張兆旭，王德生

（1.山東省千佛山醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，山東濟(jì)南 250000；2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，黑龍江哈爾濱 150001）

復(fù)智散通過(guò)細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶5通路減輕皮層神經(jīng)元Tau蛋白過(guò)度磷酸化

張兆旭1，王德生2

（1.山東省千佛山醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，山東濟(jì)南 250000；2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，黑龍江哈爾濱 150001）

目的 探討復(fù)方中藥復(fù)智散（FZS）能否通過(guò)抑制細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶5（CDK5）通路，減輕Aβ25－351誘導(dǎo)的新生鼠皮層神經(jīng)元Tau蛋白過(guò)度磷酸化。方法 選用24 h內(nèi)新生Wistar大鼠，分離純化皮層神經(jīng)元，進(jìn)行體外培養(yǎng)。皮層神經(jīng)元在體外培養(yǎng)7 d后，應(yīng)用20 μmol·L－1Aβ25－351作用于皮層神經(jīng)元24 h。藥物治療組則應(yīng)用FZS（20 mg· L－1）、CDK5抑制劑Roscovitine（15 μmol·L－1）、鈣蛋白酶（calpain）制劑Calpeptin（20 μmol·L－1）預(yù)處理24 h，然后用20 μmol·L－1Aβ25－351作用24 h。用Western blot檢測(cè)Tau蛋白Ser396、Ser202和Thr231位點(diǎn)磷酸化水平和CDK5的激活蛋白p25/p35的蛋白水平；熒光酶標(biāo)儀測(cè)定熒光強(qiáng)度來(lái)反映calpain活性；免疫沉淀法檢測(cè)CDK5激酶活性。結(jié)果 20 μmol·L－1Aβ25－351作用于皮層神經(jīng)元24 h后，Tau蛋白在Ser396、Ser202、Thr231位點(diǎn)磷酸化水平增加，CDK5激酶活性升高，CDK5激活蛋白p25水平升高，calpain活性升高。20 mg·L－1FZS治療組則明顯抑制了Aβ25－351導(dǎo)致的Tau蛋白在Ser396、Ser202、Thr231位點(diǎn)磷酸化水平增加，抑制了CDK5激酶活性、p25蛋白水平以及calpain活性升高。CDK5抑制劑roscovitine和calpain抑制劑calpeptin作為陽(yáng)性對(duì)照藥物也顯示了抑制Tau蛋白過(guò)度磷酸化的作用。結(jié)論 復(fù)智散可能通過(guò)calpain-p25/CDK5通路抑制Aβ25－351導(dǎo)致的皮層神經(jīng)元Tau蛋白過(guò)度磷酸化。

阿爾茨海默??；CDK5；Tau蛋白；復(fù)智散；鈣蛋白酶；p25

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD），是老年期癡呆最常見的類型，神經(jīng)細(xì)胞外β-淀粉樣蛋白（Aβ）異常沉積引發(fā)的老年斑（SPs）和神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Tau蛋白過(guò)度磷酸化形成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)（NFTs）是其特征性病理學(xué)變化［1］。盡管Aβ和Tau蛋白的關(guān)系尚未完全明確，但越來(lái)越多的證據(jù)表明，不論在體內(nèi)還是在體外實(shí)驗(yàn)，Aβ均可引起的Tau蛋白過(guò)度磷酸化，引起神經(jīng)元微管崩解、軸漿運(yùn)輸障礙，最終導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡，因此Aβ引起的Tau蛋白過(guò)度磷酸化被普遍認(rèn)為是AD的重要的發(fā)病機(jī)制之一［2］。Aβ可以激活各種蛋白激酶引起Tau蛋白磷酸化，CDK5是最重要的Tau蛋白激酶之一。p35是CDK5神經(jīng)專一性的激活亞基，在鈣依賴性calpain剪切作用下，轉(zhuǎn)變?yōu)閜25，使CDK5過(guò)度激活，從而導(dǎo)致Tau蛋白過(guò)度磷酸化［3］。

