白瑜 杜麗敏 趙平

·論著·

黃體酮對視神經(jīng)損傷大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞微管相關(guān)蛋白-1B的影響

白瑜 杜麗敏 趙平

目的 觀察并探討黃體酮對視神經(jīng)損傷早期視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞微管相關(guān)蛋白-1B的影響，以期為黃體酮在視神經(jīng)保護方面的作用提供實驗依據(jù)。方法 60只大鼠隨機分為3組,每組20只。正常對照組不做任何處理，損傷1組制作右眼視神經(jīng)夾傷模型，給予0.9%氯化鈉溶液腹腔注射，損傷2組制作右眼視神經(jīng)夾傷模型，給予黃體酮腹腔注射。分別于損傷后1、3、7、14、28 d將3組大鼠右眼球摘除, 取視網(wǎng)膜組織, HE染色光學(xué)顯微鏡觀察視網(wǎng)膜形態(tài)學(xué)變化，并計數(shù)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞存活數(shù)量,免疫組織化學(xué)染色觀察視網(wǎng)膜組織中 MAP-1B在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的表達情況。結(jié)果 視神經(jīng)損傷后損傷1組視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層明顯水腫，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)目迅速減少，經(jīng)黃體酮治療的損傷2組視網(wǎng)膜形態(tài)改變輕微，視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層輕度水腫，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)目減少緩慢。損傷2組各時間段視網(wǎng)膜MAP-1B平均光密度值較損傷1組高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 黃體酮可以通過增加細胞骨架蛋白MAP-1B減輕視神經(jīng)損傷早期視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的損害，對視神經(jīng)及視網(wǎng)膜有保護作用。

黃體酮;視神經(jīng)損傷;視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞;微管相關(guān)蛋白質(zhì)類

隨著外傷事件的逐年增多，視神經(jīng)損傷，現(xiàn)在臨床多稱為外傷性視神經(jīng)病變(traumatic optic neuropathy,TON)，已成為現(xiàn)代社會中致盲的重要因素及眼科學(xué)者的研究熱點。視神經(jīng)損傷后視功能下降的病理基礎(chǔ)是視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(retinal ganglion cells，RGCs)的進行性變性、凋亡及其軸突的潰變和壞死。因此，減緩RGCs的變性、凋亡以及促進其軸突再生成為治療本病的關(guān)鍵所在[1]。黃體酮(progesterone,PROG)作為一種性激素已廣泛應(yīng)用于婦產(chǎn)科臨床，近年來大量研究證實，它在抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后神經(jīng)細胞的凋亡、促進受損神經(jīng)元髓鞘生成，保護中樞神經(jīng)系統(tǒng)方面也具有良好的作用，但其對于視神經(jīng)損傷的作用報道較少[1，2]。微管相關(guān)蛋白(microtubule associated protein-1B，MAP-1B)是軸突生長和維持細胞骨架正常形態(tài)所必需的一種非常重要的細胞骨架蛋白[1]，在視神經(jīng)損傷后RGCs的存活和軸突再生中起著重要的作用[2]。本研究通過建立大鼠視神經(jīng)損傷模型，觀察腹腔注射PROG對視神經(jīng)損傷早期RGCs的保護作用及其對視神經(jīng)損傷后視網(wǎng)膜MAP-1B表達的影響，從而為黃體酮治療視神經(jīng)損傷的臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 清潔級健康成年雄性SD大鼠60只，購自河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，合格證號：SCXK(冀2012-3-05)。體重(200±20)g，行外眼及眼底檢查無病變者納入實驗。選擇右眼為實驗眼，隨機分為正常對照組(不做任何處理)、損傷1組(右眼行視神經(jīng)不全損傷處理，傷后每日腹腔注射0.9%氯化鈉溶液10.0 mg/kg)、損傷2組(右眼行視神經(jīng)不全損傷處理，傷后每日腹腔注射PROG 10.0 mg/kg)，每組20只。

