徐俊，侯玉潔，趙國琦，羅林廣

(1. 江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與標(biāo)準(zhǔn)研究所，江西 南昌 330200；2. 揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009)

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羊草莖在奶牛瘤胃中降解特性及其對食糜纖維分解菌數(shù)量的影響

徐俊1,2，侯玉潔1,2，趙國琦2*，羅林廣1

(1. 江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與標(biāo)準(zhǔn)研究所，江西 南昌 330200；2. 揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009)

摘要：本試驗(yàn)旨在研究羊草莖降解特性和緊密吸附于莖的3種主要纖維分解菌的動(dòng)態(tài)變化。選用羊草莖為試驗(yàn)材料，將其縱切6份后裝入尼龍袋投入瘤胃中，分別在6，12，24，48和72 h取出，利用掃描電子顯微鏡觀察超微結(jié)構(gòu)變化；取粉碎后羊草莖進(jìn)行尼龍袋試驗(yàn)，分別在0.5，2，6、12，24，48和72 h取出，測定不同時(shí)間點(diǎn)中性洗滌纖維(neutral detergent fiber，NDF)降解率和吸附在莖中3種主要纖維分解菌的數(shù)量變化。結(jié)果表明，薄壁組織和韌皮部可被瘤胃微生物降解，維管束會(huì)伴隨薄壁組織的降解而發(fā)生脫落。羊草莖和食糜不同時(shí)間點(diǎn)纖維分解菌數(shù)量均為產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌>白色瘤胃球菌>黃色瘤胃球菌，莖中產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌和黃色瘤胃球菌數(shù)量在24 h達(dá)峰值，分別為109和105 copy/g羊草莖，白色瘤胃球菌在12 h達(dá)峰值，為108 copy/g羊草莖。瘤胃食糜中3種纖維分解菌的數(shù)量在24 h內(nèi)基本處在一個(gè)恒定的水平，而羊草莖NDF降解率在72 h內(nèi)逐漸提高，羊草NDF降解率與瘤胃食糜中3種纖維分解菌數(shù)量不同步，這可能與纖維分解菌分泌的酶活力存在滯后有關(guān)。

關(guān)鍵詞：羊草莖；纖維分解菌；降解；瘤胃

反芻動(dòng)物瘤胃棲息著大量微生物，包括細(xì)菌、真菌和原蟲等，纖維素可被它們降解形成揮發(fā)性脂肪酸為機(jī)體供能[1]。瘤胃中88%～91%的葡萄糖內(nèi)切酶和木聚糖酶，70%的淀粉酶和75%的蛋白酶均由緊密吸附的細(xì)菌分泌，因此細(xì)菌在細(xì)胞壁的降解過程中發(fā)揮著十分重要的作用[2]。深入研究緊密吸附在纖維中的細(xì)菌對于進(jìn)一步了解纖維的降解具有十分重要的意義。黃色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌和產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌是瘤胃中3種主要的纖維分解菌[3-4]，前人已通過純培養(yǎng)的方法對其纖維吸附機(jī)理進(jìn)行了大量研究。Mosoni等[5]研究發(fā)現(xiàn)，吸附在纖維素上的黃色瘤胃球菌和產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌只需45 min即可達(dá)到峰值。黃色瘤胃球菌和產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌在大麥秸桿(Hordeumvulgare)中的吸附位點(diǎn)各不相同，并且其他非纖維降解菌如棲瘤胃擬桿菌的吸附不影響纖維分解菌的吸附[6]。然而，上述文獻(xiàn)多是通過體外法研究纖維分解菌對纖維的降解，無法獲悉緊密吸附在纖維內(nèi)部纖維分解菌的數(shù)量隨時(shí)間的動(dòng)態(tài)變化，并且有關(guān)禾本科牧草莖的組織超微結(jié)構(gòu)變化和纖維動(dòng)態(tài)降解率的研究還很少報(bào)道。本研究旨在通過尼龍袋技術(shù)和掃描電子顯微鏡(Scanning Electron Microscope，SEM)技術(shù)研究羊草(Leymuschinensis)莖在奶牛瘤胃中的動(dòng)態(tài)降解及超微結(jié)構(gòu)變化，同時(shí)運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)研究緊密吸附在羊草莖和瘤胃食糜中產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌、黃色瘤胃球菌和白色瘤胃球菌3種主要纖維分解菌的動(dòng)態(tài)變化，為深入研究羊草莖在奶牛瘤胃中的降解規(guī)律提供一定的理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)動(dòng)物和飼養(yǎng)管理

