安歡樂，燕 翀，徐 娜，宋雨陽，李彥忠，2

(1.草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點實驗室，蘭州大學草地農(nóng)業(yè)科技學院，甘肅蘭州 730020; 2.中國農(nóng)業(yè)科學院草原研究所，內(nèi)蒙古呼和浩特 010010)

3種鐮刀菌對小扁豆生長的影響

安歡樂1，燕 翀1，徐 娜1，宋雨陽1，李彥忠1，2

(1.草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點實驗室，蘭州大學草地農(nóng)業(yè)科技學院，甘肅蘭州 730020; 2.中國農(nóng)業(yè)科學院草原研究所，內(nèi)蒙古呼和浩特 010010)

小扁豆(Lens culinaris)是甘肅中部地區(qū)普遍栽培的小雜糧之一，既是經(jīng)濟作物，又是輪作倒茬和肥地作物。會寧縣種植的小扁豆近年來死亡嚴重，為查明其死亡原因，開展了田間調(diào)查與病原物研究。2012年，當?shù)匦”舛垢〉陌l(fā)病率為58.4%，死亡率為43.2%，從發(fā)病植株的根部分離出的真菌從形態(tài)學上鑒定為尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)、銳頂鐮刀菌(F.acuminatum)和木賊鐮刀菌(F.equiseti)，分離率分別為55%、18%和9%，以ITS為引物擴展真菌的DNA，測序后構建的系統(tǒng)發(fā)育樹支持以上形態(tài)學鑒定結果。接種試驗結果顯示，此3種鐮刀菌均能顯著(P＜0.05)降低植株的根長和干重，其中尖孢鐮刀菌的影響最大，其次為木賊鐮刀菌，此2種鐮刀菌還顯著降低植株的鮮重和株高，但3種鐮刀菌均未對出苗率和死亡率產(chǎn)生影響(P＞0.05)。在發(fā)病田間采集的土壤中播種小扁豆，與滅菌土壤中栽培的植株相比，未滅菌土壤中植株的根長和根干重顯著降低。3種鐮刀菌對小扁豆菌有致病性，但致病性均不強，干旱可能是導致鐮刀菌在田間危害程度加大的主要原因。

小扁豆;鐮刀菌;鑒定;致病性測定

小扁豆(Lens culinaris)又名濱豆、雞眼豆、眉豆等，富含蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、纖維素、維生素和抗氧化物化合物，栽培歷史已有8 000～12 000年，是許多發(fā)展中國家主要的蛋白質(zhì)來源［1-2］。在我國，小扁豆是小雜糧作物的一種，主要栽培于陜西、甘肅、寧夏、山西、內(nèi)蒙古、云南和西藏等省(區(qū))［3］。甘肅省會寧縣有悠久的種植雜糧作物歷史，享有“中國小雜糧之鄉(xiāng)”的美稱。

世界上小扁豆的主要葉部病害有殼二孢葉枯病(Ascochyta lentils)、炭疽病(Colletotricum lindemuthianum)、葡萄孢灰霉病(Botrytis cinerea)、鏈格孢枯萎病(Alternaria alternata)等，小扁豆根腐病也是影響產(chǎn)量的重要病害，其病原菌有立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)、齊整小核菌(Sclerotium rolfsii)、鐮刀菌(Fusarium spp.)、核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)、豌豆根腐絲囊菌霉(Aphanomyces euteiches)、瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)、根串珠霉(Thielaviopsis basicola)、甘薯絲核菌(Rhizoctonia bataticola)［4-6］。

小扁豆生長期間植株死亡，造成較大損失。但對其死亡原因研究較少，其中張彥梅和李敏權［7］于2007年報道甘肅省定西地區(qū)小扁豆死亡的原因為鐮刀菌根腐病(Fusarium spp.)，優(yōu)勢種為尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)。在甘肅中部地區(qū)，豌豆(Pisum sativum)在開花前后大量死亡的情況最早始于2000前，后來由于病害的發(fā)生，各地陸續(xù)減少了種植面積，目前已極少種植。近年來，在會寧等甘肅中部地區(qū)扁豆死亡的情況逐年加劇，已有不少農(nóng)民放棄了種植。對于甘肅豌豆死亡的原因，前人分析主要是由腐皮鐮孢(F.solani)、鏈孢粘帚霉(Gliocladium catenulatum)、豌豆根腐絲囊菌霉(A.euteiches)、根串珠霉、立枯絲核菌、尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)、腐霉(Pythium spp.)、殼二孢(Ascochyta spp.)等病原菌引起的［8-9］。由于我國記錄的小扁豆根腐病的病原種類較少，除鐮刀菌根腐病之外，其他均未報道。為確定小扁豆死亡的原因是否為病原菌所致，如果是病原菌，是何種病原菌，因此在甘肅會寧開展田間調(diào)查與病原菌的研究。