1.2 實驗試劑 黃體酮注射液(上海通用藥業(yè)股份有限公司)，SP免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)DAB檢測試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)MAP-1B抗鼠單克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 視神經(jīng)損傷模型制作[3]:損傷1組及損傷2組均于術(shù)前3 d用抗生素眼水、眼膏點眼。正常對照組大鼠不做任何處理。2損傷組大鼠用5%水合氯醛7 ml/kg 腹腔注射麻醉成功后，將實驗組大鼠取俯臥位固定于手術(shù)臺上，消毒鋪巾，取右眼為實驗眼，在手術(shù)顯微鏡下沿角鞏膜緣弧形向上沿鼻側(cè)剪開球結(jié)膜，鈍性分離眼眶組織直達視神經(jīng)，在距球后2 mm處，用壓力恒定的反向顳夾持視神經(jīng)20 s造成視神經(jīng)不全損傷，用10-0尼龍線縫合球結(jié)膜2針，結(jié)膜囊內(nèi)涂鹽酸洛美沙星眼膏。術(shù)眼瞳孔散大固定、直接光反射消失為成功模型，否則剔除。

1.3.2 HE染色及免疫組化染色:2損傷組每日腹腔注射PROG 10.0 mg/kg，以0.9%氯化鈉溶液稀釋，正常對照組給予0.9%氯化鈉溶液 10.0 mg/kg腹腔注射。分別于術(shù)后第1、3、7、14、28天經(jīng)多聚甲醛心臟灌注后立即摘取右眼眼球及部分視神經(jīng)放入4%多聚甲醛溶液中固定48 h取出，平行于眼球矢狀軸并通過視神經(jīng)做視網(wǎng)膜組織5 μm連續(xù)切片3張，HE染色光學(xué)顯微鏡觀察RGCs的形態(tài)及數(shù)量變化。免疫組織化學(xué)染色觀察視網(wǎng)膜組織中MAP-1B的表達變化，計算機圖像分析進行半定量檢測平均光密度值(verage optical density,AOD),以免疫陽性染色的AOD值來表示抗原表達量，AOD值越高則陽性表達越強。

2 結(jié)果

2.1 RGCs形態(tài)的改變 正常對照組大鼠視網(wǎng)膜HE染色可見3層細胞核，從玻璃體向鞏膜依次為RGCs層、雙極細胞層、感光細胞層。視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞層的細胞呈單層排列，大小不一，輪廓不規(guī)則，細胞邊界較清晰。從胞核形態(tài)學(xué)可以分為大而淺染的細胞核以及小而深染的細胞核，后者居多。損傷1組可見視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層水腫，損傷早期部分神經(jīng)節(jié)細胞出現(xiàn)水腫及空泡樣改變，另有部分細胞出現(xiàn)核溶解以及胞漿淡染。損傷2組視網(wǎng)膜形態(tài)改變較損傷1組輕，視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層僅輕度水腫，損傷早期細胞形態(tài)大致正常，只有少部分出現(xiàn)核溶解及胞漿淡染，晚期神經(jīng)節(jié)細胞才出現(xiàn)水腫及空泡樣改變。見圖1～3。

2.2 RGCs數(shù)量的改變 視神經(jīng)損傷后2損傷組RGCs數(shù)目均呈下降趨勢，14 d以前RGCs呈快速減少，14 d以后RGCs減少速度變緩，1～28 d各時間段損傷2組的RGCs數(shù)目高于損傷1組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或<0.01)，2損傷組各時間段RGCs數(shù)目均低于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表1，圖4。

表1 不同時期各損傷組RGCs數(shù)量 n=20,個,

注：正常對照組RGCs數(shù)量: 29.90±0.54

表1 3d時損傷1組視網(wǎng)膜(HE×400)表2 3d時損傷2組視網(wǎng)膜(HE×400)表3 7d時損傷1組視網(wǎng)膜(HE×400)

圖4 3組不同時期RGCs的數(shù)量

2.3 視網(wǎng)膜MAP-1B免疫組化染色結(jié)果 正常對照組大鼠視網(wǎng)膜中MAP-1B強陽性呈棕黃色，主要表達于光感受器內(nèi)節(jié)；弱陽性呈淡黃色，主要表達于少數(shù)RGCs胞漿和光感受器外節(jié)。視神經(jīng)損傷后3 d后，RGCs MAP-1B呈棕黃色陽性表達，主要分布于RGCs的胞漿，而內(nèi)核層細胞胞漿呈淡黃色弱陽性表達。損傷1組和損傷2組MAP-1B在各時間點的表達。見圖5～13。

表5 7d時損傷1組視網(wǎng)膜(HE×400)圖6 3d時損傷1組視網(wǎng)膜MAP-1B(免疫組化×400) 圖7 3d時損傷2組視網(wǎng)膜MAP-1B(免疫組化×400)

