徐海鵬，李慧萍，金小煜，金 寧，?？e，馬暉玲

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學草業(yè)學院草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅蘭州 730070; 2.甘肅農(nóng)業(yè)大學園藝學院，甘肅蘭州 730070)

草地早熟禾愈傷組織對NaCl脅迫的生理響應

徐海鵬1，李慧萍1，金小煜1，金 寧2，?？e1，馬暉玲1

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學草業(yè)學院草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅蘭州 730070; 2.甘肅農(nóng)業(yè)大學園藝學院，甘肅蘭州 730070)

以草地早熟禾(Poa pratensis)午夜Ⅱ號愈傷組織為材料，研究NaCl脅迫對其生長、細胞膜相對透性、游離脯氨酸、丙二醛、可溶性蛋白及抗氧化酶活性的影響。結(jié)果表明，低濃度NaCl脅迫對午夜Ⅱ號愈傷組織的生長有促進作用，高濃度NaCl脅迫對愈傷組織生長具有抑制作用，且當NaCl濃度高于1.5%時愈傷組織開始出現(xiàn)褐化的現(xiàn)象;隨NaCl濃度的升高，其脅迫程度也隨之加強，丙二醛(MDA)和可溶性蛋白含量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，游離脯氨酸(Pro)含量和細胞膜相對透性則呈現(xiàn)出一直增加的趨勢;過氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)活性隨NaCl脅迫程度的增加呈先升高后降低的趨勢，在NaCl濃度為1.5%時酶活性達到最高。研究結(jié)果為草地早熟禾愈傷組織耐鹽突變體的篩選奠定了基礎(chǔ)。

NaCl脅迫;草地早熟禾;愈傷組織;生長;生理生化

草地早熟禾(Poa pratensis)是一種多年生草本植物，禾本科早熟禾屬，喜冷涼濕潤氣候、色美、綠期長、耐踐踏、觀賞效果好，是我國北方地區(qū)廣泛應用的冷季型草坪草種［1］。近年來，我國已從國外引進了許多草地早熟禾新品種，但我國北方降水短缺，地表和地下水蒸發(fā)較快，且降雨多為堿性，土壤滲透率較大，加之多處于干旱、半干旱地區(qū)，土壤灌溉區(qū)與非灌溉區(qū)均表現(xiàn)出較強的鹽漬化問題［2］。高鹽度土壤影響草坪草的許多生理和代謝過程，從而影響其正常的生長和發(fā)育(草坪草泛斑、生長不良、春季發(fā)芽延遲和秋季早衰)，降低草坪的利用價值［3］。因此，土壤次生鹽漬化問題嚴重影響著我國北方地區(qū)草坪的建植和推廣應用，而解決這一問題的一條可行途徑就是培育耐鹽新品種。

體細胞變異具有變異頻率高、育種周期短、成本低、操作難度小、應用范圍廣、可通過人為施加生物與非生物脅迫選擇壓來定向篩選突變體、能在保持原品種優(yōu)良性狀不變的情況下有效改善個別不良性狀等優(yōu)點［4-5］。利用體細胞無性系變異研究草坪草耐鹽性方向的相對較少，Lu等［6-7］以雜交狗牙根(Cynodon dactylon)愈傷組織為材料，利用鹽脅迫處理，從再生植株中篩選抗旱耐鹽突變體，發(fā)現(xiàn)耐鹽變異體的耐鹽性與其脯氨酸的增高有直接關(guān)系，同時抗氧化酶活性提高。柴明良和王賀飛［8］測定了結(jié)樓草(Zoysia japonica)栽培品種Zenith商品種子愈傷和胚性愈傷組織系的耐鹽性，并利用鹽溶液多次定向篩選，獲得了耐鹽性較強的體細胞無性系變異植株。賈玉芳等［9］利用10 Gy60Coγ射線輻照溝葉結(jié)縷草匍匐莖誘導的胚性愈傷組織，經(jīng)NaCl的篩選，發(fā)現(xiàn)10 Gy60Coγ輻射處理可顯著提高胚性愈傷組織對NaCl的抗性，得到了溝葉結(jié)縷草(Z.matrella)的耐鹽變異體。因此，利用體細胞培養(yǎng)技術(shù)可以從植物細胞中篩選出耐鹽突變體，達到改良或選育植物新品種的效果。本研究以草地早熟禾午夜Ⅱ號愈傷組織為材料，在細胞水平分析草地早熟禾午夜Ⅱ號愈傷組織對不同NaCl濃度脅迫的生長和生理響應，旨為以后草地早熟禾午夜Ⅱ號愈傷組織耐鹽突變體的篩選奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1愈傷組織的獲得及脅迫培養(yǎng)