1 材料和方法

1.1研究地點

病害調(diào)查與標本采集在甘肅省會寧縣翟所鄉(xiāng)觀音村楊岔社進行，該地屬典型黃土高原地區(qū)。

1.2供試土壤和植物材料

用兩種土壤培養(yǎng)小扁豆幼苗供接種所用，其一取自甘肅省會寧縣小扁豆發(fā)病樣地，采用五點取樣，每點取0―10 cm的土約500 g，帶回實驗室后用2 mm孔徑的篩子剔除植物秸稈和大塊土石，將細碎的土粒置于冷藏箱4℃保存?zhèn)溆?，其二為購自花市的土壤，按黑壤土、腐熟牛糞和植株腐殖質(zhì)7∶2∶1的比例混合而成。小扁豆種子為2012年在會寧當?shù)夭墒账?，品種不詳。

1.3田間調(diào)查與標本采集

于2012年6月于小扁豆結莢中期在研究地按如下方法開展病害調(diào)查:選取3塊扁豆地，采用“Z”型調(diào)查，每塊地共調(diào)查5個點，每地選1 m2，統(tǒng)計植株總數(shù)和死亡植株數(shù)，按如下公式計算死亡率:

同時在各樣點上隨機挖取帶根的植株10株，將植株帶回室內(nèi)供分離病原。

1.4根腐植株統(tǒng)計與病原分離

1.4.1根腐植株統(tǒng)計 將帶回的小扁豆根部剪下，將根部在自來水下沖洗干凈，觀察根部是否變色腐爛，有變色者記為發(fā)生根腐病的植株，并計算根腐病的發(fā)病率:

1.4.2病原分離 將洗凈的根部，用70%酒精消毒1 min，然后用1%的次氯酸鈉消毒3 min，再用無菌水洗3次，用滅菌的濾紙吸干表面水分，將其切成0.5 cm長的小段，均勻擺放在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)上，在22℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d后統(tǒng)計組織小塊上長出各種真菌的種類及數(shù)量，純化所有分離菌，于第7天再次統(tǒng)計一次，校正首次統(tǒng)計的結果，根據(jù)每種菌在組織小塊上出現(xiàn)的次數(shù)計算其分離率。PDA培養(yǎng)基的制作方法為:稱200 g去皮的土豆，加入1 000 mL蒸餾水，煮沸30 min，雙層紗布過濾，濾液清液中加入17 g瓊脂粉和20 g葡萄糖，緩緩加入蒸餾水然后定容1 000 mL，121℃下滅菌30 min，再將培養(yǎng)皿倒入培養(yǎng)皿(9 cm)中，每個培養(yǎng)皿中25 mL，制成平板［10］。

1.5菌株鑒定

1.5.1形態(tài)學鑒定 根據(jù)菌落和孢子及其產(chǎn)孢結構的形狀、顏色和大小鑒定菌種［11］。

1.5.2分子方法鑒定 用真菌DNA提取試劑盒(型號為D3195-1)提取3種菌的DNA，用引物ITS1 (AGGAGAGTCGTAACAAGGT )和ITS4 (TCCTCCGCTTATTGATATGC)進行PCR擴增，將PCR產(chǎn)物委托上海生工生物有限公司測序。將測得的序列進行BLAST比對并用MEGA5.1軟件系統(tǒng)發(fā)育樹，確定其與所選的菌種的親緣關系［12］。

1.6分離出真菌的致病性測定

1.6.1接種幼苗的準備 挑選顆粒飽滿的小扁豆種子，經(jīng)常規(guī)表面消毒后擺放在鋪有兩層滅菌濾紙的培養(yǎng)皿中，每皿擺放100粒，加無菌水3～5 mL，放置在25℃下使之發(fā)芽，發(fā)芽后用于接種。

1.6.2孢子懸浮液的配制 將培養(yǎng)2周的分離物每皿加滅菌蒸餾水5 mL，用滅菌的載玻片輕輕刮下孢子，用雙層滅菌紗布過濾，將濾液搖勻制成孢子懸浮液，用血球計數(shù)板測量孢子的濃度，將孢子濃度調(diào)節(jié)為106·mL－1后用于接種之用。

