雷婭紅，況衛(wèi)剛，鄭春生，汪萬春，李春杰，高文娜

(1.草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅蘭州 730020;2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，北京 100193; 3.北京出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，北京 101312)

進(jìn)境草種種帶真菌的檢測與初步鑒定

雷婭紅1，況衛(wèi)剛2，鄭春生3，汪萬春3，李春杰1，高文娜3

(1.草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅蘭州 730020;
2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，北京 100193; 3.北京出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，北京 101312)

采用平皿測定法對(duì)我國北京口岸2014年進(jìn)境草種高羊茅(Festuca arundinacea)、多年生黑麥草(Lolium perenne)和蘇丹草(Sorghum sudanense)攜帶真菌進(jìn)行分離培養(yǎng)，利用ITS4和ITS5引物對(duì)其內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Internal Transcribed Spacer，ITS)進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物純化后測序并與數(shù)據(jù)庫中的已知序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，對(duì)種帶真菌進(jìn)行初步鑒定。研究結(jié)果表明，不同來源種子攜帶真菌種類差異較大，從5個(gè)國家的7個(gè)進(jìn)境草種批次中共檢測出13屬21種48株真菌，主要菌群為鐮刀菌屬(Fusarium spp.)、曲霉屬(Aspergillus spp.)、莖點(diǎn)霉屬(Phoma spp.)和鏈格孢屬(Alternaria spp.)?；贗TS序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，能夠?qū)⑺蟹蛛x到的真菌鑒定到屬，但是在種水平上鑒定有限，不能將細(xì)極鏈格孢(Alternaria tenuissima)、細(xì)交鏈孢(A.alternata)和喬木鏈格孢(A.arborescens)很好地區(qū)分開。本研究明確了5個(gè)來樣量較大國家的草種帶菌情況，ITS基因能夠運(yùn)用于口岸草種攜帶真菌的初步檢測鑒定。

進(jìn)境草種;種帶真菌; ITS;鑒定

本研究利用ITS基因結(jié)合形態(tài)學(xué)系統(tǒng)性地對(duì)我國來樣量較大的5個(gè)國家的幾個(gè)重要草種種帶真菌進(jìn)行了檢測鑒定，旨在明確我國進(jìn)出境口岸草種的帶菌情況，對(duì)草種質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)，為客戶購買提供參考和指標(biāo)，為快速通關(guān)提供技術(shù)支持，為進(jìn)出境檢疫管理部門提供執(zhí)法依據(jù)。

1 材料和方法

1.1研究材料

1.1.1供試草種 2014年7個(gè)草種批次，來源于美國、新西蘭、澳大利亞和丹麥的多年生黑麥草(Lolium perenne)，來源于美國的高羊茅(Festuca arundinacea)以及來源于加拿大的蘇丹草(Sorghum sudanense)，由北京出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心提供，材料詳細(xì)信息如表1所示。

表1 進(jìn)境牧草種樣Table 1 The imported grass samples used in this study

1.1.2主要試劑和儀器 ABPDA(Antibiotic Potato Dextrose Agar，含抗生素青、鏈霉素各100 mg·L－1的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基) ;植物基因組試劑盒，1×TAE電泳緩沖液購自天根生化; DL2000 Marker購自寶生物(大連)工程有限公司。

培養(yǎng)箱為日本三洋公司生產(chǎn)的WE52B5-959 型; Olympus BX51顯微鏡; PCR儀，凝膠成像系統(tǒng)分別為美國伯樂公司生產(chǎn)的icycler thermal cyci型和Universal HoodII型。