以草地早熟禾午夜Ⅱ號的種子為研究材料，將其按俞玲和馬暉玲報道［1］的方法滅菌后接種在MS + 2，4-D (1.0 mg·L－1) + 6-BA (0.3 mg·L－1) +3%蔗糖+ 0.7%瓊脂的培養(yǎng)基上誘導產(chǎn)生愈傷組織，50 d后將誘導出的愈傷組織轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基，繼代培養(yǎng)基同誘導培養(yǎng)基，此后每隔20 ～25 d繼代一次，每次繼代時去掉水漬化和褐化的愈傷組織，繼代培養(yǎng)5～6次后，選擇較好的愈傷組織(疏松、生長快速且均勻)接種于含不同NaCl濃度(0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5% )的培養(yǎng)基上，每皿接種20塊愈傷組織，每個處理重復5皿，脅迫處理20 d，取樣進行相關(guān)生長、抗氧化與滲透調(diào)節(jié)指標的測定。

1.2測定方法

1.2.1愈傷組織生長量的測定 愈傷組織的生長量以相對生長率來計算，草地早熟禾午夜Ⅱ號愈傷組織相對生長率= (鹽脅迫20 d后愈傷組織重量－未處理前愈傷組織重量) /未處理前愈傷組織重量×100%。每個處理測量5皿，最終愈傷組織的生長量以每個處理重復測量的平均值表示。

1.2.2生理指標的測定 利用電導儀法測定細胞膜相對透性［10］;采用考馬斯亮藍G-250染色法測定可溶性蛋白含量［11］;采用茚三酮比色法測定游離脯氨酸含量［11］;采用硫代巴比妥酸比色法測定丙二醛含量［12］;采用NBT(氮藍四唑)光化學還原反應法測定超氧化物歧化酶(SOD)活性［13］;采用氧化愈創(chuàng)木酚比色法測定過氧化物酶(POD)活性［13］;利用紫外分光光度法測定過氧化氫酶(CAT)活性［13］。

1.3數(shù)據(jù)處理

對所有數(shù)據(jù)利用Excel 2010統(tǒng)計和整理，單因素方差分析和多重比較利用SPSS 19.0軟件，并將結(jié)果以平均值和標準誤形式表示，最終結(jié)果采用Excel 2010制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 NaCl脅迫對午夜Ⅱ號愈傷組織相對生長率的影響

圖1-Ⅰ為對照，圖1-Ⅱ、1-Ⅲ和1-Ⅳ分別為NaCl濃度為1.5%、2.0%和2.5%處理20 d后草地早熟禾的愈傷組織，當NaCl濃度高于1.5%時，部分愈傷組織出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，且隨著濃度的增高，褐化現(xiàn)象越嚴重。可以看出，不同NaCl濃度脅迫后對午夜Ⅱ號愈傷組織生長狀況的影響存在較大的差異(圖2)，高鹽濃度對愈傷組織的生長有顯著抑制作用(P＜0.05)，輕度的鹽脅迫對于愈傷組織的生長有促進作用，在NaCl濃度為0.5%時，愈傷組織的相對生長率顯著高于其它NaCl濃度(P＜0.05)，凈重效果明顯，隨著NaCl濃度的提高，愈傷組織生長受抑制程度增加，其生長速率減緩。

婆婆緩和了半天情緒后，對錢海燕說：“燕燕，這段時間你受苦了，媽還老是不理解你。對不起啊?！比缓笥謱χ軉⒚髡f：“兒子，沒事的。你不用擔心錢，還有我和你爸呢。”那天晚上，一家人哭成一團。

圖1 NaCl脅迫下午夜Ⅱ號的愈傷組織Fig.1 Effects of NaCl stress on relative growth rate of MidnightⅡcalli

圖2 不同濃度NaCl脅迫下午夜Ⅱ號愈傷組織相對生長率的變化Fig.2 Effects of NaCl stress on relative growth rate of MidnightⅡcalli