1.6.3接種及接種后測定指標 采用植物幼苗蘸真菌孢子懸浮液的接種方法，即將小扁豆的幼苗在真菌孢子懸浮液中浸泡30 min后移栽到裝有滅菌土壤的紙杯中。共接種3種真菌，每種真菌設5個重復(杯)，以幼苗蘸無菌水作為空白對照，對照5個重復(杯)。接種后移栽于裝有200 g滅菌土壤的紙杯中，每杯3株，紙杯口徑7 cm，底部開孔。接種后將幼苗放置在22℃的光照植物培養(yǎng)箱中。6周后觀察發(fā)病情況，并收獲植株，清洗每株植株的根部，測量株高和根長，挑選部分植株用于接種菌的再分離，分離方法同1.4.2。稱鮮重后在65℃烘箱中烘24 h，稱干重。

1.7田間土壤帶菌試驗

將采集于小扁豆死亡田間土壤分成兩部分，一部分在167℃的烘箱中滅菌4 h后播種小扁豆，另一部分土壤不經(jīng)滅菌直接播種小扁豆。設5個重復(紙杯)，每重復(紙杯)播種5粒小扁豆種子，播種后管理和測定指標同1.6.3。

1.8數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0軟件對所測數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，用平均值和標準誤表示測定結果，分別對株高和根長，烘干后測定單株干重進行單因素方差分析，并用新復極差法對各測定數(shù)據(jù)進行多重比較，采用Excel 2003制圖。

2 結果與分析

2.1田間發(fā)病癥狀、發(fā)病率與死亡率

在田間，小扁豆植株底部的葉片開始退綠變黃，并向上延伸至整個植株(圖1A)，發(fā)病植株的根部呈紅褐色至黑色，根瘤極少(圖1B)。大量植株死亡，死亡植株多發(fā)生于地塊邊緣(圖1C，D)。田間根腐病的平均發(fā)病率為58.4%，平均死亡率為43.2%。

2.2病原分離

從田間采集的小扁豆的根部主要分離出3種真菌，菌株編號分別為yanch1、yanch3和yanch2，分離率分別為55%、18%和9%(圖2)。

2.2.1形態(tài)學鑒定 根據(jù)形態(tài)特征初步鑒定分離出的3種真菌均為鐮刀菌。yanch1在PDA上生長迅速，菌落灰白，絨狀且菌絲中間致密周圍稀疏，小型分生孢子數(shù)量較多，卵形或腎形，沒有隔膜，有厚垣孢子產(chǎn)生。yanch2在PDA上生長迅速，氣生菌絲茂密，初生菌絲白色，隨著培養(yǎng)時間的不斷延長菌絲顏色逐漸由白色變化為粉紅色，大型分生孢子為鐮刀形，沒有小型分生孢子。yanch3在PDA上生長迅速，菌絲白色絮狀，不形成小型分生孢子;大型分生孢子較為彎曲，頂胞鉤狀，厚垣孢子團狀或鏈狀。根據(jù)形態(tài)學鑒定，yanch1為尖孢鐮刀菌，yanch2為銳頂鐮刀菌(F.acuminatum)，yanch3為木賊鐮刀菌(F.equiseti)。

2.2.2分子鑒定 將3種鐮刀菌的序列與其它已有的鐮刀菌的序列用MEGA5.1進行分析，做系統(tǒng)發(fā)育樹。系統(tǒng)發(fā)育樹結果(圖3)顯示，yanch2與F.acuminatum聚在一個枝上，其自展值為84; yanch3 與F.equiseti聚在一個枝上，自展值為99; yanch1與F.oxysporum聚在一個枝上，自展值為82。故根據(jù)分子方法鑒定出3種鐮刀菌與形態(tài)學鑒定的結果相吻合。

2.3致病性測定

2.3.1 3種鐮刀菌致病性測定 接種3種鐮刀菌6周后，與對照相比較，接種的3種鐮刀菌的小扁豆植株無退綠變黃，根部并未出現(xiàn)明顯的變黑或者變褐等田間癥狀，但是其植株的高度和根系的形狀有所不同。從接種小扁豆植株的根部分離出接種菌，尖孢鐮刀菌、銳頂鐮刀菌、木賊鐮刀菌的再分離率分別為83.2%、8.4%和6.9%。

圖1 小扁豆田間發(fā)病癥狀和根部觀察Fig.1 Lentil field symptoms and root observation

圖2 小扁豆根部分離出真菌Fig.2 Fungi isolated from lentil roots

2.3.2對植株生長的影響 尖孢鐮刀菌顯著降低植株鮮重(P＜0.05)，其次為木賊鐮刀菌，而接種銳頂鐮刀菌的植株的鮮重與對照之間差異不顯著(P＞0.05)(圖5)。接種3種鐮刀菌后，植株的干重顯著低于對照。木賊鐮刀菌和尖孢鐮刀菌均使植株的株高顯著降低，而接種銳頂鐮刀菌對株高無顯著影響。接種3種鐮刀菌均顯著降低植株的根長，其中尖孢鐮刀菌影響最大，其次為木賊鐮刀菌，最后為銳頂鐮刀菌(圖4)。

