陶軼松，吳芮，包建強(qiáng)

(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海，201306)

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酶解法制備甲魚油工藝研究

陶軼松，吳芮，包建強(qiáng)*

(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海，201306)

摘要運(yùn)用酶解法從甲魚四肢根部的脂肪中提取甲魚油，利用單因素實(shí)驗(yàn)與響應(yīng)面結(jié)合的方法，得到優(yōu)化的工藝條件：酶解溫度61 ℃，酶添加量1.25 %、料液比1∶1.5、酶解時(shí)間2.5 h。通過(guò)此方法得到的提取率為76.3%。再利用脫膠、脫酸、脫臭和脫色四步精制方法將甲魚油進(jìn)行精制，并對(duì)其理化指標(biāo)和脂肪酸組成進(jìn)行分析。測(cè)得的精制甲魚油的理化指標(biāo)均符合國(guó)家精制魚油一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，且測(cè)得的脂肪酸共33種，其中不飽和脂肪酸含量高達(dá)78.13%。

關(guān)鍵詞甲魚油；精制；脂肪酸

中華鱉，又名甲魚，是我國(guó)特色水產(chǎn)品，它營(yíng)養(yǎng)豐富，味道鮮美，是傳統(tǒng)食材。隨著20世紀(jì)90年代養(yǎng)殖技術(shù)的成熟，從1995年的1.9萬(wàn)t到2014年的34.12萬(wàn)t[1]，我國(guó)甲魚養(yǎng)殖產(chǎn)量突飛猛進(jìn)。我國(guó)甲魚消費(fèi)市場(chǎng)很大，在宰殺過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生內(nèi)臟、脂肪等廢棄物。這些廢棄物不僅會(huì)污染環(huán)境，同時(shí)也是資源浪費(fèi)，充分利用這些廢棄物成為未來(lái)甲魚開(kāi)發(fā)的一個(gè)熱點(diǎn)。

陸生動(dòng)物脂肪中含有的不飽和脂肪酸遠(yuǎn)比水生動(dòng)物脂肪中要少，TAPIERO等人[2～7]發(fā)現(xiàn)，不飽和脂肪酸具有降低體內(nèi)膽固醇、降低血黏度、軟化血管、增加血液的循環(huán)等功效。現(xiàn)今，提取甲魚油的方法主要有蒸煮法、稀堿法、超臨界CO2萃取法、酶解法等[8-14]。傳統(tǒng)的方法在提取過(guò)程中常常會(huì)破壞一些成分，影響甲魚油的品質(zhì)[15-16]。酶解法是利用蛋白酶對(duì)蛋白質(zhì)的水解，破壞蛋白質(zhì)和脂肪的結(jié)合，從而使油脂釋放出來(lái)。該方法作用條件溫和，產(chǎn)油質(zhì)量高，是提取水產(chǎn)品下腳料中魚油的較好方法[17]。因此，本研究使用酶解法制備甲魚油，優(yōu)化工藝條件，采用精制的方法將提取到的甲魚油進(jìn)行精制，同時(shí)測(cè)定其理化指標(biāo)及脂肪酸組成。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1原料與試劑

原料：甲魚的四肢根部成塊狀的黃色脂肪塊；堿性蛋白酶、中性蛋白酶、肽酶、胰蛋白酶、復(fù)合蛋白酶，上海辛森化學(xué)科技有限公司。

NaCl、NaOH、H3PO4均為分析純級(jí)，14%三氟化硼-甲醇溶液、正己烷均為色譜級(jí)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司提供；37種脂肪酸甲酯混標(biāo)，美國(guó)Supelco?公司提供。

1.1.2儀器與設(shè)備

SHIMADZU AUY220型電子分析天平，IKA? HB 10 數(shù)顯型加熱鍋，DHG-9073BS-III型新苗恒溫鼓風(fēng)干燥箱，DK-S28型精宏水浴鍋，TRACE GC ULTRA氣相色譜儀，LXJ-IIB低速大容量多管離心機(jī)，檢測(cè)器為FID(美國(guó)Thermo Fisher)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1原料前處理