復(fù)方中藥復(fù)智散（FZS）是用于治療老年性癡呆多年，臨床及實(shí)驗(yàn)室研究證明，F(xiàn)ZS治療AD有效；FZS可改善老齡鼠的水迷宮試驗(yàn)，增加癡呆模型鼠腦內(nèi)乙酰膽堿含量［4］；FZS對(duì)抗Aβ毒性，提高體外神經(jīng)細(xì)胞細(xì)胞存活率［5］；FZS治療AD患者可改善認(rèn)知功能，提高生活能力，PET證實(shí)增加患者腦內(nèi)糖代謝［6－7］。但FZS對(duì)Tau蛋白磷酸化的作用尚不清楚。本研究運(yùn)用凝聚態(tài)Aβ25－35建立皮層神經(jīng)元Tau蛋白過(guò)度磷酸化的細(xì)胞模型，探討FZS能否通過(guò)calpain-CDK5通路抑制Tau蛋白過(guò)度磷酸化，為FZS治療AD提供更新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 新生24 h內(nèi)Wistar大鼠（清潔級(jí)），由山東大學(xué)動(dòng)物中心提供。

1.2 試劑 FZS中藥合劑由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院神經(jīng)科王德生教授組方，由人參、當(dāng)歸、黃芩、節(jié)菖蒲按比例（2∶1∶1∶1）組成，原料購(gòu)自哈爾濱市藥材公司，加工為粉劑后文火煎制30 min，3 000 r·min－1離心10 min，吸取上清，留取上清過(guò)濾配成濃度為0.5 g·mL－1的貯存液，0.15 kPa壓力滅菌30 min，分裝，4℃保存2周或－20℃凍存。實(shí)驗(yàn)中給藥劑量以水提液中所含生藥的量計(jì)算。胎牛血清購(gòu)自杭州江濱生物技術(shù)有限公司。Neuro-basal培養(yǎng)基購(gòu)Invitrogene公司。Aβ25－35淀粉樣肽片段購(gòu)Sigma公司，多克隆抗體Tau（Ser396）、Tau （Ser202）、Tau（Thr231）、p35/25（C-19）、CDK5（C-8）購(gòu)置Santa Cruz公司。Western blot化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒購(gòu)自KPL公司。

1.3 皮層神經(jīng)元原代培養(yǎng) 在無(wú)菌條件下取出胎鼠，解剖分離大腦皮層，分散細(xì)胞，將神經(jīng)細(xì)胞以5 ×104每孔的密度接種于涂有左旋多聚賴氨酸的96孔板中，以2×105每孔的密度種植于24孔板中（孔板中放置12 mm的載玻片），細(xì)胞接種后，將孔板置于5％的CO2、37℃、飽和濕度培養(yǎng)箱中過(guò)夜，24 h后更換培養(yǎng)基，將種植液（Neurobasal培養(yǎng)基約88.5％，胎牛血清10％，谷氨酰胺儲(chǔ)備液1％，青鏈霉素儲(chǔ)備液0.5％）更換為飼養(yǎng)液（Neurobasal培養(yǎng)基約95.5％，N-21％，B-27 2％，谷氨酰胺儲(chǔ)備液1％，青鏈霉素儲(chǔ)備液0.5％）。以后每48 h半量換液一次。皮層神經(jīng)元在體外培養(yǎng)7 d后，應(yīng)用FZS （20 mg·L－1）、Roscovitine（15 μmol·L－1）或Cal-peptin（20 μmol·L－1）預(yù)處理24 h，然后用20 μmol ·L－1Aβ作用24 h。

