張洪英，魏淑花，張 蓉，苗 潤，李克昌，羅曉玲，張 宇

(1.寧夏農林科學院植物保護研究所，寧夏銀川 750002;2.寧夏大學農學院，寧夏銀川 750001; 3.寧夏草原工作站，寧夏銀川 750002)

豌豆蚜為害對苜蓿品種酶活性和營養(yǎng)物質的影響

張洪英1，2，魏淑花1，張 蓉1，苗 潤2，李克昌3，羅曉玲3，張 宇3

(1.寧夏農林科學院植物保護研究所，寧夏銀川 750002;
2.寧夏大學農學院，寧夏銀川 750001; 3.寧夏草原工作站，寧夏銀川 750002)

為了探討苜蓿(Medicago sativa)對蚜蟲取食防御反應的生化機制，本研究通過室內人工接蟲，研究了豌豆蚜(Acyrthosiphon pisum)取食后苜蓿體內防御性酶活性、營養(yǎng)物質含量的動態(tài)變化。結果表明，豌豆蚜為害7 d后，與低抗品種(驚喜、WL343HQ和德寶)相比，抗蟲品種(三得利、MF4020、皇后、皇冠和SR4030)的苜蓿幼苗苯丙氨酸解氨酶(PAL)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)及可溶性糖活性變化總體上顯著增高(P＜0.01)，多酚氧化酶(PPO)和過氧化氫酶(CAT)活性變化顯著降低(P＜0.01)，中抗品種(柏拉圖、甘農4號、先行者和中苜3號)介于其間，可溶性蛋白質含量變化量無明顯規(guī)律。

苜蓿品種;豌豆蚜;危害脅迫;防御性酶;營養(yǎng)物質

目前，寧夏地區(qū)種植高產優(yōu)質苜蓿面積約39萬hm2，占地區(qū)牧草種植總面積的66%［1］。苜蓿大面積的連年種植，導致病蟲害問題日益嚴重，成為苜蓿品種選育和影響苜蓿產量的重要因子［2］。蚜蟲是為害苜蓿最為嚴重的害蟲類群之一，在寧夏主要有豌豆蚜(Acyrthosiphon pisum)、苜蓿斑蚜(Therioaphis trifolii)、苜蓿無網蚜(Acyrthosiphon kondoi)和豆蚜(Aphis craccivora) 4種蚜蟲，其中，豌豆蚜為優(yōu)勢種［3］。豌豆蚜喜聚集在苜蓿的細嫩部位吸食汁液，如嫩莖、嫩梢、幼芽、葉片、花和果實等部位［4］，使苜蓿葉片卷縮，變黃，甚至全株枯死。豌豆蚜取食時大量排泄蜜露，蜜露霉變后嚴重影響苜蓿質量和品質，失去其加工價值，家畜拒食［5］。豌豆蚜還傳播苜?；ㄈ~病毒，造成的經濟損失遠遠超過其直接為害的損失［6］。

寧夏地區(qū)現階段防治豌豆蚜的主要措施是提前刈割和化學農藥相結合的方法［7-8］。由于化學農藥的大量使用，導致蚜蟲的抗藥性、再增猖獗和農藥殘留等問題日益突出［9］。開展苜?？寡列云贩N研究、選育及推廣使用不僅能減少化學農藥的使用對生態(tài)環(huán)境的影響，還是綜合治理蚜蟲的有效生態(tài)措施。因此，本研究擬通過室內人工接蟲方法，對寧夏地區(qū)主栽的12個苜蓿品種，豌豆蚜取食為害后，苜蓿體內苯丙氨酸解氨酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)活性動態(tài)變化及可溶性糖和可溶性蛋白質含量變化率進行測定，以期了解不同抗性苜蓿品種受豌豆蚜為害后體內發(fā)生的防御性反應，明確各項生理指標與苜?？寡列灾g的關系，初步確定出豌豆蚜脅迫的診斷指標，為應用抗性苜蓿品種治理豌豆蚜提供依據。