圖8 7d時損傷1組視網(wǎng)膜MAP-1B(免疫組化×400) 圖9 7d時損傷2組視網(wǎng)膜MAP-1B(免疫組化×400) 圖10 14d時損傷1組視網(wǎng)膜MAP-1B(免疫組化×400)

2.4 視網(wǎng)膜MAP-1B免疫組化半定量檢測結(jié)果 視神經(jīng)損傷后3 d時損傷1組和損傷2組RGCs層MAP-1B陽性表達增加，損傷1組7 d時MAP-1B表達最強，高于同組其他時間段，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，14 d時表達明顯減弱。損傷2組14 d內(nèi)MAP-1B的表達逐漸增強，14 d時最強，明顯高于同組其他時間段(P<0.05)，表達部位同正常對照組。2個損傷組28 d時MAP-1B的表達明顯減弱，且2組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0．05)。損傷1組與損傷2組的RGCs層MAP-1B平均光密度值均高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2，圖14。

圖11 14d時損傷2組視網(wǎng)膜MAP-1B(免疫組化×400) 圖12 28d時損傷1組視網(wǎng)膜MAP-1B(免疫組化×400) 圖13 28d時損傷1組視網(wǎng)膜MAP-1B(免疫組化×400)

表2 半定量檢測不同時期視網(wǎng)膜表達MAP-1B 的光密度值 ±s

注：正常對照組視網(wǎng)膜表達MAP-1B光密度值:0.0744±0.0216；與其他時間比較，*P<0.05

圖14 不同時期損傷1組及損傷2組視網(wǎng)膜MAP-1B平均光密度值

3 討論

視神經(jīng)損傷后RGCs的丟失在大量動物實驗中曾得到過詳盡的研究[4-6]。局部軸突的斷裂、細胞骨架破壞導(dǎo)致的軸漿運輸障礙，以及局部血液循環(huán)障礙導(dǎo)致的組織缺血、缺氧是引起RGCs變性、凋亡的重要因素[7]。因此，如何促進神經(jīng)軸突再生成為保護RGCs，提高視功能的關(guān)鍵所在。研究表明，神經(jīng)細胞能夠維持正常生理功能，依賴于軸漿在胞體和軸突末梢之間流動所進行的物質(zhì)的運輸和交換，而軸突細胞骨架是維持軸突正常形態(tài)結(jié)構(gòu)同時也是維持軸漿正常流動的重要亞細胞結(jié)構(gòu)[6]。細胞骨架的破壞是視神經(jīng)損傷后首先出現(xiàn)的超微改變之一，也是影響神經(jīng)軸突再生的主要因素之一。

MAP-1B是一種非常重要的細胞骨架蛋白，是微管間橫橋的重要成分，它在生長的神經(jīng)突起中表達豐富，是軸突生長所必需的。研究表明，神經(jīng)損傷后軸突的伸長主要是通過微管的延伸來實現(xiàn)的，神經(jīng)絲隨著微管的延伸而生長，而MAP-1B是微管間“橋”的主要成份，使微管穩(wěn)定聚合成束，從胞體延伸到軸突末端，促進軸突的再髓鞘化[8-10]。MAP-1B主要分布于神經(jīng)元胞體、 核周及其延伸的軸突上, 在成年視網(wǎng)膜主要集中于光感受器細胞(視錐細胞與視桿細胞)內(nèi)節(jié)和外節(jié)也有少許分布。MAP-1B有多個磷酸位點，經(jīng)磷酸化修飾后才能發(fā)揮其生物活性，其主要有2種磷酸化形式PI-MAP-1B和PII-MAP-1B。MAP-1B及其磷酸化亞型(MAP-1B-P)廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍神經(jīng)系統(tǒng),并在神經(jīng)生長和再生中扮演重要角色[11-13]。所以，在實驗研究中MAP-1B被經(jīng)常作為神經(jīng)保護類藥促進神經(jīng)髓鞘再生程度及對神經(jīng)元保護作用的衡量標準[14,15]。