1.4 Western blot分析 將種植于24孔的神經(jīng)元進(jìn)行各種干預(yù)后，吸盡培養(yǎng)基，PBS沖洗，冷胰酶裂解20 min，用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞刮下，離心（2 000 r· min－15 min），吸上清液至EP管中，Bradford法進(jìn)行蛋白定量。以10％SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，用半干電轉(zhuǎn)移法將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜，室溫下用封閉液封閉1 h后，將膜移入用封閉液稀釋的一抗Tau［pSer396］，Tau［pSer202］，Tau［pThr231］，p35多克隆抗體和Tau-5單克隆抗體（1∶10 000稀釋），4℃孵育過(guò)夜，辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的二抗（1 ∶1 000稀釋）反應(yīng)2 h，用化學(xué)發(fā)光法顯色，X線底片曝光，β-actin作為內(nèi)參照，凝膠圖像分析儀（Al-pha Imager 2200，美國(guó)安萊公司）計(jì)算點(diǎn)密度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 CDK5激酶活性測(cè)定 體外培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元經(jīng)各種干預(yù)后，吸盡培養(yǎng)基，裂解蛋白，取蛋白200 μg，用CDK5抗體10 μg，加入細(xì)胞溶解緩沖液中（50 mmol·L－1Tris-HCl，pH 7.4，80 mmol·L－1b-glycerophosphate，20 mmol·L－1EGTA，15 mmol· L－1MgCl2，and 1 mmol·L－1dithiothreitol），在4℃環(huán)境下孵育1 h。所產(chǎn)生的免疫復(fù)合物用Asephar-sose沉降法收集，收集到的免疫復(fù)合物用清洗緩沖液清洗，然后，將該免疫復(fù)合物用CDK5激酶緩沖液包括50 μmol·L－1ATP，1.25 μCi-γ32 ATP，和500 μmol·L－1histone H1作為底物在室溫下孵育20 min，最后用液體閃光計(jì)數(shù)器測(cè)定。

1.6 calpain活性測(cè)定 取蛋白20 μg放入96孔板中，每孔加入130 μmol·L－1calpain底物N-suc-ciny lleu-tyr-7-amido-4-methylcoumarin，在室溫下孵育30 min。N-succinyl-leu-tyr-7-amido-4-methylcoum-arin（calpain底物）本身是非熒光性的，其被calpain （Calpain）裂解后能發(fā)出熒光。應(yīng)用酶標(biāo)儀（550 Bio-Rad）檢測(cè)熒光，激發(fā)波長(zhǎng)為360 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為480 nm，檢測(cè)數(shù)值間接反映calpain的活性。

2 結(jié)果

2.1 FZS抑制Aβ25－35導(dǎo)致的皮層神經(jīng)元Tau蛋白過(guò)度磷酸化 為探討FZS對(duì)皮層神經(jīng)元Tau蛋白磷酸化作用，應(yīng)用能夠分別識(shí)別Ser396、Ser202、Thr231這3個(gè)位點(diǎn)的磷酸化抗體，Western blot檢測(cè)磷酸化Tau蛋白的表達(dá)情況。如Fig 1顯示，20 μmol·L－1Aβ25－35作用于皮層神經(jīng)元24 h，3個(gè)不同位點(diǎn)（Ser396、Ser202、Thr231）的Tau磷酸化均明顯增加。然而，應(yīng)用20 mg·L－1FZS預(yù)處理皮層神經(jīng)元24 h明顯緩解Aβ25－35導(dǎo)致的Tau磷酸化作用。CDK5抑制（roscovitine）和calpain抑制劑（calpetin）也有類似的作用，緩解了Aβ25－35導(dǎo)致的Tau磷酸化。

Fig 1 FZS prevents Aβ25－35-induced Tau phosphorylation

2.2 FZS抑制Aβ25－35導(dǎo)致的CDK5激酶過(guò)度激活為了探討Aβ25－35和FZS對(duì)CDK5激酶活性的作用，治療組皮層神經(jīng)元應(yīng)用20 mg·L－1FZS預(yù)處理24 h后，再應(yīng)用20 μmol·L－1Aβ25－35作用24 h。CDK5激酶活性采用CDK5抗體、免疫沉淀法，應(yīng)用液體閃爍計(jì)數(shù)儀檢測(cè)。和未處理組皮層神經(jīng)元比較，20 μmol·L－1Aβ25－35處理組神經(jīng)元CDK5激酶活性升高了近3倍；20 mg·L－1FZS治療則明顯抑制了Aβ25－35導(dǎo)致的CDK5激酶活性升高（P＜0.01），見Fig 2。由此可見，F(xiàn)ZS抑制了Aβ25－35導(dǎo)致的CDK5激酶過(guò)度激活，但對(duì)CDK5激酶本身的生理活性沒(méi)有影響。