將原料活甲魚進(jìn)行宰殺，取出甲魚身體中的脂肪，切割至2～3 mm的脂肪塊大小，隨后將脂肪塊裝入袋中，儲(chǔ)藏在-50 ℃下備用。

1.2.2酶解法提取甲魚油工藝流程

取出凍結(jié)甲魚脂肪，在4 ℃下解凍，按照料液比1∶1.5 (g∶mL)加水，按中性蛋白酶添加量1.2%、酶解時(shí)間2.5 h、60 ℃下酶解，然后在4 500 r/min、20 min離心，得到上層粗甲魚油。評(píng)判提取效果以甲魚油提取率為依據(jù)。

1.2.3提取率的計(jì)算(公式(1))

(1)

1.2.4蛋白酶的篩選

在料液比為1∶1 (g∶mL)，根據(jù)不同蛋白酶的活性溫度，以酶添加量0.8%分別加入堿性蛋白酶、中性蛋白酶、肽酶、復(fù)合蛋白酶、胰蛋白酶，酶解3 h，評(píng)判提取效果以甲魚油提取率高低為依據(jù)，且同時(shí)進(jìn)行空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)。

1.2.5魚油提取工藝多因素條件優(yōu)化

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面Design-Expert的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)3因素3水平實(shí)驗(yàn)確定酶解法提取甲魚油的最佳工藝條件，響應(yīng)面的實(shí)驗(yàn)因素及水平如表1所示。

表1　因素水平編碼表

1.2.6甲魚油精制工藝

粗甲魚油在70 ℃水浴中加熱，向油中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的H3PO4溶液進(jìn)行脫膠，離心，提取上層魚油；脫膠魚油在80 ℃水浴中加熱，向油中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為9%的NaOH 溶液(濃度為2.25 mol/L)進(jìn)行脫酸，離心，提取上層魚油；脫酸魚油在50 ℃水浴中加熱，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的活性白土，脫色20 min，隨后離心，提取出上層魚油；脫色魚油在90 ℃水浴中加熱，0.09 MPa旋蒸的條件下，旋蒸60 min最終得到精制甲魚油。

1.2.7魚油理化性質(zhì)測(cè)定及脂肪酸組成

酸值(AV)：參照GB/T 5530—2005；過(guò)氧化值(POV)：參照GB/T 5538—2008；碘值：參照GB/T 5532—2008(韋氏法)；皂化價(jià)： 參照GB/T 5534—2008；不皂化物：參照GB/T5535.1—2008(乙醚提取法)；水分及揮發(fā)物含量：參照GB/T 5528—2008；油脂灰分：參照GB/T17375—2008。脂肪酸組成分析：參照GB/T 22223—2008測(cè)定。

2結(jié)果與分析

2.1蛋白酶種類的選取

從圖1可知，空白試驗(yàn)由于未添加酶在所有提取率中是最低的，只有28.78%。在加入蛋白酶之后，甲魚油提取率有明顯的上升。由于不同蛋白酶對(duì)肽鍵的專一性不同，導(dǎo)致蛋白酶的水解能力不同[18],因此提取率也有顯著性差異。其中中性蛋白酶提取率最高，達(dá)到72.37%。所以，選擇中性蛋白酶提取甲魚油。

圖1　不同蛋白酶對(duì)甲魚油提取率的影響Fig.1　Effect of different protease on oil extraction注：字母不同代表不同提取率之間存在顯著性差異(P<0.05)

2.2單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1酶解時(shí)間對(duì)于提取率的影響

在酶添加量為0.8%，酶解溫度60 ℃，料液比1∶1，酶解時(shí)間在0.5，1，1.5，2，2.5和3 h下的情況下，酶解時(shí)間對(duì)提油率的影響，根據(jù)甲魚油提取率確定酶解時(shí)間，結(jié)果如圖2所示。

