陳小林，華清泉

(武漢大學人民醫(yī)院耳鼻咽喉－頭頸外科，湖北武漢　430060)

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自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3在甲狀腺癌合并頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的表達及臨床意義

陳小林，華清泉

(武漢大學人民醫(yī)院耳鼻咽喉－頭頸外科，湖北武漢430060)

【摘要】目的:探究分析與細胞自噬相關(guān)的蛋白Beclin1及LC3在甲狀腺癌合并頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的表達及其在臨床治療中的意義。方法:采用免疫組織化學方法檢測，選取48例我院2012年2月至2014年2月收集的甲狀腺癌組織、30例癌旁正常組織用以檢測Beclin1及LC3蛋白表達，另取38例甲狀腺癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)以及30例的正常淋巴結(jié)臨床標本，用以檢測Beclin1及LC3蛋白表達。結(jié)果:在取材的所有樣本中均有表達Beclin1，但在甲狀腺癌組織中含量低于癌旁正常的甲狀腺組織( P＜0. 01)，轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中Beclin1水平明顯低于正常淋巴結(jié)組( P＜0. 01) ;免疫組化結(jié)果顯示在所有樣本中也檢測到LC3蛋白表達，在甲狀腺癌組織中的含量最低，并且顯著低于癌旁甲狀腺組織( P＜0. 01)，在發(fā)生轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)組織中，LC3含量低于正常淋巴結(jié)組織( P＜0. 01)。結(jié)論:自噬功能相關(guān)蛋白Beclin1與LC3的表達與甲狀腺癌是否發(fā)生轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，是腫瘤向囊外擴展的直接標記。該蛋白具有作為甲狀腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的術(shù)前評估指標的潛在可能，具有一定的指導(dǎo)意義。

【關(guān)鍵詞】甲狀腺癌;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移; Beclin1; LC3

網(wǎng)絡(luò)出版時間: 2016-3-4 10∶16網(wǎng)絡(luò)出版地址: http: / /www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20160304.1016.046.html

甲狀腺癌在人類頭頸部癌癥中最為常見，也是臨床最為常見的惡性腫瘤，易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移類癌癥。其發(fā)病機制目前尚未完全明確，主要認為與輻射、遺傳、飲食等單因素或多因素有關(guān)。目前主要的治療手段以手術(shù)治療并輔助以化療為主。但由于其易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，手術(shù)時機及手術(shù)操作難易把握，造成預(yù)后不佳。細胞自噬是細胞的一種能動過程，這一功能在進化過程中是高度保守的［1－3］。細胞通過自噬泡中的溶酶體等將細胞內(nèi)變性壞死的細胞器與部分胞漿水解，將分解產(chǎn)生的氨基酸及核苷酸等物質(zhì)供細胞再利用。機體細胞通過自噬反應(yīng)而變得更加適應(yīng)微環(huán)境的變化，使細胞生存或者自噬性死亡。細胞自噬過程與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。在腫瘤發(fā)生的早期，細胞自噬可發(fā)揮抑制腫瘤的作用;當腫瘤細胞繼續(xù)進行分裂增殖時，細胞自噬的功能也發(fā)生轉(zhuǎn)變，可促進腫瘤細胞的生長。

Beclin1通過與ClassⅢPI3K形成復(fù)合物后參與自噬體的形成，是調(diào)節(jié)細胞自噬的關(guān)鍵蛋白質(zhì)，也是細胞啟動自噬的標志［4］。Beclin 1等位基因的缺失性突變常發(fā)生于乳腺癌細胞株中，并且在乳腺癌組織中，Beclin1蛋白水平也較周圍正常組織低［5］。這表明Beclin1可能具有抑制腫瘤的作用。LC3在哺乳動物Autophagy的形成中參與泛素樣蛋白加工修飾過程。LC3在細胞內(nèi)有兩種存在形式: LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ［6］。當細胞內(nèi)發(fā)生細胞自噬時，通過檢測細胞內(nèi)的LC3及其向LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)化就可以判斷細胞自噬是被誘導(dǎo)還是被抑制。本次研究通過對甲狀腺癌及其周圍組織中Bclin1及LC3的檢測，探討細胞自噬在甲狀腺癌的形成和轉(zhuǎn)移中的作用。

1　材料與方法

1.1一般資料

實驗中所有標本來自我院2012年2月至2014 年2月間手術(shù)時取材，取材后除在液氮中保存標本外，另外取標本的部分經(jīng)過4%多聚甲醛的固定，再經(jīng)常規(guī)石蠟包埋并做成厚度為4 μm的病理組織學切片，經(jīng)兩位以上的主治和病理醫(yī)生進行病理診斷。樣本中48例甲狀腺癌患者術(shù)后標本，男性25例，女性23例，患者年齡31～73歲，平均年齡( 51. 2± 1. 5)歲; 38例伴有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，其中男性21例，女性17例，平均年齡( 53. 1±0. 9)歲。