PROG是一種激素類神經(jīng)類固醇，既往多用于治療婦產(chǎn)科疾病。近年研究發(fā)現(xiàn)，PROG能夠很好的促進受損神經(jīng)髓鞘再生。Labombarda 等[16]通過對脊髓損傷大鼠模型的研究發(fā)現(xiàn)PROG可以提高脊髓損傷后新半乳糖白蛋白2和髓磷脂堿蛋白的細胞數(shù)量,從而促進神經(jīng)髓鞘形成。Schumacher等[17]研究證明了在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)產(chǎn)生髓鞘的少突膠質(zhì)細胞中,PROG可以通過增加髓磷脂堿基蛋白(myelin basic protein,MBP)的表達量從而促進髓鞘形成。Ghoumari等[18]更是對PROG在髓鞘形成和再生過程的重要作用做了詳細的闡明。而本研究結(jié)果顯示，視神經(jīng)損傷后，RGCs內(nèi)MAP-1B表達量增高。經(jīng)過PROG治療的損傷2組與損傷1組相比，在各時間段，MAP-1B表達強度都明顯增高。說明PROG可能通過增加MAP-1B生成而起到促進受損視神經(jīng)髓鞘再生的作用。

同時大量研究表明，PROG也可以通過抑制神經(jīng)系統(tǒng)炎性介質(zhì)[19]、減輕神經(jīng)細胞離子間失衡[20]、穩(wěn)定細胞Na+-K+-ATP酶[21]、降低組織NO水平、減少神經(jīng)毒性介質(zhì)的釋放[22]等多種途徑起到保護神經(jīng)的作用。這在本實驗中，通過觀察視神經(jīng)損傷后RGCs數(shù)目發(fā)現(xiàn)：應(yīng)用PROG后，不僅減緩了視神經(jīng)損傷早期RGCs數(shù)目的下降程度，而且增加了損傷末期RGCs的存活數(shù)量。進一步證實了PROG保護視神經(jīng)的作用。

1 Beat M,Riederer E.Microtubule-associated protein 1B, a growth-associated and phosphorylated scaffold protein. Brain Research Bulletin,2007,71:541-558.

2 Daniela C,Trivedi N,Engelmann R,et al.Partial regeneration and long-term survival of rat retinal ganglion cells after optic nerve crush is accompanied by altered expression, phosphorylation and distribution of cytoskeletal proteins. European Journal of Neuroscience,2002,15:1433-1443.

3 黃厚斌,馬志中,張卯年.大鼠視神經(jīng)部分損傷后視神經(jīng)纖維再生的形態(tài)學(xué)觀察.中華眼科雜志,2006,42:251-255.

4 祁曉君,馮煒,張潔,等.丙戊酸鈉在大鼠視神經(jīng)損傷再生中的作用研究及對BDNF表達的影響.中華眼外傷職業(yè)眼病雜志,2014,36:488-491.

5 黃曉瑛,趙平.米諾環(huán)素對大鼠視神經(jīng)損傷后視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞和小膠質(zhì)細胞表達的影響.中華眼外傷職業(yè)眼病雜志,2013,35:481-484.

6 劉曉坤,張曉宇,王赟,等.米諾環(huán)素對大鼠視神經(jīng)挫傷后視網(wǎng)膜Caspase-3表達的影響. 眼科新進展,2013,33:1132-1135.

7 Wells J,Matthew R,Jeremy A,et al.Early In Vivo Changes in Calcium Ions,Oxidative Stress Markers,and Ion Channel Immunoreactivity Following Partial Injury to the Optic Nerve. Journal of Neuroscience Research,2012,90:606-618.

8 Tint I,Fischer I,Black M.Acute Inactivation of MAP1b in Growing Sympathetic Neurons Destabilizes Axonal Microtubules.Cell Motility and the Cytoskeleton,2005,60:48-65.

9 Thomas B,Sheat M,Beermann L.Respective Roles of Neurofilaments, Microtubules,MAP1B, and Tau in Neurite Outgrowth and Stabilization.Molecular Biology of the Cell,1994,5:863-875.

10 Jonathan G,Peter K,Fiona B,et al.The protein MAP-1B links GABA(C) receptors to the cytoskeleton at retinal synapses.NATURE,1999,397:66-69.

11 Pinzon Duarte G,Arango Gonzalez B,Guenther E,et al.Effects of brain-derived neurotrophic factor on cell survival,differentiation and patterning of neuronal connec-tions and Müller glia cells in the developing retina. European Journal of Neuroscience,2004,19: 1475-1484.

12 Franzen R,Sandra L,Suzanne M,et al.Microtubule-associated protein 1B: a neuronal binding partner for myelin-associated glycoprotein. The Journal of Cell Biology,2001,155:893-898.