Fig 2 FZS blocks Aβ25－35-induced CDK5 activation

2.3 FZS抑制Aβ25－35導(dǎo)致的p35向p25轉(zhuǎn)變p35是CDK5生理性的激活亞基，在calpain作用下，p35降解、轉(zhuǎn)變?yōu)閜25能使CDK5過(guò)度激活，從而導(dǎo)致神經(jīng)元變性、凋亡［3］。以往研究發(fā)現(xiàn)Aβ暴露能夠使皮層神經(jīng)元的p35轉(zhuǎn)變?yōu)閜25［8］。本研究為探討FZS及Aβ25－35對(duì)皮層神經(jīng)元p35或p25是否有影響，應(yīng)用Western blot，p35/p25抗體檢測(cè)p35、p25蛋白表達(dá)情況。20 μmol·L－1Aβ25－35處理皮層神經(jīng)元24 h后，p35蛋白水平明顯降低，而p25蛋白水平明顯增高；20 mg·L－1FZS則抑制Aβ25－35導(dǎo)致的p35向p25轉(zhuǎn)變，見Fig 3。結(jié)合上述結(jié)果，可以推斷FZS對(duì)CDK5激酶活性的抑制可能是通過(guò)抑制Aβ25－35導(dǎo)致的p35向p25轉(zhuǎn)變而實(shí)現(xiàn)的。

Fig 3 FZS prevents Aβ25－35-induced conversion of p35 to p25

2.4 FZS抑制Aβ25－35導(dǎo)致的calpain激活 p35降解、轉(zhuǎn)變?yōu)閜25是由calpain激活介導(dǎo)的。因此，我們進(jìn)一步探討了FZS和Aβ25－35對(duì)calpain活性的作用。經(jīng)過(guò)7 d成熟期的神經(jīng)元經(jīng)藥物干預(yù)后，裂解、提取細(xì)胞蛋白，calpain活性的活性應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測(cè)。皮層神經(jīng)元經(jīng)20 μmol·L－1Aβ25－35處理24 h后，calpain活性明顯增高（P＜0.01），20 mg·L－1FZS預(yù)處理皮層神經(jīng)元24 h則明顯抑制Aβ25－35導(dǎo)致的calpain激活，見Fig 4。

3 討論

NFTs是AD的特征性病理改變之一，而NFTs的主要成分是過(guò)度磷酸化的微管相關(guān)tau蛋白。Tau蛋白磷酸化，可以引起微管崩解，軸漿運(yùn)輸障礙，最終導(dǎo)致神經(jīng)元死亡［2］。在APP（淀粉樣前體蛋白）轉(zhuǎn)基因鼠的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)［9］，抑制內(nèi)源性Tau蛋白可以緩解Aβ引起的認(rèn)知功能損害，因此，有學(xué)者認(rèn)為，Aβ的神經(jīng)毒性是通過(guò)Tau蛋白磷酸化來(lái)實(shí)現(xiàn)的，Aβ引起的Tau蛋白磷酸化可能是AD的重要發(fā)病機(jī)制之一。

Fig 4 FZS prevents Aβ25－35-induced calpain activation

越來(lái)越大的研究證明，Aβ可以在多個(gè)AD發(fā)病相關(guān)的磷酸化位點(diǎn)導(dǎo)致Tau蛋白磷酸化。Tau蛋白的磷酸化位點(diǎn)很多，研究表明［10］Ser396、Ser202、Thr231這3個(gè)位點(diǎn)磷酸化可導(dǎo)致NFTs，中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性，被認(rèn)為和AD的發(fā)病相關(guān)。和以往研究相似，20 μmol·L－1Aβ25－35作用于皮層神經(jīng)元24 h，明顯增加了這3個(gè)位點(diǎn)（Ser396、Ser202、Thr231）的Tau蛋白磷酸化。

