楊彩霞，馮晶，張香梅，馬輝

（1.艾森生物（杭州）有限公司，浙江杭州310030；2.中國聯(lián)合工程公司，浙江杭州310000）

納米氧化鋅對人正常肺細(xì)胞BEAS-2B的體外生物學(xué)效應(yīng)

楊彩霞1，馮晶1，張香梅1，馬輝2

（1.艾森生物（杭州）有限公司，浙江杭州310030；2.中國聯(lián)合工程公司，浙江杭州310000）

隨著納米氧化鋅的廣泛使用，其生物安全性備受關(guān)注。以人正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B為研究模型，采用WST-1檢測技術(shù)，研究納米氧化鋅對該細(xì)胞的體外生物學(xué)毒性；同時，通過檢測胞內(nèi)ROS和胞外LDH釋放水平來探討其作用機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，12.5～100 μg/mL濃度范圍內(nèi)，納米氧化鋅對BEAS-2B細(xì)胞存在劑量依賴性的毒性作用，并導(dǎo)致BEAS-2B胞內(nèi)ROS水平和胞外LDH釋放顯著性增加。這證實了納米氧化鋅的毒性作用與氧化應(yīng)激效應(yīng)有密切聯(lián)系，該研究成果為深入研究和評價納米氧化鋅的生物安全性提供了重要的實驗依據(jù)。

納米氧化鋅；細(xì)胞毒性；氧化應(yīng)激

隨著納米氧化鋅的廣泛使用，必然導(dǎo)致部分納米氧化鋅進(jìn)入到環(huán)境中，人體可能通過多種途徑接觸到，吸入是其中主要的途徑[1]。肺是呼吸系統(tǒng)的重要組成部分，擔(dān)任著氣血交換的重要作用，一旦受損，納米顆粒進(jìn)入其他組織器官的概率將顯著增加[2]。本文探討納米氧化鋅對人正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B的體外生物學(xué)效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

人正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B（ATCC），納米氧化鋅（平均粒徑35nm，Sigma）。

1.2 試驗試劑

DMEM：F-12（ATCC），F(xiàn)BS（Gibco），0.25%胰酶（Gibco），PBS（吉諾生物），WST-1（Roche），活性氧自由基（ROS）試劑盒和乳酸脫氫酶試劑盒（碧云天生物技術(shù)公司）。

1.3 試驗儀器

超凈工作臺（Thermo），二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱（Thermo），電熱恒溫水浴鍋（DK-S24，上海精宏），離心機(jī)（TD5A-WS，長沙湘儀），流式細(xì)胞儀（NovoCyte，ACEA），倒置生物顯微鏡（TMS，Nikon），DTX 880 Multimode Detector（BECKMAN）。

1.4 細(xì)胞接種與染毒處理

處于對數(shù)生長期的BEAS-2B細(xì)胞，0.25%胰酶消化，細(xì)胞懸液為3×104/mL。100μL接種于96孔板，培養(yǎng)24h；納米氧化鋅按照終濃度1.56、3.12、6.25、12.50、25.00、50.00μg/mL和100μg/mL加入96孔板，同時設(shè)置未加藥對照組。

1.5 WST-1檢測

96孔板培養(yǎng)基換成1∶10稀釋的WST-1，37℃培養(yǎng)箱孵育3h，測吸光度值，檢測波長450nm，參比波長620nm。用GraphPad Prism version 6.01處理數(shù)據(jù)，IC50通過S形劑量反應(yīng)的非線性回歸模型擬合。

1.6 LDH釋放測定

采用乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性檢測試劑盒，納米氧化鋅作用24h收集細(xì)胞的上清液進(jìn)行后續(xù)檢測，吸光度值波長設(shè)置同1.5。

1.7 ROS水平測定

細(xì)胞按照3×105個/孔的密度接種于6孔培養(yǎng)板，采用活性氧檢測試劑盒，納米氧化鋅作用24h收集細(xì)胞裝載探針后流式細(xì)胞儀檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 WST-1結(jié)果

如圖1所示，納米氧化鋅對BEAS-2B細(xì)胞毒性作用24h IC50為13.47μg/mL；48h IC50為13.81μg/mL。

圖1 WST-1檢測BEAS-2B細(xì)胞納米氧化鋅作用結(jié)果

2.2 LDH釋放水平

LDH釋放檢測結(jié)果表明，25μg/mL及以上濃度納米氧化鋅作用出現(xiàn)LDH釋放量顯著性增加。

2.3 ROS水平

胞內(nèi)ROS檢測結(jié)果如圖2所示，6.25μg/mL濃度少量ROS增加，12.5μg/mL及25μg/mL濃度ROS大量增加，50μg/mL及以上濃度細(xì)胞全部死亡脫落。