2.2 NaCl脅迫對午夜Ⅱ號愈傷組織細胞膜透性的影響

電解質(zhì)外滲率可以反映逆境脅迫下愈傷組織細胞膜透性的增強程度。當NaCl的濃度逐漸升高時，午夜Ⅱ號愈傷組織的細胞膜透性逐漸增大，低濃度脅迫時，細胞膜透性上升趨勢比較快，說明低濃度刺激時細胞膜透性表現(xiàn)的較為靈敏，而高濃度下細胞膜透性增長較為緩慢，說明高濃度NaCl脅迫對細胞的傷害率較大，細胞膜透性開始增大，細胞膜的損害程度越來越嚴重(圖3)。

圖3 NaCl脅迫對午夜Ⅱ號愈傷組織細胞膜透性的影響Fig.3 Effects of NaCl stress on the relative memberane permeability of MidnightⅡcalli

2.3 NaCl脅迫對午夜Ⅱ號愈傷組織游離脯氨酸含量的影響

游離脯氨酸是植物在逆境脅迫下極其重要的一項生理指標［14］。NaCl脅迫下午夜Ⅱ號愈傷組織游離脯氨酸的含量均高于對照，且隨NaCl濃度的增大，脯氨酸含量顯著增加(P＜0.05) (圖4)。游離脯氨酸含量在NaCl濃度為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%分別比對照增加了3.37倍、5.53倍、6.41倍、10.45倍和10.30倍，隨脅迫程度的增加，游離脯氨酸逐漸積累，且與對照相比具有顯著性差異(P＜0.05)。

圖4 不同濃度NaCl脅迫下午夜Ⅱ號愈傷組織游離脯氨酸含量的變化Fig.4 Effects of NaCl stress on Pro content in callus of MidnightⅡ

2.4 NaCl脅迫對午夜Ⅱ號愈傷組織丙二醛含量的影響

MDA是膜脂過氧化產(chǎn)物。在植物遭受逆境脅迫時，植物體內(nèi)活性氧的代謝系統(tǒng)被破壞，從而導致植物體內(nèi)平衡受損，活性氧積累，最終引發(fā)膜脂過氧化［15］。在NaCl脅迫下，MDA隨脅迫的程度不同而呈現(xiàn)不同的變化，NaCl處理后，MDA含量均高于對照組，隨著NaCl脅迫程度的加強，MDA含量呈現(xiàn)先增高后下降的趨勢，分別比對照增加了1.48倍、1.94倍、2.40倍、1.92倍、1.93倍;在NaCl濃度為1.5%時，MDA含量達到最大，NaCl濃度為2.5%時，與2.0%時相比，MDA含量變化不顯著(P＞0.05)，保持相對穩(wěn)定(圖5)。

圖5 不同濃度NaCl脅迫下午夜Ⅱ號愈傷組織MDA含量的變化Fig.5 Effects of NaCl stress on MDA content in callus of MidnightⅡ

2.5 NaCl脅迫對午夜Ⅱ號愈傷組織可溶性蛋白含量的影響

不同濃度NaCl脅迫下愈傷組織可溶性蛋白含量的變化趨勢顯示(圖6)，隨著NaCl濃度的增大，午夜Ⅱ號愈傷組織可溶性蛋白含量先增高后下降，變化趨勢明顯，其含量在0.5%、1.0%、1.5%、2.0% NaCl脅迫下分別為對照的100.11%、103.08%、105.23%和108.59%，2.5% NaCl脅迫下，午夜Ⅱ號愈傷組織可溶性蛋白含量比對照降低，是對照的99.71%;其中，低濃度處理的愈傷組織可溶性蛋白含量較對照組增長顯著(P＜0.05)，而NaCl濃度為2.5%時，可溶性蛋白含量維持在一定的水平，略低于對照，但兩者間差異不顯著。

圖6 不同濃度NaCl脅迫下午夜Ⅱ號愈傷組織可溶性蛋白含量的變化Fig.6 Effects of NaCl stress on soluble protein content in callus of MidnightⅡ

2.6 NaCl脅迫對午夜Ⅱ號愈傷組織抗氧化酶活性的影響

在整個試驗過程中，愈傷組織中SOD、POD、CAT都是隨著NaCl脅迫的增大先升高后下降(圖7)。SOD與植物的抗逆性有關(guān)［16］，在NaCl濃度為1.0%時，SOD活性最高。CAT和POD是構(gòu)成植物愈傷組織細胞內(nèi)H2O2清除系統(tǒng)的主要抗氧化酶［17］，隨鹽濃度的增加，抑制作用明顯增強，在NaCl濃度為1.5%時，POD和CAT酶活性達到最大，在NaCl濃度為2.5%時，活性降低。

