趙靜宇，汪夢(mèng)霞，趙自明，孟祥寶，孫桂波，孫曉波

［1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬?gòu)V東省第二中醫(yī)院，廣東廣州 510405；2.廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院，廣東省中醫(yī)藥研究開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510095，3.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，中藥（天然產(chǎn)物）創(chuàng)新藥物研發(fā)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193］

基于Nrf2信號(hào)通路的三七總皂苷對(duì)Aβ25－35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用機(jī)制研究

趙靜宇1，2，汪夢(mèng)霞1，2，趙自明2，孟祥寶3，孫桂波3，孫曉波3

［1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬?gòu)V東省第二中醫(yī)院，廣東廣州 510405；2.廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院，廣東省中醫(yī)藥研究開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510095，3.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，中藥（天然產(chǎn)物）創(chuàng)新藥物研發(fā)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193］

目的 探討三七總皂苷對(duì)Aβ25－35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用及分子機(jī)制。方法 利用Aβ25－35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷模型，MTT法檢測(cè)PC12細(xì)胞活力，試劑盒測(cè)定LDH漏出量、ROS水平、MDA含量、Caspase-3活力以及抗氧化酶SOD、CAT和GHS-Px活力，TUNEL染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡，JC-1染色觀察線粒體膜電位，Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白HO-1、Lamin-B、細(xì)胞核內(nèi)Nrf2及總Nrf2的蛋白表達(dá)。結(jié)果三七總皂苷能夠明顯抑制Aβ25－35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞活力下降（P＜0.01）和LDH漏出（P＜0.01），減少ROS和MDA的產(chǎn)生（P＜0.01），增加SOD、CAT和GSH-Px活力（P＜0.01），穩(wěn)定線粒體膜電位，抑制caspase-3的活化（P＜0.01）。而且，三七總皂苷還能夠上調(diào)PC12細(xì)胞細(xì)胞核Nrf2、總Nrf2和細(xì)胞質(zhì)中HO-1的蛋白表達(dá)。HO-1抑制劑SnPP能夠抑制三七總皂苷的神經(jīng)保護(hù)作用。結(jié)論 三七總皂苷可能通過(guò)上調(diào)Nrf2/HO-1信號(hào)通路，從而抑制Aβ25－35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡。

阿爾茨海默病；三七總皂苷；氧化應(yīng)激；凋亡；Nrf2；HO-1

阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一種最常見(jiàn)的老年癡呆癥。目前全球大約有3 500萬(wàn)患者，已成為繼心血管疾病和腫瘤之后，嚴(yán)重影響人類健康的第3位因素［1－2］。隨著人口老齡化的加劇，AD的發(fā)病率也逐年上升，給患者本身及其家庭和社會(huì)造成了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此，開(kāi)發(fā)具有防治AD作用的藥物迫在眉睫。

AD的主要病理特征是β淀粉樣蛋白細(xì)胞外沉積形成的老年斑、細(xì)胞內(nèi)過(guò)度磷酸化的Tau蛋白為核心形成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)以及神經(jīng)元的丟失［3］。盡管國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)AD的研究有了很大進(jìn)步，但AD的具體發(fā)病機(jī)制目前還不清楚。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激和凋亡促進(jìn)了AD的發(fā)生發(fā)展［4］。因此，深入研究藥物抗AD的作用靶點(diǎn)和分子機(jī)制，對(duì)AD的防治具有重要意義。

細(xì)胞自身為應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激啟動(dòng)了很多保護(hù)性機(jī)制，包括抗氧化劑和內(nèi)源性抗氧化酶系統(tǒng)。其中抗氧化酶包括HO-1、SOD、CAT和GSH-Px等。藥物誘導(dǎo)這些抗氧化酶表達(dá)能夠增強(qiáng)神經(jīng)細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的抵抗能力。這些抗氧化酶的轉(zhuǎn)錄表達(dá)主要受Nrf2/ARE信號(hào)通路的調(diào)控。在靜息狀態(tài)下，Nrf2在胞質(zhì)中與Keap1結(jié)合形成復(fù)合體。當(dāng)復(fù)合體遭到破壞，Nrf2會(huì)轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核內(nèi)與ARE序列結(jié)合，促進(jìn)抗氧化酶的表達(dá)［5］。