圖2　酶解時(shí)間對(duì)提取率的影響Fig.2　Effect of time of enzymatic hydrolysis on oil extraction rate

從圖2可知，甲魚油的提取率隨著酶解時(shí)間的增加而增大，提取率的增長(zhǎng)速率隨著酶解時(shí)間的增加而減小。當(dāng)酶解時(shí)間超過(guò)2.5 h時(shí)，提取率開(kāi)始下降，并且甲魚油的品質(zhì)會(huì)隨著酶解時(shí)間的增加而降低，甲魚油暴露在空氣中的時(shí)間越長(zhǎng)，甲魚油中的不飽和脂肪酸會(huì)被氧化的越多，從而影響甲魚油的品質(zhì)。所以，最適合的酶解時(shí)間為2.5 h。

2.2.2酶添加量對(duì)于提取率的影響

在溫度60 ℃，料液比1∶1，酶添加量分別為0.4%，0.8%，1.2%，1.6%，2.0%，酶解2.5 h的情況下，酶添加量對(duì)提取率的影響結(jié)果如圖3所示。

圖3　酶添加量對(duì)提取率的影響Fig.3　Effect of enzyme dosage on oil extraction rate

從圖3可知，隨著酶添加量的增加，甲魚油提取率表現(xiàn)出先上升后下降的特點(diǎn)。當(dāng)酶添加量達(dá)到1.2%，提取率最高，達(dá)到72.99%。當(dāng)酶添加量少的時(shí)候，主要是酶控制反應(yīng)，當(dāng)酶添加量多的時(shí)候主要是底物控制反應(yīng)，當(dāng)酶多的時(shí)候，酶會(huì)相互影響，妨礙酶對(duì)底物的水解作用。李夢(mèng)凡[19]研究酶解法制備羅非魚油時(shí)，隨著酶添加量的增加，魚油提取率也表現(xiàn)出先上升后下降的特點(diǎn)，這與其實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。因此，最適合的酶添加量為1.2%。

2.2.3料液比對(duì)于提取率的影響

在溫度60 ℃，酶添加量1.2%，料液比(g∶mL)分別為1∶0.5，1∶1，1∶1.5，1∶2，1∶2.5，酶解2.5 h的情況下，料液比對(duì)提取率的影響，根據(jù)甲魚油提取率確定酶添加量，結(jié)果如圖4所示。

圖4　料液比對(duì)提取率的影響Fig.4Effect of ratio of tilapia head to water on oil extraction rate

從圖4可知，甲魚油的提取率隨著料液比的增加呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)料液比達(dá)到1∶1.5的時(shí)候，提取率達(dá)到最大為75.24%。當(dāng)在加入少量水的時(shí)候，底物中的酶分子分布不均勻，使底物和酶不能良好的接觸，加水過(guò)多時(shí)，底物和酶分子接觸機(jī)會(huì)降低，也會(huì)影響甲魚油的提取率。因此，適合的料液比為1∶1.5。

2.2.4酶解溫度對(duì)于提取率的影響

在酶添加量1.2%，料液比1∶1.5，酶解溫度分別為45，50，55，60和65 ℃，酶解2.5 h的情況下，酶解溫度對(duì)提取率的影響如圖5所示。

圖5　酶解溫度對(duì)提取率的影響Fig.5　Effect of hydrolysis temperature on extraction yield

從圖5可知，在60 ℃之前，隨著酶解溫度的升高，甲魚油的提取率上升，在60 ℃的時(shí)候，取得最大值為75.72%，在60 ℃之后，甲魚油提取率下降。溫度對(duì)酶促反應(yīng)較復(fù)雜，升溫加速分子運(yùn)動(dòng)，但同時(shí)升溫也會(huì)對(duì)酶的活性、最大反應(yīng)速度及底物產(chǎn)生影響。因此，適合的酶解溫度為60 ℃。