1 材料與方法

1.1供試材料

1.1.1供試苜蓿品種 選用寧夏地區(qū)主栽的12個苜蓿品種為供試材料，分別為三得利、MF4020、皇后、SR4030、皇冠、柏拉圖、甘農4號、中苜3號、先行者、驚喜、WL343HQ和德寶。依據國家牧草產業(yè)體系——鹽池綜合試驗站項目田間及室內篩選評價，得出供試苜蓿品種分抗蟲(R)、中抗(MR)和低抗(LR) 3個級別。其中5個抗蟲品種為三得利、MF4020、皇后、皇冠和SR4030，4個中抗品種為柏拉圖、甘農4號、先行者和中苜3號，3個低抗品種為驚喜、WL343HQ和德寶。

1.1.2供試蟲源 試驗蟲源采自寧夏賀蘭山茂盛草業(yè)公司試驗基地苜蓿植株上自然發(fā)生的豌豆蚜成蚜。

1.2試驗方法

1.2.1試驗處理 于2014年4月11日將供試12個不同抗蚜性苜蓿品種在溫室種于花盆(25 cm×30 cm)中，每品種6盆集中放置，品種間行距1 m，常規(guī)管理，不做任何處理。出苗整齊后進行間苗，每盆保留20株長勢一致的苜蓿幼苗。由于苜蓿幼苗對豌豆蚜刺吸脅迫耐受性是有一定限度的，若每株接種蚜蟲過多，苜蓿幼苗體內的自身保護機制可能遭到破壞［10-11］，因此按每株30頭蟲口密度接種豌豆蚜成蚜。將田間采回的健壯豌豆蚜成蚜輕輕抖動于花盆中的白紙上，讓其自然爬上苜蓿植株。接種后每一品種集中用網紗(1 m×1 m×1 m)罩住，以防蚜蟲逃走和外來天敵入侵。分別于接蟲后3、7、10 d［12］剪取植株用于酶活性測定，以不接蚜為對照，每測定重復3次。

1.2.2測定方法 PAL、PPO酶活性測定參照孫群和胡景江［13］方法，POD酶活性測定參照王偉玲等［14］方法，SOD、CAT酶活性測定參照李晶等［15］方法，分別測定豌豆蚜為害前后不同抗性苜蓿品種5種酶活性和營養(yǎng)物質含量的變化量。

酶活性變化量= (接蚜后的酶活性－同期未接蟲的酶活性) /同期未接蚜的酶活性;

營養(yǎng)物質含量變化量= (接蚜后的含量－同期未接蟲的含量) /同期未接蚜的含量。

1.2.3數據處理 運用Excel 2007進行數據統(tǒng)計，SAS 8.0軟件進行方差分析。

2 結果與分析

2.1豌豆蚜為害后PAL活性變化

為害7 d后，PAL酶活性增加量明顯高于為害10 d和為害3 d的。5個抗蟲品種(三得利、MF4020、皇后、皇冠和SR4030)的PAL酶活性變化量在為害3、7、10 d后均極顯著高于3個低抗品種(驚喜、WL343HQ和德寶) (P＜0.01)，但抗蟲品種間以及低抗品種間的酶活性增加量差異不顯著(表1)。

豌豆蚜為害3 d后，三得利PAL酶活性變化量極顯著高于4個中抗品種和3個低抗品種(P＜0.01)。MF4020、皇冠、SR4030酶活性變化量與柏拉圖、甘農4號PAL酶活性變化量之間差異不顯著(P＞0.01)，但極顯著高于先行者、中苜3號。柏拉圖、甘農4號與3個低抗品種間差異極顯著。先行者、中苜3號與3個低抗品種間差異不顯著(P＞0.01)。為害7 d后，三得利、皇后PAL酶變化量極顯著高于甘農4號、先行者、中苜3號3個中抗品種和3個低抗品種。甘農4號極顯著低于5個抗蟲品種，極顯著高于3個低抗品種。為害10 d后，5個抗蟲品種的PAL酶活性變化量極顯著高于4個中抗品種和3個低抗品種。其中抗蟲品種三得利的PAL酶活性變化量在供試的12個品種中一直保持著較高的水平，而3個低抗品種酶活性變化量則一直在較低水平。