目前臨床上針對(duì)AD的藥物很少，而且這些藥物都是對(duì)癥治療，并不能逆轉(zhuǎn)或根治AD，因此尋找有效的AD防治藥物顯得非常迫切。天然藥物尤其是中藥，一直以來(lái)在疾病防治方面都有著明顯的優(yōu)勢(shì)。從中藥中發(fā)掘和開(kāi)發(fā)具有神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用的化合物和防治AD的藥物，已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外新藥研發(fā)的熱點(diǎn)。

三七是我國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥，為五加科人參屬植物三七的干燥根，其性甘、溫，微苦，主入肝、胃經(jīng)，具有化瘀止血，活血定痛的功能，臨床上主要用于心腦血管疾病的治療。三七總皂苷是三七的主要活性成分，文獻(xiàn)報(bào)道三七中的一些單體成分如人參皂苷Rg1、Rb1等對(duì)AD具有防治作用［6］。但是，三七總皂苷防治AD的藥效及其作用機(jī)制，目前尚不清楚。

因此，本研究通過(guò)建立AD體外模型Aβ25－35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡，從氧化應(yīng)激和凋亡角度考察三七總皂苷的神經(jīng)保護(hù)作用，并考察三七總皂苷對(duì)Nrf2/HO-1信號(hào)通路的調(diào)控作用，探索三七總皂苷防治AD的分子機(jī)制。為進(jìn)一步研究中藥抗AD的分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 藥物與試劑 三七總皂苷購(gòu)自上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司；PC12細(xì)胞由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院細(xì)胞庫(kù)提供；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；LDH、MDA、SOD、CAT和GSH-Px檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；ROS檢測(cè)試劑盒和JC-1購(gòu)自美國(guó)Enzolife sciences；Caspase-3熒光檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)BioVision；Nrf2 和HO-1抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz Biotechnology；In Situ Cell Death Detection Kit，POD試劑盒購(gòu)自美國(guó)Roche。

1.2 主要儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific；超凈工作臺(tái)購(gòu)自上海智成分析儀器制造有限公司；倒置相差顯微鏡購(gòu)自日本Olympus；離心機(jī)購(gòu)自中國(guó)Anke；酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Tek；熒光顯微鏡購(gòu)自德國(guó)Leica；PYY-7C型電泳儀購(gòu)自北京市六一儀器廠；Chemi DOCTM型凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和藥物配制 PC12細(xì)胞用含有10％胎牛血清，5％馬血清，100 000 U·L－1青霉素和100 mg·L－1鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。三七總皂苷溶于DMSO配制成儲(chǔ)備溶液（100 g ·L－1），然后稀釋成所需濃度使用?？瞻讓?duì)照組細(xì)胞DMEM中添加等量的DMSO，濃度不高于1‰。

2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力 PC12細(xì)胞經(jīng)實(shí)驗(yàn)處理后，吸掉培養(yǎng)液，加入MTT溶液（終濃度為1 g· L－1），37°C繼續(xù)孵育4 h。然后用DMSO溶解細(xì)胞產(chǎn)生的甲。將96孔板置振蕩器中振搖10 min后，置酶標(biāo)儀中，570 nm處測(cè)定每孔OD值。細(xì)胞活力用實(shí)驗(yàn)組OD值占正常對(duì)照組OD值的百分比表示。

2.3 乳酸脫氫酶（LDH）漏出率檢測(cè) 收集細(xì)胞培養(yǎng)液，測(cè)定培養(yǎng)液中LDH活力，胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，反復(fù)凍融破碎細(xì)胞，測(cè)定細(xì)胞中LDH活力，LDH漏出率＝培養(yǎng)液中LDH活力/（培養(yǎng)液中LDH活力＋細(xì)胞中LDH活力）。

2.4 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 PC12細(xì)胞（每孔1 ×105）種植于放在6孔板中的細(xì)胞爬片上，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。細(xì)胞經(jīng)實(shí)驗(yàn)處理后，4％多聚甲醛室溫固定30 min。PC12細(xì)胞滴加0.3％H2O2孵育30 min，并滴加0.1％Triton X-100溶液孵育30 min。滴加N末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶后，細(xì)胞爬片置于濕盒中37℃孵育1 h，然后滴加抗地高辛結(jié)合物孵育30 min。DAPI（100 g·L－1）染細(xì)胞核，熒光顯微鏡觀察并拍照。

