肖玲玲，張超，龔大春

（1.湖北三峽職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖北宜昌443002；2.三峽大學(xué)，湖北宜昌443002）

溶氧對(duì)黑曲霉產(chǎn)β-葡萄糖苷酶發(fā)酵的影響

肖玲玲1，張超2，龔大春2

（1.湖北三峽職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖北宜昌443002；2.三峽大學(xué)，湖北宜昌443002）

溶氧是需氧微生物發(fā)酵控制最重要的參數(shù)之一，直接影響微生物酶活。為了研究溶氧變化對(duì)黑曲霉產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的影響，采用30L全自動(dòng)發(fā)酵罐，考察通氣比、轉(zhuǎn)速及分段控氧對(duì)發(fā)酵過(guò)程的影響。結(jié)果表明，當(dāng)菌體對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期溶氧控制在15%，后期溶氧控制在70%時(shí)，酶活力在144h時(shí)可達(dá)12.87U/mL，比分段控氧前酶活提高了1.2倍。這表明分段控氧的發(fā)酵控制方式為需氧微生物發(fā)酵培養(yǎng)提供了一個(gè)新的研究方向。

溶氧控制；黑曲霉；β-葡萄糖苷酶；發(fā)酵過(guò)程

β-葡萄糖苷酶是纖維素復(fù)合酶的重要組成部分，存在于自然界許多植物、昆蟲(chóng)、酵母、曲霉、木霉及細(xì)菌體內(nèi)，參與生物體的糖代謝，對(duì)維持生物體正常生理功能起著重要作用。在纖維素降解中能將纖維素二糖和纖維素寡糖水解成葡萄糖，對(duì)生物質(zhì)的利用起著至關(guān)重要的作用。此外，β-葡萄糖苷酶在改良果汁風(fēng)味[1]、果酒和茶葉增香[2]、生產(chǎn)低聚龍膽糖[3]、青梅脫苦[4]、生產(chǎn)大豆異黃酮[5]、生產(chǎn)天然色素[6]以及轉(zhuǎn)化虎杖中白藜蘆醇苷生成白藜蘆醇[7]等方面也得到了廣泛的應(yīng)用。同時(shí)，β-葡萄糖苷酶作為多酚化合物，具有抗氧化、強(qiáng)化血管壁，促進(jìn)腸胃消化，降低血脂肪，增加身體抵抗力，并防止動(dòng)脈硬化、血栓形成等作用，是一類(lèi)較好的天然抗氧化劑[8]。

本文采用30L Biostat Cplus全自動(dòng)發(fā)酵罐在線監(jiān)測(cè)和調(diào)節(jié)溶氧、轉(zhuǎn)速等參數(shù)，研究通氣比、轉(zhuǎn)速、溶氧對(duì)黑曲霉菌體生長(zhǎng)及β-葡萄糖苷酶合成的影響，以期提出較好的發(fā)酵控制方式，為黑曲霉擴(kuò)大生產(chǎn)β-葡萄糖苷酶提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑曲霉（Aspergillus niger），艾倫·麥克德?tīng)柮椎略偕茉囱芯克峁恍泵媾囵B(yǎng)基，PDA培養(yǎng)基；種子培養(yǎng)基，葡萄糖60g/L，麥芽粉8g/L，（NH4）2SO410g/L，KH2PO45g/L，MgSO4·7H2O 1g/L；發(fā) 酵 培養(yǎng)基，麥芽浸粉18g/L，酵母膏3.22g/L，KH2PO43g/L，MnSO4·H2O 0.58mM， 吐 溫 -80 0.5mL/L，MgSO4·7H2O 0.23g/L，消泡劑0.5mL/L。

UV-1100紫外分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州國(guó)華電器有限公司；Biostat Cplus 30自動(dòng)滅菌發(fā)酵罐，廣州寶信捷生物應(yīng)用設(shè)備有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 通氣比對(duì)發(fā)酵過(guò)程的影響