2.2豌豆蚜為害后不同苜蓿品種PPO活性變化

在豌豆蚜為害苜蓿期間，5個抗蟲品種PPO酶活性變化量極顯著高于3個低抗品種(P＜0.01) ; 4個中抗品種(柏拉圖、甘農4號、先行者和中苜3 號) PPO酶活性變化量位于抗蟲品種和低抗品種之間(表2)。

表1 豌豆蚜為害后不同抗性苜蓿品種PAL活性變化量Table 1 PAL activity change amount of various resistant alfalfa cultivars after damaged by Acyrthosiphon pisum

表2 豌豆蚜為害后不同抗性苜蓿品種PPO活性變化量Table 2 PPO activity change amount of various resistant alfalfa cultivars after damaged by Acyrthosiphon pisum

豌豆蚜為害3 d后，抗蟲品種三得利、MF4020、皇后、SR4030極顯著高于其它品種(P＜0.01)。為害7 d后，抗蟲品種三得利、MF4020、SR4030極顯著高于其它品種。3個低抗品種酶活性變化極顯著低于其它品種。為害10 d后，苜蓿品種酶活性變化量下降較快，降至豌豆蚜為害后的最低值?？瓜x品種三得利、皇后、皇冠與中抗品種柏拉圖、甘農4號差異不顯著(P＞0.01)，但極顯著高于中抗品種先行者、中苜3號和3個低抗品種。其中抗蟲品種三得利的PPO酶活性變化量在所供試苜蓿品種中一直保持較高的水平，而3個低抗品種酶活性變化量在所有供試品種中一直保持較低水平。

2.3豌豆蚜為害后SOD活性變化

豌豆蚜為害7 d后，所有品種SOD酶活性增加量達最大，為害10 d次之，為害3 d最小(表3)。5個抗蟲品種在豌豆蚜為害期間，酶活性變化量均極顯著高于3個低抗品種(P＜0.01) ;4個中抗品種酶活性增加量介于5個抗蟲品種和3個低抗品種之間(表3)。

豌豆蚜為害3 d后，除三得利外，其余4個抗蟲品種酶活性變化量與柏拉圖差異不顯著(P＞0.01)，但極顯著高于甘農4號、先行者、中苜3號3個低抗品種。三得利酶活性增加量極顯著高于中抗與低抗品種，德寶酶活性增加量最低。為害7 d后，5個抗蟲品種間差異不顯著(P＞0.01)。柏拉圖與甘農4號差異不顯著，但極顯著高于先行者、中苜3號和3個低抗品種。為害10 d后，三得利、MF4020、皇冠極顯著高于其它品種，柏拉圖與甘農4號差異不顯著(P ＞0.01)，但兩者極顯著低于先行者、中苜3號，先行者與中苜3號間差異不顯著(P＞0.01)。

表3 豌豆蚜為害后不同抗性苜蓿品種SOD活性變化量Table 3 SOD activity change amount of various resistant alfalfa cultivars after damaged by Acyrthosiphon pisum

2.4豌豆蚜為害后POD活性變化

所有品種POD酶活性增加量隨豌豆蚜為害時間的延長持續(xù)升高，為害10 d后，POD升高量達到最大，7 d次之，3 d最低(表4)。在為害7和10 d后，5個抗蟲品種增加量均極顯著高于3個低抗品種(P＜0.01)。

豌豆蚜為害3 d后，4個中抗品種POD酶活性變化量處于5個抗蟲品種和3個低抗品種之間。三得利、MF4020極顯著高于除皇后外的其它品種(P ＜0.01)，三得利、MF4020與皇后酶活性變化量差異不顯著(P＞0.01)，驚喜與WL343HQ、德寶間差異不顯著(P＞0.01)，WL343HQ明顯低于這兩個品種。為害7 d后，三得利、皇后和柏拉圖酶活性增加量極顯著高于中抗和低抗其余品種。MF4020、皇冠、SR4030間的酶活性變化量差異不顯著(P＞0.01)，甘農4號、先行者、中苜3號和3個低抗品種間的差異極顯著。為害10 d后，抗蟲品種三得利酶活性變化量極顯著高于其它品種，德寶酶活性變化量極顯著低于其它品種。