1. 2方法

本實驗中所用一抗(兔抗人)均購自美國CST公司，二抗(山羊抗兔)購自碧云天生物技術(shù)公司。S-P免疫組化試劑盒及DAB顯色試劑盒由北京康為世紀生物科技有限公司提供。

首先，將標本切片在60℃條件下孵化10 min，然后置于二甲苯中脫蠟20 min，用濃度逐步降低的乙醇溶液繼續(xù)脫蠟去水10 min。室溫下用0.3%的H2O2抑制內(nèi)源性的過氧化物酶活性20 min。用微波法修復(fù)以提高抗原的暴露程度，采用1.5%正常山羊血清封閉標本的非特異性結(jié)合位點30 min。接著將所有切片用生物素與親和素分別孵化20 min，然后用一抗孵化1 h，二抗孵化30 min。室溫下用Strepta-vidin-HRP處理30 min，此時即可用DAB加H2O2在室溫下顯色10 min，蘇木精染色5 min。陰性對照組為正常的兔血清。

1.3 S-P染色的結(jié)果評估

本次實驗染色結(jié)果由兩位病理科醫(yī)生進行獨立評估，評估方式主要為半定量式。Beclin1與LC3的染色強度可從0～4級判斷:設(shè)置0為陰性結(jié)果，依次有( + )為極低陽性結(jié)果，( + + )為弱陽性結(jié)果，( + + + )為陽性結(jié)果，( + + + + )為最強陽性結(jié)果。分級的依據(jù)為多數(shù)腫瘤細胞的染色強度，同時也要考慮具備同樣染色強度的腫瘤細胞數(shù)的百分比。最后，將得分由染色強度和具有同一染色強度得出的細胞百分百相乘之后為最后得分。評估過程采用單盲法。

1.4統(tǒng)計學分析

本實驗結(jié)果采用統(tǒng)計學軟件SPSS 17. 0進行處理，其中組間對比采用多組等級資料的秩和檢驗，在組間兩兩比較可采用兩組等級資料的秩和檢驗，以P＜0. 05表示具有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1一般資料對比

本實驗中患者臨床分期判斷標準依據(jù)美國癌癥聯(lián)合會的甲狀腺癌分期標準，患者的年齡、性別、腫瘤分期及腫瘤大小等一般資料見表1。

表1　不同組患者的一般資料對比

2.2 Beclin1與LC3表達情況

染色結(jié)果顯示，在30例甲狀腺癌組織中Beclin1陽性表達為2例( 6. 7%)，LC3蛋白在甲狀腺癌組織具有陽性表達為1例( 3. 3%)，兩者在癌旁正常組織表達均為陽性; Beclin1在具有甲狀腺癌轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)的表達為陽性的3例( 10%)，LC3蛋白在具有甲狀腺癌轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)的表達為陽性的1例( 3. 3%)，在正常淋巴結(jié)表達均為陽性，具體見表2。

表2　各組中Beclin1與LC3表達情況( n，%)

3　討論

細胞自噬是一種高度保守的生物行為，它可以對體內(nèi)的大分子物質(zhì)及細胞產(chǎn)生的內(nèi)源性物質(zhì)通過溶酶體途徑進行降解，又可根據(jù)物質(zhì)轉(zhuǎn)運通道的不同再分為微自噬、巨自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬［7］。細胞的自噬行為不但能在細胞新陳代謝過程中發(fā)揮重要作用，而且當細胞受到來自外界環(huán)境的破壞受損時，自噬又是一種自身防御，同時自噬也在腫瘤等多種病理過程中發(fā)揮作用。研究［8］發(fā)現(xiàn)，細胞自噬可以當作細胞的一種自我保護機制，防止細胞受營養(yǎng)過低、化療帶來的輻射等損傷;另外細胞出現(xiàn)過度自噬行為也可使細胞死亡，這一點可用于抑制腫瘤生長。