裝液量10L/30L，轉(zhuǎn)速300rpm，pH自然，接種量10%，溫度28℃，發(fā)酵6d。調(diào)節(jié)通氣比（1∶1、3∶2、2∶1vvm），考察通氣量對(duì)發(fā)酵過(guò)程的影響。

1.2.2 攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)發(fā)酵過(guò)程的影響

裝液量10L/30L，通氣比3∶2 vvm，pH自然，接種量10%，溫度28℃，發(fā)酵6d。調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速（300、350、400rpm），考察攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)發(fā)酵過(guò)程的影響。

1.2.3 分段控氧對(duì)發(fā)酵過(guò)程的影響

裝液量10L/30L，pH自然，接種量10%，溫度28℃，發(fā)酵6d。將轉(zhuǎn)速和溶氧度聯(lián)動(dòng)，同時(shí)調(diào)節(jié)通氣量，將菌體對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期溶氧控制在15%，后期溶氧分別控制在30%、50%和70%，考察分段控氧對(duì)發(fā)酵過(guò)程的影響。

1.3 菌體濃度的測(cè)定

干重法：取50mL發(fā)酵液抽濾得到菌體，將菌體放入100℃烘箱中烘干至恒重，稱量并減去烘干濾紙的質(zhì)量即為菌體濃度。

1.4 酶活測(cè)定方法

分光光度法[9]：取適當(dāng)稀釋的酶液0.5mL，加入1mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%的水楊苷溶液，50℃水浴保溫30min，加入3mL DNS試劑，沸水浴10min，冷卻后加水稀釋到25mL，在540nm測(cè)吸光度。

β-葡萄糖苷酶活力單位的定義：在50℃，pH4.8的條件下，1min從濃度為1.0%的水楊苷溶液中釋放1μmol還原糖所需要的酶量為一個(gè)酶活力單位。

2 結(jié)果與分析

2.1 通氣比對(duì)發(fā)酵過(guò)程的影響

從圖1、2、3可以看出，當(dāng)通氣比控制在3∶2vvm時(shí)，菌體濃度最大值可達(dá)9.42g/L，溶氧均在18h后跌0，之后開(kāi)始上升。在不同通氣比條件下，產(chǎn)酶均在42h后才開(kāi)始，酶活隨著時(shí)間的推移均有所上升，其中以通氣量3∶2vvm時(shí)酶活最高可達(dá)5.34U/mL，但與搖瓶條件下的相差甚遠(yuǎn)。分析原因，可能是在發(fā)酵過(guò)程中，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期供氧不足，有少量菌團(tuán)形成，影響到黑曲霉的生長(zhǎng)和β-葡萄糖苷酶的形成，導(dǎo)致酶活不高。

圖1 通氣比為1∶1vvm時(shí)發(fā)酵過(guò)程中的變化情況

圖2 通氣比為3∶2vvm時(shí)發(fā)酵過(guò)程中的變化情況

圖3 通氣比為2∶1vvm時(shí)發(fā)酵過(guò)程中的變化情況

2.2 攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)發(fā)酵過(guò)程的影響

從圖4、5可以看出，當(dāng)轉(zhuǎn)速設(shè)定在350rpm時(shí)，發(fā)酵66h后酶活力急劇上升，最大可達(dá)到10.75U/mL，但溶氧在12～42h跌0（維持在5%～10%）后回升。即在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，溶氧度低于霉菌臨界溶氧度（10%～15%）的時(shí)間依舊較長(zhǎng)；當(dāng)轉(zhuǎn)速維持在400rpm時(shí)，菌體濃度最大可達(dá)10.14g/L，溶氧不跌0且持續(xù)上升，但酶活相對(duì)最低僅有1.38U/mL，并在發(fā)酵90h后維持恒定。分析原因，可能是由于菌體生長(zhǎng)和酶的生成均需要氧氣參與，攪拌速度過(guò)低，發(fā)酵液中溶解氧濃度不夠，影響β-葡萄糖苷酶的生成；當(dāng)攪拌速度過(guò)大時(shí)，雖然溶解氧濃度增大，但菌體生長(zhǎng)速度大于產(chǎn)酶速度，同時(shí)過(guò)大的轉(zhuǎn)速產(chǎn)生了較高的剪切力，使菌絲變得纖細(xì)，影響酶的生成，導(dǎo)致酶活很低。