2013年6月，在揚(yáng)州大學(xué)試驗(yàn)農(nóng)牧場選取3頭安裝有永久性瘤胃瘺管的荷斯坦奶牛(600±15) kg，飼喂主要由玉米青貯、秸稈和精料補(bǔ)充料組成的全混合日糧，栓系式飼養(yǎng)，日喂兩次，自由飲水。

1.2電鏡樣品的制備與觀察

收割揚(yáng)州大學(xué)試驗(yàn)農(nóng)牧場種植的長勢和株高相近的抽穗初期羊草3根，剝離得到羊草莖稈部分，在第2節(jié)上緣節(jié)下2 cm處截取3 cm長片段，縱切為6份，分別放入特制尼龍袋(4 cm×7 cm，孔徑48 μm)中，1個(gè)尼龍袋只放1段樣品，分別在6，12，24，48和72 h取出，在水中輕柔沖洗15 min左右，直到流出的水澄清為止，然后按掃描電子顯微鏡觀測要求制備樣品。未放入瘤胃降解的羊草莖于37℃水中浸泡12 h作為對照樣觀察。掃描電鏡的制備參考徐俊等[7]的方法，主要步驟如下：先切除樣品2端1 mm左右片段，以消除邊緣效應(yīng)，然后截取2個(gè)1 mm的片段，放入2.5%的戊二醛溶液中固定24 h，次日倒掉戊二醛溶液，用磷酸鹽緩沖液沖洗3次，各級乙醇脫水，在1∶1的醋酸異戊酯與乙醇混合液中處理30 min，再用純的醋酸異戊酯處理1 h，經(jīng)臨界點(diǎn)干燥，最后放樣品臺(tái)噴金，用掃描電鏡(XL-30，Phillips)觀察，照相。

1.3莖尼龍袋降解和瘤胃食糜樣品的采集

取羊草莖在65℃下烘干，粉碎過2 mm篩，然后稱取3.00 g樣品(每個(gè)時(shí)間點(diǎn)2份)放入尼龍袋(8 cm×12 cm，孔徑48 μm)中，于晨飼前投入瘤胃，分別在0.5，2，6，12，24，48和72 h取出，立即放冰水中終止發(fā)酵，用冷水沖洗至澄清，然后用力將尼龍袋中的水?dāng)D干，-80℃保存，測定NDF降解率和3種主要纖維分解菌的數(shù)量。同時(shí)采集奶牛飼喂后2，6，12和24 h的瘤胃食糜樣品，-80℃保存測定纖維分解菌數(shù)量。

1.4纖維分解菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR

取羊草莖和瘤胃食糜樣品，分別按照OMEGA植物DNA和糞便DNA提取試劑盒操作說明提取總DNA，通過瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計(jì)分析DNA質(zhì)量及其濃度，本試驗(yàn)測定的纖維分解菌包括黃色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌和產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌，3種纖維分解菌的引物設(shè)計(jì)如表1所示。PCR產(chǎn)物通過PMD18-T載體連接，然后轉(zhuǎn)入大腸桿菌細(xì)胞，根據(jù)Omega質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒DNA，送北京信諾金達(dá)公司測序分析，序列結(jié)果在NCBI上進(jìn)行比對分析，并利用分光光度計(jì)測定質(zhì)粒中DNA濃度，計(jì)算質(zhì)?？截悢?shù)。對質(zhì)粒DNA溶液進(jìn)行10倍系列稀釋，利用 TaKaRa SYBR Green Ⅱ進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，采用20 μL反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性2 min，95℃30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。根據(jù)拷貝數(shù)和對應(yīng)的Ct值建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，對羊草和瘤胃食糜樣品中的DNA拷貝數(shù)進(jìn)行定量，然后對每克樣品中微生物基因拷貝數(shù)取對數(shù)值[log copy/g DM stem (digesta)]，計(jì)算參照楊金麗等[8]的方法。

表1　細(xì)菌名稱和引物序列

1.5數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)結(jié)果用Microsoft Excel 2007整理，采用SPSS 17.0中的One-Way Anova進(jìn)行方差分析，并用Duncan法做多重比較，結(jié)果以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，以P<0.05作為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)。