2.3甲魚油提取工藝優(yōu)化

2.3.1響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果

從單因素實(shí)驗(yàn)中得到酶解法提取甲魚油的條件為：酶解時(shí)間2.5 h，酶添加量1.2%，料液比1∶1.5，酶解溫度60 ℃。因?yàn)閺膯我蛩貙?shí)驗(yàn)中獲得酶解時(shí)間在2.5 h以后的甲魚油提取率趨于接近，所以固定酶解時(shí)間2.5 h。因此選擇酶解溫度(A)、酶添加量(B)和料液比(C)3個(gè)因素設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。響應(yīng)面方案設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　響應(yīng)面分析方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)Desingn-expert軟件對(duì)表4中得到的提取率數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元擬合，得到了提取率Y對(duì)A、B、C的二次多元回歸方程:提油率(Y)= 75.72+3.73A+2.46B-0.35C-1.73AB+0.78AC+0.76BC-3.13A2-3.99B2-0.87C2。在方程中各項(xiàng)的系數(shù)的絕對(duì)值大小可以反應(yīng)出各項(xiàng)因數(shù)對(duì)響應(yīng)值的影響程度。各項(xiàng)系數(shù)的正、負(fù)可以反應(yīng)影響的方向，由二次項(xiàng)的系數(shù)為負(fù)可以推斷出方程式所代表的曲線開(kāi)口向下，具有極大值，可以進(jìn)行優(yōu)化分析?；貧w方程的方差分析，如表3所示。

表3　回歸模型系數(shù)檢驗(yàn)

注：“*”為差異顯著(P<0.05)；“**”為差異極顯著(P<0.01)。

通過(guò)對(duì)表3的分析，此模型極顯著(P<0.01)，失擬項(xiàng)不顯著(P>0.05)，說(shuō)明此模型建立成功，可用此模型分析和預(yù)測(cè)甲魚油提取率。RAdj2=0.9439說(shuō)明該模型擬合程度良好，實(shí)驗(yàn)誤差較小，該模型是合理的；變異系數(shù)CV=1.44，CV較低說(shuō)明實(shí)驗(yàn)具有較好的可靠性模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.9755，表示回歸方程中所有自變量的變化可以解釋97.55%因變量的變化，表明回歸方程可以很好地描述考察因子與響應(yīng)值之間的關(guān)系。從表3回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)顯示，酶解溫度的一次項(xiàng)和二次項(xiàng)與酶添加量的一次項(xiàng)和二次項(xiàng)，影響都達(dá)到極顯著水平(P<0.01)；酶解溫度與酶添加量的交互項(xiàng)影響達(dá)到顯著性水平(P<0.05)。由P值可知，各工藝因素對(duì)提取率影響大小依次為：酶添加量>酶解溫度>料液比。同時(shí)根據(jù)回歸方程得到最佳工藝參數(shù)為：酶解溫度61.2 ℃，酶添加量1.24%，料液比1∶1.56，在此條件下的提取率為76.98%。

2.3.2驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

由該模型得到的最佳甲魚油提取工藝參數(shù)為：酶解溫度61.2 ℃，酶添加量1.24%，料液比1∶1.56，在此條件下的提取率為76.98%。從實(shí)際生產(chǎn)角度考慮，確定最佳魚油提取工藝為：酶添加量1.25%，酶解溫度61 ℃，料液比1∶1.5。在此條件下進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)3次，所得到的提取率的平均值為76.3%，相對(duì)誤差0.87%，與預(yù)測(cè)的結(jié)果基本一致。證明此模型能夠很好的模擬并預(yù)測(cè)酶解法提取魚油的得率，進(jìn)一步的證明了此模型的可行性。

2.4甲魚油的精制及理化

按照1.2.6工藝對(duì)甲魚油進(jìn)行精制。并對(duì)其進(jìn)行理化指標(biāo)測(cè)定，結(jié)果如表4所示。

表4　酶解法制備粗甲魚油與精制魚油理化性質(zhì)