2.5 線粒體膜電位檢測(cè) 線粒體膜電位的下降是細(xì)胞凋亡早期的一個(gè)標(biāo)志性事件。線粒體膜電位的變化用JC-1染料檢測(cè)，常用紅綠熒光相對(duì)比例來(lái)衡量。PC12細(xì)胞經(jīng)實(shí)驗(yàn)處理后，加入JC-1溶液（終濃度為2μmol·L－1），37°C避光孵育30 min，PBS洗兩遍，DAPI（100 g·L－1）染細(xì)胞核，熒光顯微鏡進(jìn)行觀察拍照。

2.6 Caspase-3活力檢測(cè) Caspase-3是細(xì)胞凋亡過(guò)程中關(guān)鍵的執(zhí)行分子。Caspase-3能分解底物DEVD-AFC釋放AFC，DEVD-AFC發(fā)藍(lán)光，游離的AFC發(fā)出黃綠熒光，用酶標(biāo)儀測(cè)定AFC的熒光值就可以檢測(cè)Caspase-3活力。PC12細(xì)胞經(jīng)實(shí)驗(yàn)處理后，胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，用50 μL的冷細(xì)胞裂解液重懸細(xì)胞，冰上孵育10 min，經(jīng)蛋白濃度測(cè)定后使用50 μg的細(xì)胞裂解物。每個(gè)樣品加入50 μL的2×反應(yīng)緩沖液（含10 mmol·L－1DTT），加入5 μL 的DEVD-7-amino-4-trifluorom-ethylcoumarin（終濃度為50 μmol·L－1），37℃孵育2 h。酶標(biāo)儀讀取樣品熒光值，激發(fā)波長(zhǎng)為400 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為505 nm。

2.7 細(xì)胞內(nèi)總ROS檢測(cè) 細(xì)胞內(nèi)總ROS水平用總ROS檢測(cè)試劑盒測(cè)定。PC12細(xì)胞經(jīng)實(shí)驗(yàn)處理后，胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，1×washing buffer洗1遍，加入carboxy-H2DCFDA（終濃度25μmol·L－1）溶液，37℃避光孵育30 min，用高內(nèi)涵儀器檢測(cè)熒光值。

2.8 氧化應(yīng)激水平檢測(cè) 收集PC12細(xì)胞培養(yǎng)上清液，使用南京建成試劑盒檢測(cè)PC12細(xì)胞MDA含量。胰蛋白酶消化收集PC12細(xì)胞，反復(fù)凍融裂解細(xì)胞。4℃，3 000 r·min－1離心10 min取上清，使用南京建成試劑盒測(cè)定抗氧化酶SOD、CAT和GSH-Px活力。

2.9 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 胰蛋白酶消化收集PC12細(xì)胞，加入含有蛋白酶抑制劑，磷酸酶抑制劑和PMSF的組織蛋白抽提試劑，冰上裂解30 min。放入預(yù)冷的離心機(jī)離心，12 000 r·min－1離心15 min。吸取上清液至預(yù)冷的EP管中，－80℃保存待用。BCA試劑盒定量樣品蛋白濃度。將SDS-PAGE上樣緩沖液與蛋白樣品按1∶4混勻，煮沸5 min，使蛋白充分變性，－80℃保存待用。取等量蛋白樣品經(jīng)10％SDS-PAGE，80V電泳至溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠底部。將膠安裝至轉(zhuǎn)膜裝置，100 V，300 mA轉(zhuǎn)膜1 h。取NC膜置于5％脫脂牛奶（TBST配制）搖床封閉2 h。一抗4℃孵育過(guò)夜。TBST洗膜3次，每次15 min，HRP標(biāo)記的二抗孵育2 h。TBST洗膜3次，每次15 min，用增強(qiáng)型ECL顯色液避光孵育5 min后，凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行顯影拍照。