CDK5是最重要的Tau蛋白激酶之一，其活性受神經(jīng)專一性的激活亞基p35調(diào)節(jié)。生理狀態(tài)下，CDK5在p35調(diào)節(jié)亞基的信號(hào)作用下錨定于膜上，在神經(jīng)元發(fā)育、遷移、神經(jīng)元存活中發(fā)揮重要作用［2，8］。Aβ暴露或各種應(yīng)激損害，可導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)鈣超載，從而激活calpain。calpain使p35裂解為p25片段，p25十分穩(wěn)定，不容易降解，為CDK5更穩(wěn)定的激活亞基，與CDK5結(jié)合導(dǎo)致CDK5持久過(guò)度激活［11］。過(guò)度激活的CDK5導(dǎo)致Tau蛋白過(guò)度磷酸化，從而引起微管崩解，損害軸漿運(yùn)輸，導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡。AD患者腦內(nèi)p25表達(dá)水平明顯增加，CDK5活性明顯升高［12］。在體外培養(yǎng)的神經(jīng)元中［13］，抑制CDK5或calpain活性均明顯緩解Aβ導(dǎo)致的Tau蛋白磷酸化及神經(jīng)元的凋亡，這與本研究結(jié)果是一致的，CDK5抑制劑Roscovitine（15 μmol ·L－1）和calpain制劑Calpeptin（20 μmol·L－1）均明顯抑制了Aβ25－35導(dǎo)致的Tau蛋白磷酸化。在動(dòng)物試驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)CDK5抑制劑緩解了Aβ導(dǎo)致的Tau蛋白磷酸化，提高了AD模型鼠的認(rèn)知功能。p25轉(zhuǎn)基因鼠的大腦皮層中CDK5活性明顯升高，并出現(xiàn)Tau蛋白過(guò)度磷酸化，神經(jīng)原纖維纏結(jié)形成，神經(jīng)元的變性與凋亡，且伴隨明顯認(rèn)知功能障礙［14］。

研究認(rèn)為［11］，p25/CDK5導(dǎo)致了Tau蛋白過(guò)度磷酸化，因此抑制p35/CDK5向p25/CDK5轉(zhuǎn)變對(duì)緩解Tau蛋白過(guò)度磷酸化及AD的治療有重要意義。本研究顯示，F(xiàn)ZS能夠有效抑制Aβ25－35導(dǎo)致的calpain激活，從而緩解了p35向p25轉(zhuǎn)變，降低了CDK5激酶活性，從而減輕了Aβ25－35導(dǎo)致的皮層神經(jīng)元Tau蛋白過(guò)度磷酸化。calpain是鈣依賴性的蛋白激酶，細(xì)胞內(nèi)鈣超載是導(dǎo)致其活性過(guò)度增高的主要原因。在以往研究中［5］，應(yīng)用PC12細(xì)胞體外培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)FZS能夠?qū)笰β1－42導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)鈣超載，從而起到神經(jīng)保護(hù)作用。由此可見，抑制細(xì)胞內(nèi)鈣超載、鈣依賴性calpain過(guò)度激活，從而抑制p35 向p25轉(zhuǎn)變，緩解CDK5過(guò)度激活引起的Tau蛋白磷酸化，可能為FZS治療AD的有效機(jī)制之一。

FZS由人參、當(dāng)歸、黃芩等中藥組成，其神經(jīng)保護(hù)作用的有效成分尚不完全清楚。人參是我國(guó)傳統(tǒng)藥物，具有增強(qiáng)記憶、益智延年、強(qiáng)身健體之功效。人參的主要有效成份是人參皂苷，包括Rb1、Rg1、Rg2等。人參皂苷Rgl還可通過(guò)抗氧化應(yīng)激、抗神經(jīng)元凋亡、抑制興奮性氨基酸毒性、減少鈣內(nèi)流等發(fā)揮其對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用［15］。近期，黃天文等［15］應(yīng)用原代皮層神經(jīng)元培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rbl能夠抑制CDK5激酶活性，從而抑制Aβ白導(dǎo)致的Tau蛋白過(guò)度磷酸化，保護(hù)皮層神經(jīng)元。由此可見，人參皂苷可能為FZS神經(jīng)保護(hù)作用的有效成分之一。其它成分如當(dāng)歸、黃芩是否也具有相似的神經(jīng)保護(hù)作用尚不清楚，在以后的研究中還需進(jìn)一步探討。