2.4病土栽培

與滅菌土壤相比，未滅菌土壤植株的根長(圖5)、根鮮重和根干重(表1)顯著(P＜0.05)降低，但株高、地上鮮重和地上干重未滅菌和滅菌土壤差異不顯著。

3 討論與結論

國內(nèi)外已有研究的小扁豆上的鐮刀菌有尖孢鐮刀菌、銳頂鐮刀菌、木賊鐮刀菌、燕麥鐮刀菌(F.avenaceum)、黃色鐮刀菌(F.culmorum)、腐皮鐮刀菌、串珠鐮刀菌7種［7，13］。張彥梅和李敏權［7］曾對甘肅省定西的小扁豆根腐病進行研究，結果顯示，其病原菌為尖孢鐮刀菌、茄鐮刀菌、串珠鐮刀菌和木賊鐮刀菌，其中尖孢鐮刀菌為優(yōu)勢種，本試驗分離的鐮刀菌為尖孢鐮刀菌、銳頂鐮刀菌、木賊鐮刀菌。鐮刀菌為土壤習居菌，普遍存在于土壤中，所分離到的鐮刀菌與國內(nèi)外有所不同，故當?shù)厥欠翊嬖谄渌牭毒杏写M一步研究。

本研究分離出的3種鐮刀菌在室內(nèi)接種試驗中均未造成小扁豆死亡，但對小扁豆的株高、根長、單株鮮重及單株干重都有一定影響。病土栽培試驗中，土壤中的鐮刀菌對小扁豆的根系生長有影響。在根腐病發(fā)病率統(tǒng)計時，觀察到小扁豆根系較小，幾乎觀察不到根瘤。試驗結果說明當?shù)赝寥乐械溺牭毒鷮π”舛咕哂星秩玖?，但致病性較弱，影響了植株的生長卻未造成植株死亡，故田間小扁豆死亡不是鐮刀菌單因素引起的，可能還有其他因素的影響。

圖3 基于小扁豆根部分離出鐮刀菌構建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on Fusarium spp.isolated from lentil root

圖4 分離出的3種鐮刀菌對小扁豆生長的影響Fig.4 Effects of 3 fusariums isolated to lentils growth

圖5 采集田間病土栽培結果Fig.5 The result of cultivation in field soil with pathogen

研究［14］表明，低溫、干旱、高溫、營養(yǎng)物質(zhì)缺乏、營養(yǎng)物質(zhì)毒性等都是小扁豆非生物脅迫的主要因素，其中水分和溫度被認為是最主要的脅迫因素，包括是過度干旱、土壤水分過多、溫度過低、溫度過高等［15］。小扁豆適宜于年降水量155～483 mm的地區(qū)［16-17］，而會寧縣的四季分明，晝夜溫差大，夏季炎熱高溫，日照較強，年平均氣溫12.15℃，7月份平均氣溫24℃，年降水量僅在340 mm左右，且分布不均勻，主要集中在7－9月，年蒸發(fā)量卻高達1 800 mm［18］。據(jù)此，增加根部深度可以作為減少干旱脅迫的一種方式［14］。會寧當?shù)? －7月小扁豆處于開花結莢期，消耗水分多，但此時降雨少、氣溫高、光照強，可引起小扁豆代謝水分的機能下降。就鐮刀菌而言，干旱反而有利于其生長，因為土壤中的鐮刀菌屬好氧型的，在干燥的土壤環(huán)境中生長比較活躍，土壤干燥比土壤濕潤更有利于該菌生存［19］。Stover［20］研究6種鐮刀菌最適合生長的土壤條件為土壤水分飽和度的15%。在會寧小扁豆根部的鐮刀菌中，尖孢鐮刀菌為優(yōu)勢種，該菌是世界范圍內(nèi)小扁豆萎蔫病的主要菌種，可發(fā)生于小扁豆的整個生長時期。據(jù)報道，20～25℃的土壤溫度有利于該菌生長，但較強光照和較高溫度增強了植株的蒸騰作用，故夏季高溫是決定癥狀的關鍵因素［21］。