2結(jié)果與分析

2.1掃描電鏡下羊草莖超微結(jié)構(gòu)變化

圖1顯示了掃描電鏡下羊草莖在奶牛瘤胃內(nèi)降解0～72.0 h的超微結(jié)構(gòu)變化圖。6 h時(shí)，羊草莖表面吸附有大量微生物；12 h時(shí)，韌皮部組織出現(xiàn)明顯的降解(圖1C箭頭所示)；到24 h時(shí)，薄壁組織大部分已被降解；72 h后維管束組織一直未被降解，伴隨薄壁組織的降解而發(fā)生脫落，羊草莖表皮和厚壁組織基本不降解，72 h后仍保持完整。

2.2羊草莖中纖維分解菌的數(shù)量變化

羊草莖緊密吸附的3種主要纖維分解菌在0.5～72.0 h的數(shù)量變化如圖2所示。由圖可知，在不同時(shí)間點(diǎn)，3種纖維分解菌數(shù)量都是產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌>白色瘤胃球菌>黃色瘤胃球菌，降解0.5 h后，上述3種纖維分解菌的數(shù)量分別達(dá)到107，103和106copy/g羊草莖。細(xì)菌在羊草莖降解的前2 h吸附速度最快，產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌和黃色瘤胃球菌的數(shù)量均在24 h達(dá)到峰值，分別為109和105copy/g羊草莖，白色瘤胃球菌數(shù)量是在12 h達(dá)到峰值，為108copy/g羊草莖。72 h后吸附的纖維分解菌數(shù)量相比于各自細(xì)菌的峰值都有所下降，且黃色瘤胃球菌和白色瘤胃球菌的數(shù)量都是顯著降低(P<0.05)。

2.3羊草莖NDF動(dòng)態(tài)降解率

羊草莖72 h內(nèi)NDF動(dòng)態(tài)降解率如圖3所示。NDF在前6 h降解速率十分緩慢，這與莖在瘤胃中掃描電鏡圖片得到的降解結(jié)果一致，組織結(jié)構(gòu)前6 h變化不明顯，主要是發(fā)生細(xì)菌的附著。在12～48 h期間，羊草莖薄壁組織開始大量降解，48 h后降解率達(dá)到35.89%，隨著時(shí)間的推移仍在平緩上升，72 h后達(dá)到38.78%。與此同時(shí)，由掃描電鏡可知，72 h后維管束組織將會(huì)發(fā)生脫落，羊草莖NDF降解率仍會(huì)提高。

2.4瘤胃中纖維分解菌的數(shù)量變化

瘤胃食糜中3種纖維分解菌24 h內(nèi)的數(shù)量變化如圖4所示，與羊草莖中纖維分解菌的數(shù)量類似，食糜中3種纖維分解菌的數(shù)量也是產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌>白色瘤胃球菌>黃色瘤胃球菌，上述3種細(xì)菌的數(shù)量均值為109,106和104copy/g食糜。 黃色瘤胃球菌和白色瘤胃球菌的數(shù)量在24 h內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)均無顯著差異(P>0.05)， 產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌是6 h時(shí)的數(shù)量顯著高于其他3個(gè)時(shí)間點(diǎn)(P<0.05)，總體而言，瘤胃中不同時(shí)間點(diǎn)3種纖維分解菌的數(shù)量十分穩(wěn)定。

圖1　羊草莖在瘤胃中降解后的掃描電鏡圖片F(xiàn)ig.1　The structure dynamic changes of L. chinensis stems observed under scanning electron microscope　Epi：對照樣品中(0 h)表皮Epidermis；S：厚壁組織Sclerenchyma；V：維管束Vascular；B：維管束鞘Bundle sheath； P：韌皮部phloem；Par：薄壁組織Parenchyma.

圖2　羊草莖中緊密吸附的產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌、黃色瘤胃球菌和白色瘤胃球菌隨時(shí)間的數(shù)量變化Fig.2　Time course of fiber-associated cell number of F. succinogenes, R. flavefaciens, R. albus from 0.5 to 72 h incubation

圖3　羊草莖中性洗滌纖維瘤胃72 h降解率Fig.3　NDF digestibility of L. chinensis stem during in situ incubation for 72 h

不同字母代表相同細(xì)菌不同時(shí)間點(diǎn)差異顯著(P<0.05)，下同。 Different letters mean the significant differences atP<0.05，the same below.