1.2草種種帶真菌檢測

每個(gè)種子批次隨機(jī)取200粒草種，不經(jīng)表面消毒，直接均勻地?cái)[放于ABPDA平板培養(yǎng)基上，每皿10

隨著我國農(nóng)牧業(yè)和草業(yè)種植結(jié)構(gòu)的調(diào)整，牧草種子需求量連年上升，供求嚴(yán)重失衡［1］，黑麥草屬(Lolium)和早熟禾屬(Poa)等屬草種進(jìn)口量總體大幅度增長［2］，草種進(jìn)口量的增長使得其攜帶病原真菌的機(jī)率大大提高，很多病原菌對(duì)種子發(fā)芽、種苗活力都有一定的負(fù)作用，嚴(yán)重影響農(nóng)業(yè)發(fā)展，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。如細(xì)交鏈孢(Alternaria alternata)、鐮刀菌屬(Fusarium spp.)、莖點(diǎn)霉屬(Phoma spp.)等病原真菌都可引起黑麥草(L.perenne)及高羊茅(Festuca arundinacea)等草坪草發(fā)生病害，造成一定的經(jīng)濟(jì)損失［3-4］。真菌病害引起的各種葉枯、葉斑、腐爛、壞死等癥狀嚴(yán)重影響草坪質(zhì)量和美觀［5］。近幾年來，北京口岸入境草種數(shù)量連續(xù)位居全國第一，據(jù)統(tǒng)計(jì)從2009年到2013年，北京口岸入境草種總量近7.5萬t，如此大規(guī)模草種通過口岸入境給檢驗(yàn)檢疫帶來巨大壓力，因此，對(duì)進(jìn)境草種進(jìn)行病原真菌快速檢測至關(guān)重要，同時(shí)對(duì)檢測出的真菌進(jìn)行準(zhǔn)確分類，也是深入開展我國進(jìn)出境口岸檢疫性工作的必要前提和基礎(chǔ)?？诎稒z疫主要采用傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)方法對(duì)病原菌進(jìn)行檢測鑒定，缺乏有效高通量的檢測手段，難以滿足日益增長的檢疫要求。目前內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Internal Transcribed Spacer，ITS)基因已被廣泛用于真菌分類及鑒定［6-8］，在真菌中整體的識(shí)別成功率可以達(dá)到72%［9］。ITS基因在不同物種間存在豐富的變異，為病原菌的分類鑒定及系統(tǒng)發(fā)育等研究提供了十分重要的依據(jù)，而且為建立病原菌的分子監(jiān)測與疫病的快速診斷技術(shù)奠定了基礎(chǔ)，對(duì)植物病害的防治具有重要意義［10］。粒，5皿為一重復(fù)，共設(shè)4個(gè)重復(fù)，于25℃黑暗條件下培養(yǎng)，每天進(jìn)行觀察，挑取真菌菌絲到新鮮PDA平板中進(jìn)行純化保存、鏡檢［11］。參考《真菌鑒定手冊(cè)》［12］，利用分子生物學(xué)技術(shù)結(jié)合真菌形態(tài)特征觀察進(jìn)行初步鑒定，并計(jì)算每種菌的分離率。

1.3種帶真菌DNA提取

分離純化的真菌在ABPDA培養(yǎng)基培養(yǎng)14 d后，采用天根生化植物基因組試劑盒提取各種帶真菌DNA。具體步驟為:取約100 mg新鮮菌絲加入液氮充分碾磨;迅速轉(zhuǎn)移到預(yù)先裝有700 μL 65℃預(yù)熱緩沖液GP1的離心管中，顛倒混勻后，65℃水浴20 min;加入700 μL氯仿，充分混勻，12 000 r·min－1離心5 min;取上層水相置新的離心管中，加入700 μL緩沖液GP2;混勻后，轉(zhuǎn)入吸附柱CB3中，12 000 r·min－1離心30 s，棄廢液;向CB3中加入500 μL緩沖液GD，12 000 r·min－1離心30 s，棄廢液，將CB3放入收集管中;向CB3中加入600 μL漂洗液PW，12 000 r·min－1離心30 s，棄廢液;重復(fù)上次步驟;將CB3放回收集管中，12 000 r·min－1離心2 min，棄廢液;將CB3置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液，轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50～200 μL洗脫緩沖液TE，室溫放置2～5 min，12 000 r ·min－1離心2 min，將溶液收集到離心管中，于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 PCR擴(kuò)增和測序