表1 病土對小扁豆生長影響Table 1 Effects of filed soil with pathogen to lentils growth

鐮刀菌不僅影響小扁豆植株的生長，而且影響根瘤菌的形成，使病株根部的根瘤數(shù)量下降，從而影響植株的生長和產(chǎn)量［22-23］。研究表明，根瘤菌通過其固氮作用、根瘤菌和苜蓿共生免疫作用、對植物自身組成變換或其生理應答機制進行改變從而提高苜蓿的抗旱、耐鹽、抗高溫及非機械損傷等非生物脅迫能力［24］。本試驗觀察到小扁豆根系上根瘤菌的數(shù)量很少，故根瘤菌的不正常生長影響小扁豆抗逆性和氮素的固定。根瘤菌可以提供小扁豆生長的3 /4的氮素，也通過共生作用能增強植物抗逆性［25］，根瘤菌結瘤受到阻礙，小扁豆的氮素供應不足并且抗逆性減弱，影響小扁豆有機物的積累及根系的生長，進而影響其在干旱條件下吸收深層土壤的水分，同時利于病原菌的侵入。

本研究對甘肅省會寧縣小扁豆的死亡進行調(diào)查研究結果顯示，所分離到的3種鐮刀菌對小扁豆致病性弱，對小扁豆生長有影響，病土栽培試驗及小扁豆根部根瘤菌的生長狀況進一步印證鐮刀菌對小扁豆根部有影響，但是鐮刀菌并未造成小扁豆死亡。會寧當?shù)貧夂驐l件適宜土壤中鐮刀菌的生長，對小扁豆的生長存在脅迫因素，同時鐮刀菌的生長抑制根瘤菌的生長，從而減弱了植株的抗逆性。病原菌和干旱共同作用下小扁豆遇到高溫天氣可能是導致當?shù)匦”舛垢“l(fā)生的原因，這還需要進一步的研究驗證。

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(責任編輯 王芳)

Effects of three Fusarium spp.on the growth of lentil in Huining County，Gansu Province

An Huan-le1，Yan Chong1，Xu Na1，Song Yu-yang1，Li Yan-zhong1，2
(1.College of Pastoral Agriculture Science and Technology，Lanzhou University，State Key Laboratory of Grassland Agro-ecosystems，Lanzhou 730020，China; 2.Institution of Grassland Research of CAAS，Hohhot 010010，China)

Lentil is one of the widely planted crops in the center areas of Gansu Province as economic，rotation and soil-fertilized plant.However，death of lentil is very serious in Huining County in recent years.The field investigation，isolation and identification of causal agent were conducted to determine the reasons of plant death.In 2012，incidence of lentil root rot was 58.4%，and mortality was 43.2%.Fungi isolated from the roots of diseased plants were morphologically identified as Fusarium oxysporum，F(xiàn).acuminatum and F.equiseti，which were consistent with the phylogenetic tree based on ITS sequence.Isolation frequency of these fungi was 55%，18% and 9%，respectively.In the inoculation experiment，the root length and root dry weight of host inoculated with all 3 fungi significantly (P ＜0.05) decreased in which the host with F.oxysporum decreased most and the host with F.equiseti decreased more.The fresh weight and plant height of host inoculated with F.oxysporum and F.equiseti also decreased.However，the emergence and survival rates of host inoculated with all 3 fungi were not affect (P＞0.05).The soils were collected from lentils fields in Huining as plants growth medium.Compared with plants grown in autoclaved soil，root length and root dry weight of plant grown in no-autoclaved soil significantly (P＜0.05) decreased.In conclusion，3 Fusarium species were weak pathogenic to lentils.Drought possible was the main reason for these Fusarium species causing serious death on lentils.

Lens culinaris; Fusarium spp.; identification; pathogenicity

Li Yan-zhong E-mail: liyzh@ lzu.edu.cn

S520.8; S435.2

A

1001-0629(2016) 1-0067-08*

10.11829/j.issn.1001-0629.2015-0038

安歡樂，燕翀，徐娜，宋雨陽，李彥忠.3種鐮刀菌對小扁豆生長的影響.草業(yè)科學，2016，33(1) : 67-74.

An H L，Yan C，Xu N，Song Y Y，Li Y Z.Effects of three Fusarium spp.on the growth of lentil in Huining County，Gansu Province.Pratacultural Science，2016，33(1) : 67-74.

2015-01-16 接受日期: 2015-11-03

國家自然科學基金(31272496) ;公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項經(jīng)費項目(201303057) ;國家牧草產(chǎn)業(yè)技術體系(CARS-35)

安歡樂(1989-)，女，陜西永壽人，在讀碩士生，主要從事植物病理學研究。E-mail: anhl13@ lzu.edu.cn

李彥忠(1969-)，男，甘肅會寧人，教授，博士，主要從事植物病理學研究。E-mail: liyzh@ lzu.edu.cn

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