（致謝：本文實(shí)驗(yàn)是在山東省千佛山中心實(shí)驗(yàn)室完成，特別感謝曹莉莉主任給予的實(shí)驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)和幫助。）

［1］ 紀(jì)超男，胡馨月，郭遠(yuǎn)新，等.米索前列醇對(duì)APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的神經(jīng)保護(hù)作用［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2015，31（3）：334－9.

［1］ Ji C N，Hu X Y，Guo Y X，et al.Protective effect of misoprostol on neurodegeneration in APP/PS1 transgenic mice［J］.Chin Phar-macol Bull，2015（3）：334－9.

［2］ Michaelis M L，Dobrowsky R T，Li G.Tau neurofibrillary pathol-ogy and microtubule stability［J］.J Mol Neurosci，2002，19（3）：289－93.

［3］ Sundaram J R，Poore C P，Sulaimee N H，et al.Specific inhibition of p25/Cdk5 activity by the Cdk5 inhibitory peptide reduces neu-rodegeneration in vivo［J］.J Neurosci，2013，33（1）：334－43.

［4］ 李緒領(lǐng)，王德生，孫曼霽，等.復(fù)智散（FZS）對(duì)Alzheimer｀s dis-ease（AD）模型小鼠治療作用的研究［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2007，23（10）：421－4.

［4］ Li X L，Wang D S，Sun M Q，et al.Effect of Fuzhisan on Alzheim-ers disease model mice［J］.Chin Pharmacol Bull，2007，23 （10）：421－4.

［5］ 溫世榮，王德生，張景艷，等.復(fù)智散對(duì)SH＿SY5Y細(xì)胞生存狀態(tài)的影響［J］.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，37（5）：383－5.

［5］ Wen S R，Wang D S，Zhang J Y，et al.Effect of Fuzhisan on the viability of SH-SY5Y cell［J］.J Harbin Med Univ，2003，37（5）：383－5.

［6］ 剛寶芝，王德生，王春麗，等.復(fù)智散治療老年性癡呆的臨床療效觀察［J］.中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，2005，22（4）：535－7.

［6］ Gang B Z，Wang D S，Wang C L，et al.The efficacy of Fuzhisan in patients with Alzheimer’s disease［J］.J Apoplexy Ner Dis，2005，22（4）：535－7.

［7］ Bi M，Tong S，Zhang Z.Changes in cerebral glucose metabolism in patients with mild-to-moderate Alzheimer’s disease：a pilot study with the Chinese herbal medicine fuzhisan［J］.Neurosci Lett，2011，501（1）：35－40.

［8］ Shukla V，Skuntz S，Pant H C.Deregulated Cdk5 activity is in-volved in inducing Alzheimer＇s disease［J］.Arch Med Res，2012，43（8）：655－62

［9］ Li SQ，Yu Y，Han J Z，et al.Deficiency of macrophage migration inhibitory factor attenuates tau hyperphosphorylation in mouse mod-els of Alzheimer＇s disease［J］.J Neuroinflammation，201，12（1）：177.

［10］Nikkel A L，Martino B，Markosyan S，et al.The novel calpain in-hibitor A－705253 prevents stress-induced tau hyperphosphoryla-tion in vitro and in vivo［J］.Neuropharmacology，2012，63（4）：606－12.

［11］Zhou J，Wang H，F(xiàn)eng Y，et al.Increased expression of cdk5/p25 in N2a cells leads to hyperphosphorylation and impaired axonal transport of neurofilament proteins［J］.Life Sci，2010，86（13－14）：532－7.

［12］Shi L L，Yang W N，Chen X L，et al.The protective effects of tan-shinone IIA on neurotoxicity induced by β-amyloid protein through calpain and the p35/Cdk5 pathway in primary cortical neurons ［J］.Neurochem Int，2012，61（2）：227－35.