利用真菌ITS通用引物對(duì)ITS4 (5’TCCTCCGCTTATTGATATGC 3’)和ITS5 (5’GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG 3’)［13］進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25 μL，含2×Taq PCR MasterMix溶液(天根生化)，各引物(濃度10 μmol·L－1) 1 μL，模板2 μL，補(bǔ)充ddH2O至25 μL。擴(kuò)增程序?yàn)? 94℃預(yù)變性5 min; 94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸1 min，34個(gè)循環(huán); 72℃延伸7 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，點(diǎn)樣5 μL，用1×TAE電泳緩沖液在100 V的電場下電泳30 min左右，然后利用紫外凝膠成像儀觀察照相并分析。PCR產(chǎn)物切膠回收送樣上海英俊公司進(jìn)行測序，所有序列提交至Genbank數(shù)據(jù)庫(http: / / www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank)。

1.5種帶真菌ITS序列分析與系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

對(duì)測序結(jié)果中堿基序列和序列峰圖進(jìn)行分析，利用DNASTAR軟件包中的SeqMan對(duì)所獲得的序列進(jìn)行校對(duì)拼接。利用BioEdit軟件［14］對(duì)每個(gè)堿基逐一進(jìn)行人工校對(duì)，保證序列信息的準(zhǔn)確可靠性。峰形混亂的低質(zhì)量序列，重新進(jìn)行測序以獲得高質(zhì)量的DNA序列。經(jīng)校對(duì)的序列用Clustal X［15］軟件進(jìn)行序列比對(duì)。序列比對(duì)結(jié)果輸入MEGA5.2軟件，用鄰接法(neighbor-joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)行1 000次重抽樣計(jì)算系統(tǒng)樹中節(jié)點(diǎn)的置信度。

2 結(jié)果

2.1進(jìn)境草種攜帶的真菌

經(jīng)分離培養(yǎng)，利用ITS序列結(jié)合形態(tài)學(xué)特征觀察從7個(gè)進(jìn)境草種批次中共檢測出13屬21種48個(gè)菌株。不同草種攜帶的真菌種類差異較大，加拿大蘇丹草(J-1)和丹麥多年生黑麥草(D-1)主要攜帶球狀莖點(diǎn)霉(P.glomerata)，分離率分別為36.3%和40.0%;澳大利亞多年生黑麥草(A-1)主要攜帶出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)，分離率為28.5%;美國多年生黑麥草(M-1)主要攜帶浸染鏈格孢(A.infectoria)，分離率為37.5%;美國多年生黑麥草(M-2)主要攜帶雙隔膜德雷克斯孢菌(Drechslera biseptata)，分離率為33.3%;新西蘭多年生黑麥草(X-1)主要攜帶黑附球菌(Epicoccum nigrum)，分離率為50%;美國高羊茅(G-1)僅攜帶亮白曲霉(A.candidus)，分離率為100%(表2)。

2.2種帶真菌形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

分離純化的種帶真菌在ABPDA培養(yǎng)基培養(yǎng)14 d后，利用單反數(shù)碼相機(jī)拍攝菌落形態(tài)照片，采用O-lympus BX51顯微鏡觀察孢子形態(tài)，圖1和圖2分別為部分種帶真菌菌落和孢子形態(tài)特征。

2.3種帶真菌ITS-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測結(jié)果

采用ITS4和ITS5引物擴(kuò)增純培養(yǎng)的種帶真菌的ITS序列，部分?jǐn)U增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果如圖3所示，可看到擴(kuò)增條帶清晰明亮、無拖尾和雜帶現(xiàn)象，且各產(chǎn)物長度大約為500 bp，擴(kuò)增效果良好，說明樣品符合測序要求。

