肪性肝病相關(guān)性研究[J].中國醫(yī)刊，2013，48(6)：46-49.

[11] 王瑋，周俊英，趙彩彥，等.脂聯(lián)素及其受體在酒精性肝病大鼠肝組織中的表達(dá)下降[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2010，30(2)：170-174.

[12] 許新，姜曼，李江文，等.過氧化物酶體增殖物激活受體γ基因rs3856806位點多態(tài)性與非酒精性脂肪性肝病的相關(guān)性分析[J].臨床肝膽病雜志，2015，31(7)：1088-1091.

[13] 姜瀟，白曉彥，伍會健.PPARs在非酒精性脂肪性肝病發(fā)病機制中的作用[J].生理科學(xué)進(jìn)展，2015，46(3)：220-224.

[14] 金文君.過氧化物酶體增殖物激活受體與脂肪性肝病的關(guān)系[J].實驗與檢驗醫(yī)學(xué)，2008，26(1)：65-66.

[15] Sahebkar A, Chew GT, Watts GF. New peroxisome proliferator-activated receptor agonists: potential treatments for atherogenic dyslipidemia and non-alcoholic fatty liver disease[J]. Exper Opin Pharmacother, 2014,15(4):493-503.

[16] GaIli A, Pinaire J, Fischer M, et al. The transcrip tional and DNA binding activity of peroxisome proliferator-activated receptor alpha is inhibited by ethanol metabolism. A nove1 mechanism for the development of ethanol-induced fatty liver[J]. J Biol Chem, 2001,276(1):68-75.

[17] 陶妍，吳高峰，楊建成，等.PPAR-α在酒精性脂肪肝發(fā)生中的作用研究進(jìn)展[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2012，32(2)：71-74.

[18] 郭美祥，田曉娟，李文彪.過氧化物酶體增殖物激活受體與酒精性肝病關(guān)系研究進(jìn)展[J].中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志，2006，16(5)：306-308.

[19] 黎玉.酒精性脂肪肝分子機制的研究進(jìn)展[J].中華肝臟病雜志，2006，14(11)：878-880.

張家口市科技計劃自籌經(jīng)費項目(1521060D)。

周俊英(E-mail： doctorzhoujy@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.24.010

R575.5

A

1002-266X(2016)24-0031-03

2016-01-12)