2.5豌豆蚜為害后CAT活性變化

所有供試品種的CAT活性均比未接蟲對照下降，為害7 d后下降迅速，為害10 d次之，為害3 d最小。豌豆蚜為害10 d后5個抗蟲品種CAT酶活性下降量均極顯著低于3個低抗品種(P＜0.01)，4個中抗品種CAT酶活性變化量處于5個抗蟲品種和3個低抗品種之間(表5)。

豌豆蚜為害3 d后，5個抗蟲品種與柏拉圖之間CAT酶活性變化量差異不顯著，3個低抗品種之間CAT酶活性變化量差異不顯著(P＞0.01)。為害7 d后，5個抗蟲品種間酶活性變化量差異不顯著(P ＞0.01)，3個低抗品種間差異不顯著(P＞0.01)。為害10 d后，三得利、MF4020酶活性變化量極顯著高于皇冠、SR4030，但與皇后差異不顯著(P＞0.01)。4個中抗品種間CAT酶變化量差異不顯著(P ＞0.01)。3個低抗品種間差異不顯著(P＞0.01)。

表4 豌豆蚜為害后不同抗性苜蓿品種POD活性變化量Table 4 POD activity change amount of various resistant alfalfa cultivars after damaged by Acyrthosiphon pisumm

表5 豌豆蚜為害后不同抗性苜蓿品種CAT活性變化量Table 5 CAT activity change amount of various resistant alfalfa cultivars after damaged by Acyrthosiphon pisum

2.6豌豆蚜為害后營養(yǎng)物質含量變化

可溶性糖含量變化量隨著為害時間的延長無明顯變化規(guī)律(表6)。豌豆蚜為害3 d后，MF4020下降量最大，而德寶下降量最少;為害7 d后，驚喜可溶性糖含量增加量極顯著高于三得利、MF4020、皇后、SR4030、柏拉圖;為害10 d后，接蟲三得利、MF4020、皇后、皇冠、SR4030、柏拉圖、先行者和甘農4號可溶糖含量較未接蟲的對照低，中苜3號和3個低抗品種高于對照，3個抗蟲品種可溶性糖含量變化量極顯著高于其它品種。

豌豆蚜為害期間，所有品種均較同期未接蟲對照可溶性蛋白質含量降低(表7)。為害3 d后，SR4030可溶性蛋白質含量下降量極顯著低于中抗和低抗品種。為害7 d后，三得利、皇后和WL343HQ極顯著高于SR4030、中抗品種及驚喜品種。為害10 d后，三得利、MF4020、皇后、皇冠、SR4030可溶性蛋白質含量變化量極顯著高于其它品種。

表6 豌豆蚜為害后不同抗性苜蓿品種可溶性糖含量變化量Table 6 Soluble sugar content change amount of various resistant alfalfa cultivars after damaged by Acyrthosiphon pisum

表7 豌豆蚜為害后不同抗性苜蓿品種可溶性蛋白質含量變化量Table 7 Soluble protein content change amount of various resistant alfalfa cultivars after damaged by Acyrthosiphon pisum

3 討論與結論

豌豆蚜為害后，所有品種PAL、PPO、POD、SOD活性均有不同程度的增加，5個抗蟲品種的酶活性基本上極顯著高于3個低抗品種，4個中抗品種介于兩者之間。PAL、PPO、POD、SOD活性越高，苜蓿品種抗蚜性越強;所有品種CAT活性均有不同程度的下降，5個抗蟲品種的CAT酶活性均極顯著高于3個低抗品種，4個中抗品種介于兩者之間，CAT活性下降速率越慢，苜?？寡列栽綇?。