3 結(jié)果

3.1 三七總皂苷能夠抑制Aβ25－35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞的細(xì)胞活力下降 Aβ25－35處理能夠以濃度和時(shí)間依賴的方式降低PC12細(xì)胞的細(xì)胞活力（Fig 1A，P ＜0.01），最終選擇20 μmol·L－1，作用24 h作為造模條件。不同濃度的三七總皂苷（6.25、12.5、25和50 mg·L－1）預(yù)孵育4、8、12和24 h能夠以濃度和時(shí)間依賴的方式抑制Aβ25－35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞的細(xì)胞活力下降（Fig 1B，P＜0.01），最終確定三七總皂苷給藥濃度為25 mg·L－1，作用時(shí)間為24 h。而且，三七總皂苷預(yù)孵育能夠抑制Aβ25－35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞LDH漏出（Fig 1C，P＜0.01）。然而，三七總皂苷只加藥對(duì)PC12細(xì)胞活力沒(méi)有影響（Fig 1D，P＞0.05）。表明三七總皂苷預(yù)孵育能夠明顯抑制Aβ25－35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞的細(xì)胞活力下降。

Fig 1 Effect of PNS on cell viability of PC12cells

3.2 三七總皂苷能夠明顯抑制Aβ25－35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞的凋亡 與對(duì)照組比較，Aβ25－35處理明顯增加TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)目（Fig 2A）和TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞率（Fig 2B，P＜0.01）。表明Aβ25－35處理能夠?qū)е翽C12細(xì)胞DNA斷裂。三七總皂苷預(yù)孵育能夠明顯抑制Aβ25－35導(dǎo)致的DNA斷裂（Fig 2）。我們進(jìn)一步考察了線粒體膜電位的變化，Aβ25－35能夠明顯降低線粒體膜電位（Fig 2C、D，P＜0.01）。與對(duì)照組相比，Aβ25－35組的熒光值降低至80％，而PNS＋Aβ25－35組的熒光值則為95％。表明Aβ25－35能夠使PC12細(xì)胞線粒體膜電位去極化。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)Aβ25－35能夠增強(qiáng)caspase-3活性（Fig 2E，P＜0.01）。與對(duì)照組相比，Aβ25－35組的熒光值增加至156.29％，而PNS＋Aβ25－35組的熒光值則為122.88％，三七總皂苷預(yù)孵育能夠明顯抑制Aβ25－35誘導(dǎo)的線粒體膜電位的下降和caspase-3活性的增強(qiáng)（Fig 2C～E，P＜0.01），表明三七總皂苷能夠明顯抑制Aβ25－35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞的凋亡。

3.3 三七總皂苷預(yù)孵育能夠明顯抑制Aβ25－35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激 與對(duì)照組比較，Aβ25－35處理導(dǎo)致PC12細(xì)胞內(nèi)ROS濃度明顯增加（Fig 3A、B，P ＜0.01）。與對(duì)照組ROS熒光值相比，Aβ25－35組的熒光值增加至165.23％，PNS＋Aβ25－35組則為119.15％，脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA也明顯增加（Fig 3C，P＜0.01）。而且，細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶SOD、CAT和 GSH-Px活力明顯下降（Fig 4D-4F，P＜0.01）。然而，三七總皂苷預(yù)孵育能夠明顯抑制Aβ25－35誘導(dǎo)的這些氧化應(yīng)激指標(biāo)的變化。提示三七總皂苷預(yù)孵育能夠明顯抑制Aβ25－35誘導(dǎo)C12細(xì)胞氧化應(yīng)激。

Fig 2 Effect of PNS on Aβ25－35induced apoptosis in PC12 cells

3.4 三七總皂苷預(yù)孵育能夠上調(diào)PC12細(xì)胞Nrf2 和HO-1的表達(dá) 為探討三七總皂苷的神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用機(jī)制，我們重點(diǎn)考察了三七總皂苷對(duì)PC12細(xì)胞Nrf2/HO-1信號(hào)通路的影響。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，三七總皂苷預(yù)孵育能夠明顯增加PC12細(xì)胞核內(nèi)Nrf2的蛋白表達(dá)水平（Fig 4A）。同時(shí)，三七總皂苷預(yù)孵育能夠明顯增加PC12細(xì)胞質(zhì)中HO-1的蛋白表達(dá)水平（Fig 4A）。我們進(jìn)一步采用HO-1活性抑制劑SnPP預(yù)孵育PC12細(xì)胞，觀察SnPP對(duì)三七總皂苷介導(dǎo)的抗凋亡作用的影響，發(fā)現(xiàn)SnPP能夠抑制三七總皂苷介導(dǎo)的抗Aβ25－35毒性作用（Fig 4B）。與對(duì)照組相比，PNS＋Control組的蛋白濃度為升高到198.24％，PNS＋Aβ25－35組的蛋白濃度升高至188.13％，而PNS＋Aβ25－35＋SnPP組的則為135.50％。提示HO-1在三七總皂苷介導(dǎo)的抗Aβ25－35毒性作用中發(fā)揮重要作用。