2.4系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

測序所得結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性比對(duì)，BLAST結(jié)果表明，各樣品與數(shù)據(jù)庫中屬、種的相似度在98%以上，能夠?qū)⒅︽呙?Cladosporium spp.)、鐮刀菌(Fusarium spp.)、曲霉(Aspergillus spp.)、莖點(diǎn)霉(Phoma spp.)、鏈格孢(Alternaria spp.)和德氏霉(Drechslera spp.)等真菌鑒定到屬。進(jìn)一步采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，所有的菌株均由本研究分離獲得，如圖4所示，不同的種均位于不同的末端分支，同一個(gè)種的菌株都不同程度地聚在一起，但是對(duì)于種的鑒定能力有一定的局限，不能將細(xì)極鏈格孢(A.tenuissima)、細(xì)交鏈孢(A.alternata)和喬木鏈格孢(A.arborescens)等區(qū)分開。圖4中系統(tǒng)發(fā)育樹內(nèi)容依次為本研究真菌編號(hào)、Genbank登錄號(hào)以及真菌拉丁名。

表2 草種種帶真菌種類及分離率(%)Table 2 The percentage frequency(%) of fungi species isolated from seed samples

3 討論與結(jié)論

目前DNA條形碼技術(shù)廣泛運(yùn)用于物種的檢測鑒定研究中，國內(nèi)外學(xué)者對(duì)真菌條形碼技術(shù)也進(jìn)行了大量研究，在真菌分類鑒定工作方面也取得了突破性的進(jìn)展［16］。由于真菌在ITS區(qū)大小合適、引物通用性強(qiáng)，擴(kuò)增成功率高、便于高通量測序［17］，以及ITS在真菌物種之間有廣泛的序列多態(tài)性等特點(diǎn)，使得ITS序列適合于真菌物種的分子鑒定和物種屬間或種間差異較明顯的菌群間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析［9］，在2011年國際真菌DNA條形碼工作會(huì)議上，ITS基因被確定為真菌鑒定的通用條形碼。

本研究通過對(duì)草種攜帶真菌進(jìn)行分離培養(yǎng)，利用分子生物學(xué)技術(shù)同時(shí)結(jié)合形態(tài)學(xué)方法鑒定出13 屬22種48株種帶真菌，來源不同的草種帶菌情況差異較大，主要包括枝孢霉、鐮刀菌、莖點(diǎn)霉、德氏霉、鏈格孢、輪枝菌、曲霉等真菌，明確了我國口岸引自5個(gè)國家7個(gè)草種攜帶真菌情況，為檢疫部門對(duì)于草種攜帶真菌檢測提供了理論依據(jù)?；贗TS基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)，結(jié)果表明不同屬的真菌獨(dú)立形成一枝，ITS對(duì)于不同的屬有較好的鑒別能力。但是在種水平上鑒定能力有限，在Alternaria spp.形成的獨(dú)立分支中，A.tenuissima，A.alternata和A.infectoria親緣關(guān)系較近聚在一起，這與李永等［18］研究結(jié)果一致，ITS不能將鏈格孢屬親緣關(guān)系較近的29個(gè)小孢子種區(qū)分開。后續(xù)研究需進(jìn)一步結(jié)合DNA條形碼技術(shù)篩選出合適的基因?qū)ζ溥M(jìn)行檢測鑒定，或利用多基因聯(lián)合分析，如Pryor和Bigelow［19］利用ITS、甘油醛-3-磷酸(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，gpd)和線粒體小亞基核糖體(mitochondrial small subunit rDNA，mtSSU) 3個(gè)基因聯(lián)合分析，對(duì)鏈格孢屬21個(gè)種進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。

圖1 ABPDA培養(yǎng)基種帶真菌菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of fungal species on ABPDA

圖2 ABPDA培養(yǎng)基種帶真菌孢子形態(tài)Fig.2 Microconidia morphology of fungal species on ABPDA

圖3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳Fig.3 Agrarose gel electrophoresis results of PCR products

圖4 基于ITS序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Neighbor-joining trees based on ITS sequences