3 討論與結(jié)論

3.1 NaCl脅迫對午夜Ⅱ號愈傷組織生長的影響

鹽脅迫可導致植物組織過量吸收Na+，不僅抑制了K+和其它一些維持植物正常生理活動的離子的吸收，還影響細胞新陳代謝。因此，植物愈傷組織在鹽脅迫下生長減緩［18-19］，甚至愈傷組織開始褐化。本研究發(fā)現(xiàn)，低濃度NaCl(＜0.5%)對草地早熟禾午夜Ⅱ號愈傷組織的生長有明顯的促進作用。其中，濃度為0.5%的NaCl處理的增重效果最為顯著(P＜0.05)，而高濃度NaCl(＞1%)對愈傷組織的生長具有顯著抑制作用，耐受閾值＜1.5%。午夜Ⅱ號愈傷組織對鹽脅迫具有一定的耐受和抵抗能力，說明在輕度鹽脅迫條件下，其可通過鈉積累或離子交換而達到平衡，從而可以良好地生長。

圖7 不同濃度NaCl脅迫下午夜Ⅱ號愈傷組織CAT、SOD和POD酶活性的變化Fig.7 Effects of NaCl stress on CAT，SOD and POD activities in callus of MidnightⅡ

3.2 NaCl脅迫下午夜Ⅱ號愈傷組織滲透調(diào)解物含量動態(tài)變化

脯氨酸的積累是植物逆境脅迫下的生理指標之一［20-21］，具有調(diào)節(jié)細胞滲透壓、降低細胞水勢、穩(wěn)定細胞蛋白結(jié)構(gòu)的作用，在植物對逆境適應過程中發(fā)揮著重要作用［15-22］。本研究結(jié)果表明，不同濃度的NaCl處理后，隨NaCl濃度的增大，草地早熟禾午夜Ⅱ號愈傷組織中的脯氨酸含量變化呈現(xiàn)上升趨勢，表明脯氨酸在NaCl脅迫條件下逐漸累積，在午夜Ⅱ號愈傷組織逆境脅迫中發(fā)揮著重要的滲透調(diào)節(jié)作用，以適應鹽脅迫。

可溶性蛋白的降低使細胞代謝速率降低，從而使愈傷組織對于鹽脅迫的適應能力增強［23］?？扇苄缘鞍缀侩S著NaCl濃度的增大呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，說明在低濃度鹽脅迫下，午夜Ⅱ號愈傷組織為適應逆境環(huán)境，在組織內(nèi)發(fā)生的蛋白質(zhì)合成和分解反應中，其合成速率大于分解速率，因而表現(xiàn)出蛋白質(zhì)含量逐漸積累的現(xiàn)象，而在高鹽脅迫下，隨著脅迫時間的延長蛋白質(zhì)合成速率受到抑制，蛋白質(zhì)分解速率大于其合成速率，使愈傷組織逐漸遭受鹽害［24］。

電解質(zhì)外滲率可以更深層地從細胞內(nèi)部說明植物組織所受逆境脅迫的程度［25］。植物組織在逆境脅迫下，會引起細胞膜透性增大，細胞內(nèi)含物外滲［26］。隨NaCl濃度的增大，愈傷組織細胞膜透性曲線持續(xù)上升，說明細胞膜通透性越大，細胞膜損傷程度越嚴重。