13 Alfeia L,Soaresb S.Expression of MAP-1B protein and its phosphorylated form MAP1B-P in the CNS of a continuously growing fish, the rainbow trout.Brain Research,2004,1009:54-66.

14 唐秀武，劉金華.蛇毒神經(jīng)生長因子對鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞微管相關(guān)蛋白-1B的影響.眼科新進展,2007,27: 808-812.

15 Gonzalez-Billaul C，Owen R，Phillip R.Gordon-Weeks,et al.Microtubule-associated protein 1B is involved in the initial stages of axonogenesis in peripheral nervous system cultured neurons. Brain Research,2002,943:56-67.

16 Labombarda F,Gonzalez S,Gonzalez Deniselle MC,et al.Progesterone increases the expression of myelin basic protein and the number of cells showing NG2 immunostaining in the lesioned spinal cord. Journal of Neurotrauma,2006,23:181-192.

17 Schumacher M, Guennoun R,Robert F,et al.Local synthesis and dual actions of progesterone in the nervous system:neuroprotection and myelination.Growth Horm IGF Research,2004,14: S18-S33.

18 Ghoumari AM,Ibanez C,El-Etr M,et al.Progesterone and its metabolites increase myelin basic protein expression in organotypic slice cultures of rat cerebellum.Journal of Neurotrauma,2003,86:848-859.

19 Chen G,Shi JX,Ding YS,et al.Progesterone prevents traumatic brain injury-induced intestinal nuclear factor kappa B activation and proinflammatory cytokines expresstion in male rats.Hindawi Publishing Corporation Mediators of Inflammation,2007,10:1155-1162.

20 Wells J,Matthew R,Jeremy A,et al.Early in vivo changes in calcium lons,oxidative stress markers,and immunoreactivity following partial injury to the optic nerve.Journa of Neuroscience. Research,2012,90:606-618.

21 Garay L,Deniselle MC,Lima A,et al.Effects of progesterone in the sp inal cord of a mouse model of multiple sclerosis. Journal of steroid biochemistry and molecular biology,2007,107:228-237.

22 白瑜,陳乾,安國禹,等.黃體酮在大鼠視神經(jīng)損傷再生中的保護作用.眼科新進展,2015,35:924-928.

Effects of progesterone on the expression of MAP-1B in retinal ganglion cells of rats with optic nerve injury)

BAIYu)

*,DULimin,ZHAOPing.*DepartmentofOphthalmology,TheSecondHospitalofShijiazhuangCity,Hebei,Shijiazhuang050051,China

Objective To observe the effects of progesterone on the expression of microtubule associated protein-1B(MAP-1B)in retinal ganglion cells of rats with optic nerve injury in order to provide experimental evidence of progesterone’s protective effects on optic nerve.Methods Sixty rats were randomly divided into 3 groups,with 20 rats in each group.The rats in control group were not treated,however,the optic nerve injury models in right eye of rats were established in injury group 1,with 0.9% sodium chloride solution intraperitoneal injection,and the animal models were also established in injury group 2,with progesterone intraperitoneal injection. On 3d,7d,14d and 28d after injury, the right eyeballs of rats were excised, and retinal tissues were taken out, the morphological changes of retina were observed by HE staining, and the survival numbers of retinal ganglion cell were calculated, furthermore,the expression levels of MAP-1B in retinal ganglion cell were detected by immunohistochemistry.Results After optic nerve injury,the retinal nerve fiber layer appeared obvious edema,and the numbers of retinal ganglion cells were quickly decreased in injury group 1,however, the retinal morphological changes were alleviated,retinal nerve fiber layer appeared slight edema and the numbers of retinal ganglion cells were decreased slowly after treatment with progesterone in injury group 2.There was a significant difference in the optical density value at different time points between injury group 1 and injury group 2 (P<0.05).Conclusion Progesterone can relieve the damage of retinal ganglion cells at early period of optic nerve injury through increasing the expression levels of cytoskeleton protein-MAP-1b,thus,which has protective effects on optic nerve and retina.

progesterone; optical nerve injury; retinal ganglion cell; microtubule associated protein-1B

10.3969/j.issn.1002-7386.2016.08.002

050051 河北省石家莊市第二醫(yī)院眼科(白瑜);河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院眼科(杜麗敏、趙平)

趙平，050051 石家莊市，河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院眼科；

E-mail：zhpsjz@126.com

R 774.6

A

1002-7386(2016)08-1128-05

2015-12-01)