從表4中可知，甲魚油在精制之前，其水分及揮發(fā)物，酸值，雜質(zhì)都略高于國(guó)家二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。過(guò)氧化值，碘值，不皂化物都符合國(guó)家一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。

2.5甲魚油的脂肪酸組成

參照GB/T 22223—2008測(cè)定，對(duì)甲魚油脂肪酸組成進(jìn)行分析，結(jié)果如表5所示。

表5　粗甲魚油與精制甲魚油脂肪酸組成

表5為酶解法制備粗甲魚油與精制甲魚油的脂肪酸組成分析，粗甲魚油精制后脂肪酸組成變化不大，總體上單不飽和脂肪酸(MUFA)所占比例最高的是油酸，多不飽和脂肪酸(PUFA)以亞油酸為主，EPA與DHA的總比例均約為9.7%，油酸、EPA等所占脂肪酸比例與韓玉謙[19]、吳惠勤[20]等人測(cè)定比例相似，而DHA、亞油酸含量相對(duì)較高。

精制甲魚油中不飽和脂肪酸UFA(78.13%)含量豐富，其中MUFA占到總量的50.52%，而PUFA占到總量的27.61%。還含有人體必需脂肪酸α-亞麻酸，亞油酸和花生四烯酸。PUFA對(duì)清除自由基，預(yù)防心血管疾病具有一定的功效[21]。

3結(jié)論

(1)通過(guò)對(duì)4種提取魚油的方法進(jìn)行比較可以發(fā)現(xiàn)，因?yàn)槊附夥ū瘸R界CO2萃取法成本低，且比蒸煮法以及稀堿法提油效果好，所以可以作為提取甲魚油的理想方法。

(2)采用單因素結(jié)合響應(yīng)面分析法對(duì)酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到魚油提取率與各因素的二元多項(xiàng)回歸方程：Y(%)=75.72+3.73A+2.46B-0.35C-1.73AB+0.78AC+0.76BC-3.13A2-3.99B2-0.87C2。確定最佳魚油提取工藝條件：酶解溫度61 ℃，酶添加量1.25%、料液比1∶1.5、酶解時(shí)間2.5 h，提取率為76.3%。

(3)粗甲魚油經(jīng)過(guò)精制得到精制甲魚油。精制甲魚油的的理化指標(biāo)全部達(dá)到國(guó)家水產(chǎn)行業(yè)精制魚油一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。精制的甲魚油的脂肪酸組成共鑒定出33種脂肪酸，其中MUFA含量為50.52%,PUFA含量為27.61%，EPA+DHA含量為9.7%。

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Research of Chinese soft-shelled turtle oil by enzymatic hydrolysis

TAO Yi-song，WU Rui，BAO Jian-qiang*

(College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

ABSTRACTChinese soft-shelled turtle oil was extracted from its fat by enzymatic hydrolysis. The optimal conditions were as follows：enzymolysis temperature was 61℃, compound protease dosage was 1.25 %, material-water ratio was 1∶1.5, enzymolysis time was 2.5 h and the extraction rate was 76.3 %. The crude oil was refined through four steps including degumming, deacidification, decoloration and deodorization. The physical and chemical properties and fatty acid compositions of refined oil were analyzed. All of physical and chemical properties were accorded with national standard for refined fish oil at first grade. And thirty-three kinds of fatty acids in refined Chinese soft-shelled turtle oil were identified. The content of unsaturated fatty acids was 78.13 %.

Key wordsChinese soft-shelled turtle oil；refining；fatty acid

收稿日期：2015-09-22，改回日期：2015-11-11

基金項(xiàng)目：上海海洋大學(xué)水產(chǎn)動(dòng)物遺傳育種中心(ZF1206)

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201603032

第一作者：碩士研究生(包建強(qiáng)教授為通信作者，E-mail: baojq@shou.edu.cn)。