［13］Town T，Zolton J，Shaffner R，et al.p35/Cdk5 pathway mediates soluble amyloid-beta peptide-induced tau phosphorylation in vitro ［J］.J Neurosci Res，2002，69（3）：362－72.

［14］Zhao H，Chang R，Che H，et al.Hyperphosphorylation of tau pro-tein by calpain regulation in retina of Alzheimer＇s disease transgen-ic mouse［J］.Neurosci Lett，2013，551：12－6.

［15］黃天文，陳曉春，張 靜，等.鈣蛋白酶－細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶5通路參與β淀粉樣蛋白25－35誘導(dǎo)的tau蛋白過(guò)度磷酸化［J］.中華神經(jīng)科雜志，2006，39（7）：477－80.

［15］Huang T W，Chen X C，Zhang J，et al.Calpain-CDK5 pathway is involved in β-amyloid peptide25－35-induced tau hyperphosphory-lation［J］〗.Chin J Neurol，2006，39（7）：477－80.

Role of Fuzhisan in reducing Tau protein hyperphosphorylation in cortical neurons through a cyclin-dependent kinase 5 pathway

ZHANG Zhao-xu1，WANG De-sheng2
（1.Dept of Neurology，Qianfoshan Hospital of Shandong Province，Jinan 250000，China；2.Dept of Neurology，the First Affliated Hospital，Harbin Medical University，Harbin 150001，China）

Aim Fuzhisan（FZS），a Chinese herbal complex prescription that has been used for the treat-ment of AD for over 15 years，is known to enhance the cognitive ability in AD patients.In this study，to in-vestigate whether FZS reduces Aβ25－35-induced Tau protein hyperphosphorylation in neonatal rat cortical neurons by suppressing the cyclin-dependent kinase 5 （CDK5）pathway.Methods Neonatal Wistar rats born within 24 h were selected to separate and purify their cortical neurons for culture in vitro.After 7-day culture of cortical neurons in vitro，20 μmol·L－1Aβ25－35was used to act on them for 24 h.Medication groups were pretreated with FZS（20 mg·L－1），CDK5 inhibitor roscovitine（15 μmol·L－1）and cal-pain preparation calpeptin（20 μmol·L－1）for 24 h，followed by reaction with 20 μmol·L－1Aβ25－35for 24 h.Tau protein phosphorylation levels at Ser396，Ser202 and Thr231 and the protein level of CDK5 acti-vator proteins p25/p35 were assayed by Western blot.Fluorescence intensity was measured with a fluores- cence microplate reader to reflect calpain activity.CDK5 kinase activity was assayed by immunoprecipita-tion.Results After 20 μmol·L－1Aβ25－35acting on cortical neurons for 24h，there were increments in the following：Tau protein phosphorylation levels at Ser396，Ser202 and Thr231，CDK5 kinase activity，CDK5 activator protein p25 level，and calpain activity.In the 20 mg·L－1FZS treatment group，Aβ25－35was suppressed markedly，resulting in increments in Tau protein phosphorylation levels at Ser396，Ser202 and Thr231，suppression of CDK5 kinase activity and p25 protein level，and elevation in calpain activity.Both CDK5 inhibitor roscovitine and calpain preparation cal-peptin，as positive control drugs，also played a role in suppressing Tau protein hyperphosphorylation.Con-clusion FZS can suppress Aβ25－35-induced Tau pro-tein hyperphosphorylation in cortical neurons through the calpain/CDK5 pathway.

Alzheimer’s Disease；CDK5；Tau protein；Fuzhisan；calpain；p25

時(shí)間：2016－2－26 10：20 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160226.1020.048.html

10.3969/j.issn.1001－1978.2016.03.024

A

1001－1978（2016）03－0422－05

R-332；R282.71；R322.81；R329.28；R745.7；R977.3；R977.6

2015－11－04，

2015－12－21

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No 81303013）

張兆旭（1981－），男，博士，主治醫(yī)師，研究方向：老年性癡呆，E-mail：zhangzhaoxu33＠163.com