圖4 轉(zhuǎn)速為350rpm時(shí)發(fā)酵過(guò)程中的變化情況

圖5 轉(zhuǎn)速為400rpm時(shí)發(fā)酵過(guò)程中的變化情況

2.3 分段控氧對(duì)發(fā)酵過(guò)程的影響

如圖6、7、8所示，當(dāng)后期溶氧控制在30%時(shí)，菌體濃度在發(fā)酵進(jìn)行30h時(shí)達(dá)到最大，為13.54g/L，但酶活最大僅為5.6U/mL，溶氧剛開(kāi)始下降，24h后上升且在30%維持72h后上升。出現(xiàn)這一現(xiàn)象的原因可能是菌體在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期供氧充足，菌體生長(zhǎng)良好，后期因供氧不足，致使酶量少，酶活低；后期溶氧控制在50%時(shí)，β-葡萄糖苷酶在36h開(kāi)始形成，酶活最高時(shí)為10.95U/mL；后期溶氧控制在70%時(shí)，β-葡萄糖苷酶活最大可達(dá)到12.87U/mL，可能是由于后期供氧量的加大，使酶的合成量顯著增加。

圖6 后期溶氧控制在30%時(shí)發(fā)酵過(guò)程中的變化情況

圖7 后期溶氧控制在50%時(shí)發(fā)酵過(guò)程中的變化情況

圖8 后期溶氧控制在70%時(shí)發(fā)酵過(guò)程中的變化情況

3 結(jié)論

該文對(duì)黑曲霉產(chǎn)β-葡萄糖苷酶發(fā)酵過(guò)程中的溶氧控制進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)速與通氣比對(duì)黑曲霉的生長(zhǎng)與β-葡萄糖苷酶的合成均有影響，相比而言，轉(zhuǎn)速與溶氧聯(lián)動(dòng)，同時(shí)調(diào)節(jié)通氣比的分段控氧模式更有利于提高菌體生物量與β-葡萄糖苷酶酶活。當(dāng)前期溶氧自然，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期溶氧濃度控制在15%，后期溶氧控制在70%時(shí)，酶活可達(dá)到12.87U/mL，是優(yōu)化通氣比和攪拌轉(zhuǎn)速后產(chǎn)酶酶活的1.2倍。本研究從發(fā)酵過(guò)程中的一個(gè)化學(xué)參數(shù)——溶氧控制入手，探索出了分段控氧方式，為提高需氧微生物的生物量與產(chǎn)品產(chǎn)量提供了一條新思路。

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Effect of Dissolved Oxygen Control on β-glucosidase Produced by Aspergillus niger

Xiao Ling-ling1,Zhang Chao2,Gong Da-chun2
(1.Hubei Three Gorges Polytechnic,Hubei Yichang 443002;2.China Three Gorges University,Hubei Yichang 443002)

Aerobic microbial fermentation control of dissolved oxygen is one of the most important parameters directly affect the enzyme activity.In order to study the change of dissolved oxygen of β-glucosidase produced by Aspergillus niger,using 30L full automatic fermentation tank,the effects of aeration ratio,rotating speed and sectional oxygen control on the fermentation process was investigated.The results showed that when the logarithmic dissolved oxygen control in 15%,later dissolved oxygen control in 70%,the enzyme activity could reach 12.87U/mL in 144 hours,the enzyme activity was increased by 1.2 times than that of the sectional control.This indicates that the fermentation control mode of staged oxygen control of the aerobic fermentation of aerobic fermentation provides a new research direction for the fermentation of aerobic microorganisms.

Dissolved oxygen;Aspergillus niger;β-glucosidase;Fermentation process

TQ920.1

A

2096-0387（2016）06-0018-04

肖玲玲（1983-），女，湖南常德人，碩士，講師，研究方向：生物化工。