圖2 納米氧化鋅作用BEAS-2B細(xì)胞24h的ROS陽性細(xì)胞比例情況

3 結(jié)論

隨著納米氧化鋅的廣泛應(yīng)用，其引起的環(huán)境污染風(fēng)險也越來越被人們關(guān)注。Jeng與Swanson[3]研究顯示納米氧化鋅的毒性作用與濃度之間存在一定的關(guān)系。關(guān)榮發(fā)等[4]研究發(fā)現(xiàn)納米氧化鋅對人的正常肝細(xì)胞的遺傳毒性和細(xì)胞毒性均有明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。袁金華等[5]發(fā)現(xiàn)20μg/mL濃度的納米氧化鋅對人胚肺成纖維細(xì)胞存在強(qiáng)烈的毒性，細(xì)胞存活率低于10%；Lai等[6]發(fā)現(xiàn)濃度大于20μg/mL的納米氧化鋅作用于人膠質(zhì)瘤細(xì)胞的細(xì)胞存活率不到5%，提示納米氧化鋅毒性作用可能與其濃度存在相關(guān)性。Brunner等[7]研究發(fā)現(xiàn)納米氧化鋅濃度大于15μg/mL時，人體皮瘤細(xì)胞和3T3纖維原細(xì)胞均全部死亡，低濃度納米氧化鋅的細(xì)胞毒性具有明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。該文研究證實12.5～100μg/mL濃度范圍，納米氧化鋅對人正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B有劑量效應(yīng)的毒性作用，染毒24h就有明顯的作用，為深入研究和評價納米氧化鋅的生物學(xué)效應(yīng)奠定了重要的實驗基礎(chǔ)。

很多研究顯示，納米氧化鋅的毒理機(jī)制可能與氧化應(yīng)激效應(yīng)有關(guān)[8，9]，但截至目前，其毒性機(jī)理還有待于進(jìn)一步研究。該文機(jī)制探討表明，12.5～100μg/mL濃度范圍內(nèi)納米氧化鋅導(dǎo)致BEAS-2B胞內(nèi)ROS水平和胞外LDH釋放量顯著增加，證實納米氧化鋅的毒性作用與氧化應(yīng)激效應(yīng)有密切聯(lián)系。

[1]Wiesner MR,Lowry GV,Alvarez P，et al．Assessing the risks of manufactured nanomaterials[J].Environmental science &technolo gy,2006,40(14):4336-4345.

[2]龐小峰,張懷武,鄧波,等.納米尺度物質(zhì)的生物效應(yīng)和安全性[J].物理,2006,35(4):287-293.

[3]Jeng HA,Swanson J.Toxicity of met al oxide nanoparticles in mammalian cells[J].Journal of Environmental Science and Health,Part A Toxic/Hazardous Substances and Environmental Engineeri ng,2006,41(12):2699-2711.

[4]關(guān)榮發(fā),陳瀟婷,芮昶,等.納米氧化鋅對人正常肝細(xì)胞DNA及染色體的損傷作用[J].中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志,2012,26(2):237-241.

[5]袁金華,李光,陳慧珍,等.納米氧化鋅對人胚肺成纖維細(xì)胞的生物毒性[J].中山大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)科學(xué)版,2009,30(2):170-174.

[6]Lai JCK,Lai MB,Jandhyam S,et al.Exposure to titanium dioxide and other met allic oxide nanoparticles induces cytotoxicity on human neural cells and fibroblasts[J].International Journal of Nanomedicine,2008,3(4):533-545.

[7]Brunner TJ,Wick P,Manser P,et al.In vitro cytotoxicity of oxide nanoparticles:comparison to asbestos,silica,and the effect of particle solubility[J].Environmental Science &Technolo gy,2006,40(14):4374-4381.

[8]Heinlaan M,Ibask A,Blinova I,et al.Toxicity of nanosized and bulk ZnO and TiO2to bacteria Vibrio fischeri and crustaceans Daphnia magna and Thamnocephalusplatyurus[J].Chemosphe re,2008,71(7):1308-1316.

[9]Stadtman ER.Role of oxidant species in aging[J].Curr Med Chem,2004,11(9):1105-1112.

Biological Effect in Vitro of Nano Zinc Oxide on Human Normal Lung Cell BEAS-2B

Yang Cai-xia1,Feng Jing1,Zhang Xiang-mei1,Ma Hui2
(1.ACEA Biological (Hangzhou) Co.Ltd.,Zhejiang Hangzhou 310030;2.China United Engineering Company,Zhejiang Hangzhou 310000)

With the wide use of Nano Zinc Oxide,its biological safety is concerned.In normal human lung epithelial cell line BEAS-2B as the research model,the biologicaltoxicityin vitro of nano Zinc Oxide cells on it was studied by using WST-1 detection technology,and the mechanism of ROS by detecting intracellular and extracellular LDH release level was explored.This study found that in the range of 12.5 to 100 g/mL,Nano Zinc Oxide had a dose-dependent toxicity effect on BEAS-2B cells,and resulted in a significant increase in ROS levels and extracellular LDH release in BEAS-2B cells.It was confirmed that the toxicity of Nano Zinc Oxide had a close relationship with the oxidative stress effect,the research results can provide an important experimental basis for further research and evaluation of the biological safety of nano - Zinc Oxide.

Nano Zinc Oxide;Cytotoxicity;Oxidative stress

R318.08；TB383.1

A

2096-0387（2016）06-0044-03

楊彩霞（1983-），女，碩士，研究方向：生物研發(fā)。