Beclin1是自噬基因的一種，位于染色體17q21位置，其編碼的蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量為60×103。Beclin1可參與組成PI3K復(fù)合物，并且進一步促進自噬體形成［9］。Beclin1也是一種腫瘤抑制基因，在多種腫瘤中均可發(fā)現(xiàn)Beclin1的等位基因缺失而出現(xiàn)低水平的表達，有研究發(fā)現(xiàn)［10］，Beclin1發(fā)生突變的小鼠可出現(xiàn)較高的患腫瘤概率，并且自噬能力降低。這說明Beclin1具有阻止腫瘤細胞的轉(zhuǎn)化，抑制腫瘤生長的作用。LC3在細胞未出現(xiàn)自噬時，可轉(zhuǎn)化為具有胞質(zhì)可溶性的LC3Ⅰ型，屬于常規(guī)表達。但當細胞內(nèi)出現(xiàn)自噬時，Ⅰ型的LC3就可經(jīng)過泛素樣的系列加工修飾過程，與自噬細胞膜表明的磷脂酰乙醇胺想結(jié)合，轉(zhuǎn)化呈Ⅱ型的LC3。這樣LC3-Ⅱ就可結(jié)合到自噬體膜上，并且LC3-Ⅱ的量與細胞內(nèi)自噬泡的數(shù)量呈正比［11］。所以由此推論，LC3的表達強度可反應(yīng)細胞自噬活性。已有研究［12］發(fā)現(xiàn)，LC3的高表達與腫瘤的大小以及腫瘤壞死密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，在甲狀腺癌原發(fā)病灶以及轉(zhuǎn)移病灶均出現(xiàn)了LC3的表達降低現(xiàn)象。

基于以上研究，我們的結(jié)果符合Beclin1與LC3作為抑癌基因的前期研究，在甲狀腺癌組織及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中，我們發(fā)現(xiàn)Beclin1與LC3的表達均是降低的，造成的結(jié)果就是在表達降低的組織細胞的自噬能力降低，導(dǎo)致細胞生長周期增加，間接造成了細胞增值能力和轉(zhuǎn)移能力的增強，從而為腫瘤的形成提供有利條件。雖然本實驗中，我們揭示了Beclin1 與LC3在甲狀腺癌組織中表達均是降低的，但二者是否具有協(xié)同作用或其他相關(guān)性我們暫時還不得而知。在后續(xù)的研究中，我們還需要對Beclin1與LC3促進細胞自噬相關(guān)功能進行進一步的分析，探討二者在此功能方面是否具有相關(guān)性。

綜上所述，細胞自噬作為細胞的另外一種程序化死亡方式，在腫瘤的形成過程中具有雙重作用，即在腫瘤形成前發(fā)揮抑制作用，但腫瘤形成后又可發(fā)揮促進作用。本研究中的Beclin1與LC3的在甲狀腺癌組織及甲狀腺癌轉(zhuǎn)移形成的轉(zhuǎn)移灶的低表達，與自噬的特征相符。但二者發(fā)揮作用的具體機制還有待進一步研究。

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(學術(shù)編輯:李蓓)

Expression of autophagy-related protein Beclin1 and LC3 in thyroid carcinoma with cervical lymph node metastases and its clinical significance

CHEN Xiao-lin，HUA Qing-quan
( Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery，People’s Hospital of Wuhan University，Wuhan 430060，Hubei，China)

【Abstract】Objective: To investigate the autophagy-related protein Beclin1 and LC3 expression in thyroid carcinoma with cervical lymph node metastasis and clinical significance.Methods: By immunohistochemistry assay，from our hospital in February 2012 to February 2014 48 cases of papillary thyroid carcinoma tissues and 30 cases of para－tumor normal tissues were gathered to detect expression of Beclin1 and LC3，as well as another 38 cases of papillary thyroid cancer with lymph node metastasis and 30 cases of clinical samples of normal lymph nodes to detect Beclin1 and expression of LC3.Results: Beclin1 were expressed in all samples，being lower in thyroid cancer than adjacent normal thyroid tissue ( P＜0. 01)，metastatic lymph nodes Beclin1 level was significantly lower than that of the normal lymph node group ( P＜0. 01).The results showed LC3 protein expression was detected in all samples，its expression was the lowest in thyroid papillary tissue，beingsignificantly lower than that of their surrounding thyroid tissue ( P＜0. 01) andin the event of metastasis lymph LC3 content was lower than that of in normal lymph nodes ( P＜0. 01).Conclusion: Autophagy protein Beclin1 and LC3 expression are closely related to thyroid cancer metastasis，and tumor extracapsular extension of direct labeling.The proteins has a potential as a preoperative evaluation of lymph node metastasis of thyroid cancer，which has a certain significance.

【Key words】Thyroid cancer; Lymph node metastasis; Beclin1; LC3

作者簡介:陳小林( 1976－)，女，主治醫(yī)師。通訊作者:華清泉，E-mail: 504226866@ qq.com

收稿日期:2015－07－07

doi:10. 3969/j. issn. 1005-3697. 2016. 01.23

【文章編號】1005-3697( 2016) 01-0084-03

【中圖分類號】R736.1

【文獻標志碼】A