3討論

羊草作為禾本科牧草，細(xì)胞壁組織結(jié)構(gòu)和豆科牧草(如苜蓿)存在一定的差異，苜蓿表皮和厚角組織可以完全被瘤胃微生物降解，但羊草組織結(jié)構(gòu)中的表皮和厚壁組織在72 h后仍保持完好[7]。羊草組織結(jié)構(gòu)與同為禾本科的燕麥草類似，都是由表皮、厚壁組織、薄壁組織和維管束等結(jié)構(gòu)組成。但羊草細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)相比于燕麥草更加致密，這也許是導(dǎo)致其降解速率慢、 NDF降解率低的原因，燕麥草中的維管束在48 h后幾乎全部伴隨薄壁組織的降解而脫落[9]，但羊草組織中維管束降解72 h后仍未發(fā)生脫落，燕麥草莖在48和72 h的NDF降解率分別為40.23%和43.11%，均分別高于羊草的35.89%和38.78%。羊草莖NDF主要包括纖維素、半纖維素和難降解的木質(zhì)素，羊草細(xì)胞壁中非木質(zhì)化的薄壁組織可被瘤胃內(nèi)纖維分解菌降解，但木質(zhì)化程度高的厚壁組織和表皮則無法降解[10]，這是因?yàn)槟举|(zhì)素可與細(xì)胞壁中的多糖形成動(dòng)物體內(nèi)的酶難以降解的復(fù)合體，限制動(dòng)物機(jī)體對植物細(xì)胞壁成分的消化吸收[11]。

圖4　奶牛瘤胃中24 h內(nèi)產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌、黃色瘤胃球菌和白色瘤胃球菌的數(shù)量變化Fig.4　The diurnal changes of F. succinogenes, R. flavefaciens　　 and R. albus in the rumen of cows

在瘤胃微生物中，細(xì)菌和真菌可以分泌多種活性很高的纖維降解酶，它們占降解纖維酶活力的80%以上，但由于真菌在總微生物中含量較低(約8%)，對纖維降解的貢獻(xiàn)不如細(xì)菌大，瘤胃中細(xì)菌在對纖維的降解過程中起到了決定性作用，尤其是與飼料顆粒緊密吸附的細(xì)菌[12]。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌可以快速附著于黑麥草，且在薄壁組織和韌皮部中的細(xì)菌吸附量最多，尤其是黃色瘤胃球菌[13]，本試驗(yàn)中羊草組織結(jié)構(gòu)的降解與之類似，但各時(shí)間點(diǎn)均以產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌的附著量最多，而非黃色瘤胃球菌，這可能與試驗(yàn)材料和試驗(yàn)動(dòng)物不同有關(guān)。Koike等[14]選擇鴨茅(Dactylisglomerata)莖為試驗(yàn)材料，通過競爭性PCR研究了綿羊中3種主要纖維降解菌對鴨茅莖的降解規(guī)律，結(jié)果表明,在培養(yǎng)5 min后，產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌和其他兩種球菌的數(shù)量可達(dá)到105和104copy/g DM，10 min后各細(xì)菌數(shù)量增加了10倍，且24 h時(shí)產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌和黃色瘤胃球菌數(shù)量達(dá)到峰值，分別為109和107copy/g DM，而白色瘤胃球菌需要48 h才達(dá)到峰值(106copy/g DM)。此外，產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌是瘤胃食糜和鴨茅莖降解中最重要的細(xì)菌，本試驗(yàn)結(jié)果與上述研究相吻合，但是白色瘤胃球菌在12 h即達(dá)到峰值108copy/g DM，且羊草莖和瘤胃食糜中的白色瘤胃球菌數(shù)量顯著高于黃色瘤胃球菌。

羊草莖NDF降解率隨著時(shí)間的延長逐漸上升，但與莖中緊密吸附的纖維分解菌數(shù)量并不同步，該結(jié)果與Koike等[14]報(bào)道的結(jié)果一致，緊密吸附于纖維的細(xì)菌在降解NDF之前還會(huì)利用其他底物，如可溶性碳水化合物，與此同時(shí)，體外法研究表明，纖維素酶的分泌是由纖維素和木聚糖誘導(dǎo)產(chǎn)生的，這可能是造成NDF降解率與纖維分解菌不同步的主要原因。由瘤胃食糜中3種纖維分解菌的數(shù)量變化可知，產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌在食糜和羊草莖中均占據(jù)主導(dǎo)地位，該結(jié)果與Koike和Kobayashi[3]報(bào)道的結(jié)果一致，綿羊瘤胃中產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌數(shù)量均高于其他兩種球菌數(shù)量，而與綿羊采食的日糧無關(guān)[15-16]，盡管有報(bào)道發(fā)現(xiàn)高精料日糧條件會(huì)降低瘤胃中產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌數(shù)量[17]。然而，也有研究表明奶牛瘤胃中白色瘤胃球菌數(shù)量比產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌更多，且研究還發(fā)現(xiàn)不同動(dòng)物種類也會(huì)影響纖維分解菌的群落結(jié)構(gòu)[18]。