豌豆蚜為害3 d后，供試品種的可溶性糖含量都較未接蟲對照下降;為害7 d后，所有品種較對照上升;為害10 d后，3個低抗品種和中苜3號較對照上升，其它品種較對照下降。可溶性糖含量下降量越快，苜?？寡列栽綇?。苜蓿品種體內可溶性蛋白質含量均比未接蟲對照下降。為害3 d、7 d變化無規(guī)律;為害10 d后，5個抗蟲品種可溶性蛋白質含量下降量極顯著高于低抗品種。豌豆蚜為害后可溶性蛋白質含量與抗蚜性關系還需作進一步探討。

在植物與昆蟲的長期協(xié)同進化過程中，植物對害蟲的脅迫可及時作出積極、主動的機體防御，以減少昆蟲對它的危害，為植物自身尋求最適的生存對策［16］。本研究中受豌豆蚜為害后12個不同抗性苜蓿品種防御性酶(PAL、PPO、POD、SOD、CAT)和可溶性糖、可溶性蛋白質含量均發(fā)生了不同程度的變化。

本研究所測定的5種酶是植物次生代謝過程中的關鍵酶。PAL是催化苯丙烷類代謝途徑第一步反應的酶，因為苯丙烷類代謝是植物抗性反應的重要代謝途徑之一，所以PAL是這一途徑的關鍵酶和限速酶［17-20］。植物抗蟲性強弱與該途徑的中間產物(酚類物質)以及終產物(木質素、黃酮、異黃酮類物質)密切相關［20-22］。毛紅等［23］研究表明，綠盲蝽(Apolygus lucorum)取食后抗性棉花品種葉中PAL酶的活性顯著高于感性品種。程璐等［11］研究表明，豌豆蚜為害后，所有苜蓿品種葉片內PAL酶活性隨著時間的增加而升高。本研究中各品種PAL酶活性變化量在豌豆蚜為害3 d、7 d后持續(xù)升高，為害10 d后增加量略有下降。本試驗與程璐等［11］和毛紅等［23］研究結果相一致。由此可見，苜蓿葉片細胞在豌豆蚜為害時不斷進行自我修復［11］，誘導更多酚類、黃酮等對昆蟲有毒物質的生成［23］，以抵抗豌豆蚜的進一步侵害。PPO可催化酚類物質變?yōu)槎拘愿鼜姷孽惢蚱溲苌?，構成保護性屏蔽，直接發(fā)揮抗蟲作用［24］，還與植物體內木質素的合成有關［25］，其活性高低與植物抗蟲性有很大關系［18，24］。研究表明［10，12，26-27］，PPO活性隨著豌豆蚜為害時間的延長而升高，抗蚜性越高的品種PPO酶活性上升越快。本試驗表明，隨著豌豆蚜為害時間的延長，PPO酶活性迅速增強而后趨于平穩(wěn)。豌豆蚜為害刺激后苜蓿葉片迅速促使木質素的合成和積累，增加豌豆蚜取食的難度，抵抗豌豆蚜的為害。POD、SOD、CAT酶是與植物活性氧代謝的相關酶。昆蟲的取食會打破植物體內活性氧代謝系統(tǒng)平衡，體內脂膜過氧化及膜脂脫脂作用啟動，破壞膜結構［28］，引起植物體內POD、SOD、CAT抗氧化酶活性的變化［29］，及時有效地清除體內的活性氧，保護植物體不受傷害。高等植物葉綠體和細胞質中的SOD清除活性氧時形成H2O2，CAT清除H2O2形成H2O和O2［30］; POD可以催化酚類物質氧化，形成由自由基聚合成的木質素，同時也清除H2O2，這3種酶共同作用減輕害蟲對植物造成的傷害［18］。高勇等［31］表明，綠盲蝽為害后，棗樹(Ziziphus jujaba)葉片內SOD活性隨著為害程度的加重先上升后下降; POD活性持續(xù)升高; CAT活性與對照(未受害)之間差異不顯著。本試驗表明，豌豆蚜為害一定時間內各品種SOD和POD活性高于未接蟲對照，CAT活性低于未接蟲對照。說明受豌豆蚜為害時，迅速啟動苜蓿體內的3大保護酶，3種酶彼此協(xié)調共同清除O2－以減少膜脂過氧化的程度，減輕豌豆蚜取食對苜蓿造成的傷害。