Fig 3 Effect of PNS on Aβ25－35induced oxidative stress in PC12 cells

4 討論

盡管AD的發(fā)病機(jī)制目前尚未完全清楚，但是Aβ被廣泛認(rèn)為是AD神經(jīng)退行性病變的主要原因。如果使用藥物抑制Aβ的神經(jīng)毒性，可能具有神經(jīng)保護(hù)作用。此次實(shí)驗(yàn)我們采用了一種普遍接受的體外模型，使用Aβ25－35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡來(lái)考察三七總皂苷防治AD的神經(jīng)保護(hù)作用。我們發(fā)現(xiàn)三七總皂苷能夠明顯抑制Aβ25－35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞活力的下降和LDH漏出，抑制Aβ25－35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞DNA斷裂，并明顯抑制Aβ25－35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞線粒體膜電位的下降和caspase-3活化，表明三七總皂苷能夠明顯抑制Aβ25－35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡。

Fig 4 Effect of PNS on expression of Nrf2 and HO-1 in PC12 cells

研究表明，氧化應(yīng)激介導(dǎo)了Aβ的神經(jīng)毒性并參與了AD神經(jīng)細(xì)胞退行性過(guò)程。氧化應(yīng)激是指活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生與機(jī)體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)的清除之間失衡，其中大量ROS的產(chǎn)生超過(guò)了內(nèi)源性抗氧化酶系統(tǒng)的抗氧化能力。氧化應(yīng)激能夠?qū)е轮|(zhì)過(guò)氧化，蛋白和DNA氧化和氧化還原狀態(tài)的改變，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡［7］。我們發(fā)現(xiàn)Aβ能夠誘導(dǎo)PC12細(xì)胞內(nèi)ROS積聚，MDA的產(chǎn)生，降低SOD、CAT和GSH-Px活力。三七總皂苷能夠抑制Aβ25－35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激。

我們進(jìn)一步考察了三七總皂苷抑制Aβ25－35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激的分子機(jī)制。機(jī)體在抗氧化應(yīng)激過(guò)程中產(chǎn)生了很多防御性機(jī)制，其中Nrf2/ARE信號(hào)通路的活化是重要環(huán)節(jié)。我們發(fā)現(xiàn)三七總皂苷明顯增加細(xì)胞核內(nèi)Nrf2蛋白表達(dá)水平，并明顯上調(diào)HO-1的蛋白表達(dá)。而且，HO-1活力抑制劑SnPP預(yù)孵育則能抑制三七總皂苷介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用。這些結(jié)果表明，三七總皂苷可能是通過(guò)活化Nrf2/ARE/HO-1信號(hào)通路，發(fā)揮神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用。但是，Nrf2從Keap1-Nrf2復(fù)合體中釋放的分子機(jī)制，需要后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行確證。

綜上所述，三七總皂苷能夠抑制Aβ25－35誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡，其作用機(jī)制可能是活化Nrf2/ARE信號(hào)通路，上調(diào)抗氧化酶HO-1的表達(dá)，但仍需進(jìn)行體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證三七總皂苷抗AD的藥效以及藥效作用機(jī)制。

〔致謝：本研究所有實(shí)驗(yàn)均在中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院、北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所中藥（天然產(chǎn)物）創(chuàng)新藥物研發(fā)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。感謝汪夢(mèng)霞同學(xué)及實(shí)驗(yàn)室同學(xué)對(duì)實(shí)驗(yàn)的幫助，以及孫桂波老師、孫曉波老師、趙自明老師和孟祥寶老師對(duì)本研究及文章的指導(dǎo)?！?/p>

［1］ Pachalska M，Bidzan L，Bidzan M，et al.Vascular factors and cognitive dysfunction in alzheimer disease［J］.Med Sci Monit，2015，21：3483－9.

［2］ 張 穎，林森相，華 茜，等.三七和梔子有效成分對(duì)AD轉(zhuǎn)基因小鼠早期腦內(nèi)淀粉樣蛋白清除作用的研究［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2012，28（2）：173－9.