3.3 NaCl脅迫下午夜Ⅱ號愈傷組織抗氧化酶活性及膜脂過氧化系統(tǒng)的響應

由于鹽脅迫會引起植物體活性氧積累，產(chǎn)生氧化脅迫，因而植物一般不能在高鹽土壤上正常生長。為避免氧化脅迫，非鹽生植物體內(nèi)形成一套防御機制，通過抗氧化酶和一些小分子化合物保護系統(tǒng)調(diào)節(jié)相關(guān)生理過程，維持機體相對穩(wěn)定［15］，以適應逆境環(huán)境。植物細胞在逆境脅迫下，表現(xiàn)出生物氧自由基增加，膜系統(tǒng)遭受破壞。而SOD和CAT由于具有消除氧自由基的作用，SOD可催化O2－發(fā)生歧化反應生成O2和H2O2，POD和CAT又催化H2O2形成H2O，所以SOD、CAT和POD的協(xié)調(diào)使植物體內(nèi)活性氧維持在較低水平，可間接判斷植物抗逆性的強弱［27-29］。Patade等［30］研究表明，NaCl和PEG脅迫下的甘蔗(Dioscorea esculenta)愈傷組織POD活性隨著脅迫程度的加重而逐漸降低。本研究發(fā)現(xiàn)，午夜Ⅱ號愈傷組織中SOD、POD和CAT都隨著NaCl脅迫程度的增大先升高后下降，這與Patade等［30］的研究結(jié)果基本一致，且NaCl脅迫下愈傷組織抗氧化酶活性均高于未脅迫對照，高鹽濃度下，3種酶的活性均受到抑制，說明高濃度NaCl脅迫使午夜Ⅱ號愈傷組織中CAT和POD活性顯著降低，不能及時清除H2O2，導致膜脂過氧化。而丙二醛是膜脂過氧化產(chǎn)物，其含量愈大，表明膜脂過氧化程度愈強。Patade等［30］研究還表明，NaCl和PEG脅迫下的甘蔗愈傷組織的丙二醛和電解質(zhì)滲漏率均顯著地高于未脅迫對照。本研究中，低鹽脅迫下午夜Ⅱ號愈傷組織中MDA含量隨脅迫程度的加劇而顯著提高，高濃度NaCl(＞1.5%)脅迫下愈傷組織中MDA含量均高于未脅迫對照，并隨著鹽濃度的增加而下降，與該研究結(jié)果一致，表明午夜Ⅱ號愈傷組織具有一定限度的抵抗膜脂過氧化能力。

綜上所述，通過對NaCl脅迫下草地早熟禾午夜Ⅱ號愈傷組織的生長、抗氧化和滲透性調(diào)節(jié)能力的比較，發(fā)現(xiàn)午夜Ⅱ號愈傷組織可以耐受1.5%的鹽濃度。因此，在篩選耐鹽突變體時其NaCl濃度應不低于1.5%。

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(責任編輯 王芳)

Physiological response of Kentucky bluegrass calli under NaCl treatment

Xu Hai-peng1，Li Hui-ping1，Jin Xiao-yu1，Jin-Ning2，Niu Kui-ju1，Ma Hui-ling1
(1.Pratacultural College，Gansu Agricultural University，Key laboratory of Grassland Ecosystem，Ministry of Education，Sino-U.S.Centers for Grazingland Ecosystem Sustainability，Lanzhou 730070，China; 2.Horticultural College，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China)

The effects of NaCl treatment on calli generated from Kentucky bluegrass cultivars MidnightⅡwere investigated by measuring calli growth，relative membrane permeability，contents of proline，MDA，and protein and the activities of antioxidant enzymes.The results showed that the calli growth of MidnightⅡwas stimulated under low concentration of NaCl whereas it was inhibited under high concentration of NaCl and the browning was observed if NaCl concentration was higher than 1.5%.With the increase of NaCl concentration，MDA and protein content increased firstly and then decreased.However，relative membrane permeability and proline content always increased.The activities of POD，SOD and CAT also increased firstly and then decreased with the increase of NaCl concentration which reached the peaks with the concentrations of 1.5% NaCl.The present study provided useful knowledge for screening salt resistant mutants of kentucky bluegrass.

NaCl stress; kentucky bluegrass; callus; growth; physiological and biochemical index

Ma Hui-ling E-mail: mahl@ gsau.edu.cn

S812; S543+.904; Q945.78

A

1001-0629(2016) 1-0086-07*

10.11829/j.issn.1001-0629.2015-0166

徐海鵬，李慧萍，金小煜，金寧，?？e，馬暉玲.草地早熟禾愈傷組織對NaCl脅迫的生理響應.草業(yè)科學，2016，33(1) : 86-92.

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2015-03-24 接受日期: 2015-06-01

甘肅農(nóng)業(yè)大學國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(201510733001) ;甘肅農(nóng)業(yè)大學“大學生科研訓練計劃(SRTP)項目”(20150225) ;國家自然科學基金“草地早熟禾種間體細胞雜交的研究”(31160482)

徐海鵬(1994-)，男，甘肅定西人，在讀本科生，研究方向為草業(yè)科學。E-mail: 1292159295@ qq.com

馬暉玲(1966-)，女(回族)，甘肅蘭州人，教授，博士，研究方向為牧草及草坪草育種。E-mail: mahl@ gsau.edu.cn