一般來說，營養(yǎng)物質是植物生長發(fā)育必不可少的物質。綠色植物具有維持蚜蟲營養(yǎng)所需的成分，植物體內營養(yǎng)物質含量過多或過活及其比率的不平衡使得植物對昆蟲的抗生性產生影響［32］。李進步等［33］研究表明，棉蚜(Aphis gossvpii)的生長發(fā)育與棉花葉片可溶糖含量呈正相關。武德功等［34］表明，感蟲品種和抗蟲品種的可溶性蛋白質含量低于低抗品種。本研究表明，受豌豆蚜為害后，苜蓿體內可溶性糖含量呈先上升后下降趨勢，可溶性蛋白質含量變化無規(guī)律。較低含量的可溶性糖類可導致苜蓿的適口性降低，抑制豌豆蚜的取食。

在豌豆蚜為害苜蓿期間，酶活性的變化和營養(yǎng)物質的含量變化是一個動態(tài)過程，因此，還需進一步研究不同蟲口密度下，在不同時間段保護酶活性和營養(yǎng)物質的動態(tài)以及豌豆蚜取食后苜蓿植株的動態(tài)防御機制。

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(責任編輯 王芳)

Effects of Acyrthosiphon pisum on enzyme activities and nutrients ofdifferent alfalfa varieties

In order to investigate the biochemical mechanisms of alfalfa responses to pest aphid，the defensive enzyme activities and nutrients and their dynamic changes were studied in alfalfa varieties with different aphid resistance which were damaged by Acyrthosiphon pisum.The results showed that the activities of L-phenylalanin ammo-nialyase(PAL)，superoxide dismutase (SOD)，peroxidase (POD) and soluble sugar significantly increased (P＜0.01) within seven days of A.pisum damaged，whereas，the activities of polyphenol oxidase (PPO) and catalase (CAT) significantly declined (P＜0.01) in aphid resistance alfalfa varieties (Santory，MF4020，Queen，Crown，SR4030) compared with low resistance alfalfa varieties (Surprising，WL343HQ，Derby)，middle resistance alfalfa varieties (Platon，Gannong No.4，Pioneer，Zhongmu No.3) are somewhere in between.The soluble protein content changed without regular pattern.

book=145,ebook=149

alfalfa varieties; Acyrthosiphon pisum; hazard stress; defensive enzyme; nutrients

Zhang Rong E-mail: yczhrnx@163.com

S816.11; S551+.7

A

1001-0629(2016) 1-0144-09*

10.11829/j.issn.1001-0629.2015-0283

張洪英，魏淑花，張蓉，苗潤，李克昌，羅曉玲，張宇.豌豆蚜為害對苜蓿品種酶活性和營養(yǎng)物質的影響.草業(yè)科學，2016，33(1) : 144-152.

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2015-05-19 接受日期: 2015-07-02

國家牧草產業(yè)體系——鹽池綜合試驗站(CARS-35-42) ;寧夏回族自治區(qū)農作物重大育種專項——苜蓿新品種選育(2014NYYZ03)

張洪英(1988-)，女，山東壽光人，碩士，主要從事草業(yè)植保研究。E-mail: zhy7515@126.com

共同第一作者:魏淑花(1980-)，女，寧夏吳忠人，助理研究員，碩士，主要從事農業(yè)昆蟲與害蟲防治研究。E-mail: weishuhua666@ 163.com

張蓉(1966-)，女，寧夏中衛(wèi)人，研究員，博士，主要從事農業(yè)昆蟲與害蟲防治研究。E-mail: yczhrnx@163.com

Zhang Hong-ying1，2，Wei Shu-hua1，Zhang Rong1，Miao Run2，Li Ke-chang3，Luo Xiao-ling3，Zhang Yu3

(1.Institute of Plant Protection，Ningxia Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Yinchuan 750002，China; 2.Agriculture College，Ningxia University，Yinchuan 750001，China; 3.Grassland Workstation of Ningxia，Yinchuan 750002，China)