［2］ Zhang Y，Lin S X，Hua X，et al.Research on the mechanism of the active ingredients of Sanchi and Gardenia removing the early amyloid in the AD transgenic mouse brain［J］.Chin Pharmacol Bull，2012，28（2）：173－9.

［3］ Serrano-Pozo A，Hyman B T.Alzheimer disease：Alzheimer de-mentia with sparse amyloid-AD mimic or variant［J］？.Nat Rev Neurol，2015.

［4］ Grimm A，F(xiàn)riedland K，Eckert A.Mitochondrial dysfunction：the missing link between aging and sporadic Alzheimer＇s disease［J］.Biogerontology，2015［Epub ahead of print］

［5］ Johnson D A，Johnson J A.Nrf2-a therapeutic target for the treat-ment of neurodegenerative diseases［J］.Free Radic Biol Med，2015，88（Pt B）：253－67.

［6］ Zhang G L，Deng J P，Wang B H，et al.Gypenosides improve cognitive impairment induced by chronic cerebral hypoperfusion in rats by suppressing oxidative stress and astrocytic activation［J］.Behav Pharmacol，2011，22（7）：633－44.

［7］ Mohsenzadegan M，Mirshafiey A.The immunopathogenic role of reactive oxygen species in Alzheimer disease［J］.Iran J Allergy Asthma Immunol，2012，11（3）：203－16.

Protective effect of Panax Notoginseng Saponins of Nrf2 signaling pathway on apoptosis of PC12 cells induced by Aβ25－35

ZHAO Jing-yu1，2，WANG Meng-xia1，2，ZHAO Zi-ming2，MENG Xiang-bao3，SUN Gui-bo3，SUN Xiao-bo3
（1.Guangdong Second Traditional Chinese Medicine Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510405，China；2.Guangdong Province Municipal Institute of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou 510095，China；3.Institute of Medicinal Plant Development，Chinese Academy of Medical Sciences＆Peking Union Medical College；Key Laboratory of Bioactive Substances and Resources Utilization of Chinese Herbal Medicine，Bejing 100193，China）

Aim To investigate the protective effect of Panax Notoginseng Saponins（PNS）on Aβ25－35-in-duced apoptosis in PC12 cells and molecular mecha-nism.Methods The cell viability of PC12 cells was detected by MTT assay.The levels of LDH leakage，ROS，MDA，Caspase-3 activity and antioxidant enzyme activities of SOD，CAT，and GSH-Px activity were de-termined by respective kits.The apoptosis of cells was decteced by Western blot.Results PNS could signifi-cantly inhibit the decrease of cell viability and LDH leakage，reduce the production of MDA and ROS（P＜ 0.01），increase the activity of SOD，CAT and GSH-Px （P＜0.01），and the mitochondrial membrane poten-tial，inhibit the activation of caspase-3（P＜0.01）in PC12 cells which were induced by Aβ25－35.PNS could incrase nuclear Nrf2 and up-regulate HO-1.The neu-roprotective of PNS could be inhibited by HO-1 inhibi-tor ZnPP.Conclusion PNS may inhibit Aβ25－35-in-duced oxidative stress and apoptosis in PC12 cells by activating Nrf2/HO-1 signaling pathway.

Alzheimer’s disease；panax notoginseng saponins；oxidative stress；apoptosis；Nrf2；HO-1

時(shí)間：2016－2－26 10：20 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160226.1020.020.html

10.3969/j.issn.1001－1978.2016.03.010

A

1001－1978（2016）03－0343－07

R284.1；R329.25；R349.1；R745.7；R977.6

2015－11－26，

2015－12－30

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No 81503290）；中醫(yī)藥行業(yè)科研專項(xiàng)（No 201507004）；國(guó)家重大創(chuàng)新藥創(chuàng)制專項(xiàng)（No 2012ZX09501001-004）

趙靜宇（1991－），女，碩士生，研究方向：中藥藥理學(xué)，E-mail：zhaojingyu1991＠126.com；孫桂波（1973－），女，博士，研究員，研究方向：中藥藥理學(xué)，E-mail：sunguibo＠126.com；孫曉波（1958－），男，博士，研究員，研究方向：中藥藥理學(xué)，Tel/Fax：010-57833013，E-mail：xbsun＠implad.ac.cn