4結(jié)論

通過對羊草莖組織結(jié)構(gòu)和NDF動(dòng)態(tài)降解率以及緊密吸附的3種主要纖維分解菌的數(shù)量變化的研究表明，羊草莖薄壁組織可被降解，但降解速率較慢，細(xì)菌可快速吸附于纖維組織，NDF降解率隨著時(shí)間的延長不斷提高，但與瘤胃食糜中的纖維分解菌數(shù)量不同步，這可能與纖維分解菌分泌的酶活力滯后有關(guān)。

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Kinetics of in situ degradation ofLeymuschinensisstems in the dairy cow rumen and changes in cellulolytic bacteria in digesta

XU Jun1,2, HOU Yu-Jie1,2, ZHAO Guo-Qi2*, LUO Lin-Guang1

1.InstituteofQualitySafetyandStandardsofAgriculturalProducts,JiangxiAcademyofAgriculturalSciences,Nanchang330200,China; 2.CollegeofAnimalScienceandTechnology,YangzhouUniversity,Yangzhou225009,China

Abstract:In this study, we investigated the degradation characteristics of Leymus chinensis stems in the dairy cow rumen and evaluated the changes in cellulolytic bacteria during the degradation process. L. chinensis stems were cut and packed into six nylon bags, which were incubated for 6, 12, 24, 48, and 72 h in the rumen of a dairy cow. Changes in the ultra-structure of L. chinensis stems during digestion in the rumen were evaluated by scanning electron microscopy. L. chinensis stems incubated for 0.5, 2, 6, 12, 24, 48, and 72 h in the rumen were evaluated to determine their neutral detergent fiber (NDF) digestibility. The cellulolytic bacteria in these digesta samples were also analyzed. The results showed that the non-lignified parenchymal tissue and phloem were quickly degraded and the vascular bundle was released from the plant tissues after degradation of the parenchymal tissue. The main bacterial species attached to the stem tissues were Fibrobacter succinogenes>Ruminococcus albus>Ruminococcus flavefaciens. The numbers of these bacteria peaked at 24 h (109/g dry matter for F. succinogenes and 105/g for R. flavefaciens) or 12 h (108/g DM for R. albus) of digestion in the rumen. The numbers of cellulolytic bacteria in digesta remained constant after 24 h, while the disappearance of NDF from the L. chinensis stems showed a linear increase up to 72 h of digestion. These results suggest that the disappearance of NDF from the L. chinensis stem is not synchronized with changes in the populations of cellulolytic bacteria in digesta, and may instead be related to a delayed increase in the activities of fibrolytic enzymes.

Key words:Leymus chinensis stem; cellulolytic bacteria; degradation; rumen

*通信作者

Corresponding author. E-mail：gqzhao@yzu.edu.cn

作者簡介：徐俊(1986-)，男，江西南昌人，助理研究員。E-mail:xujun0125@163.com

基金項(xiàng)目：十二五國家科技支撐計(jì)劃(2011BAD17B03)和國家自然科學(xué)基金(31560647)資助。

*收稿日期：2015-06-10；改回日期：2015-08-24

DOI：10.11686/cyxb2015298

http://cyxb.lzu.edu.cn

徐俊, 侯玉潔, 趙國琦, 羅林廣. 羊草莖在奶牛瘤胃中降解特性及其對食糜纖維分解菌數(shù)量的影響.草業(yè)學(xué)報(bào), 2016, 25(4): 166-171.

XU Jun, HOU Yu-Jie, ZHAO Guo-Qi, LUO Lin-Guang. Kinetics of in situ degradation ofLeymuschinensisstems in the dairy cow rumen and changes in cellulolytic bacteria in digesta. Acta Prataculturae Sinica, 2016, 25(4): 166-171.