外界環(huán)境條件適宜時(shí)，種子攜帶真菌可能對(duì)植物健康生長產(chǎn)生嚴(yán)重的影響，對(duì)我國草業(yè)生產(chǎn)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失，有研究表明，草種攜帶的德氏霉屬(Drechslera spp.)、鐮刀菌屬(Fusarium spp.)、莖點(diǎn)霉屬(Phoma spp.)等真菌能夠侵染草坪草，造成較為嚴(yán)重的危害［20-21］，鐮刀菌屬、鏈格孢屬(Alternaria spp.)、曲霉屬(Aspergillus spp.)影響草種的萌發(fā)和出苗生長，是許多草類苗期病害的病原，也是某些重要病害的初侵染源之一，在生產(chǎn)安全上不容忽視［22-23］?？兹鸱迹?4］對(duì)蘇丹草種子和幼苗進(jìn)行致病性測定發(fā)現(xiàn)，大斑德氏霉(D.turcnica)、禾谷鐮刀菌(F.graminearum)和燕麥鐮刀菌(F.avenaceum)等分離自8個(gè)蘇丹草品種上的病原真菌顯著降低了種子發(fā)芽率、根長和苗長。本研究通過分離培養(yǎng)獲得了鐮刀菌、莖點(diǎn)霉、曲霉、輪枝菌及枝孢霉等真菌，但尚未對(duì)分離的真菌進(jìn)行致病性測定，有待后續(xù)進(jìn)一步完善。

研究結(jié)果表明，ITS序列能夠有效地對(duì)真菌檢測鑒定，可以應(yīng)用于口岸進(jìn)境草種攜帶真菌初步鑒定，為我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)提供技術(shù)支撐。相對(duì)于傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法，ITS序列分析用于真菌鑒定更客觀高效［25］，本研究分離的種帶真菌多數(shù)較難利用形態(tài)學(xué)觀察確定，僅有少數(shù)能較為準(zhǔn)確的識(shí)別，但仍需分子生物學(xué)技術(shù)加以輔助鑒定。ITS基因的廣泛應(yīng)用為真菌的準(zhǔn)確分類鑒定提供有力的技術(shù)基礎(chǔ)，縮短了真菌鑒定時(shí)間，加快了通關(guān)進(jìn)程，對(duì)檢疫工作起到了積極的作用。但是ITS基因?qū)τ诓糠终婢荒軌驕?zhǔn)確鑒定到種，需要進(jìn)一步篩選其它基因輔助鑒定，Genbank中含有大量的ITS序列信息，構(gòu)建并完善ITS序列數(shù)據(jù)庫有利于實(shí)現(xiàn)對(duì)真菌高通量檢測鑒定，符合口岸快速通關(guān)要求，易于標(biāo)準(zhǔn)化。

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(責(zé)任編輯 王芳)

Detection and identification of seed-borne fungi isolated from imported grass seeds

Lei Ya-hong1，Kuang Wei-gang2，Zheng Chun-sheng3，Wang Wan-chun3，Li Chun-jie1，Gao Wen-na3
(1.Key Laboratory of Grassland Agro-ecosystems，College of Pastoral Agriculture Science and Technology，Lanzhou University，Lanzhou 730020，China; 2.Department of Plant Pathology/Key Laboratory of Plant Pathology，China Agricultural University，Beijing 100193，China; 3.Beijing Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Beijing 101312，China)

The 7 grass seed samples imported from 5 countries were analyzed for seed-borne fungi by Petri-dish testing.The samples included perennial ryegrass (Lolium perenne)，tall fescue (Festuca arundinacea) and sudan grass (Sorghum sudanense) in 2014.The ITS (Internal transcribed spacer) segment was amplified using ITS4 and ITS5 as primers，then purified and sequenced.The ITS sequences obtained were blasted with known ITS sequences in database.The results showed that 48 fungal strains belonged to 21 species of 13 genera were isolated，and the seed-borne fungal species of seed samples were significantly different from each other.The fungal species were mainly Fusarium spp.Aspergillus spp.，Phoma spp.，and Alternaria spp..According to the ITS phylogenetic tree，all fungi could be identified to genus，which were hard to species.Alternaria tenuissima，A.alternata，and A.arborescens couldn’t be separated.The study analyzed seed-borne fungi of imported grass seeds from 5 countries，and the ITS sequences were applied for seed-borne fungi of imported grass seeds preliminary detection and identification.

imported grass seeds; seed-borne fungi; ITS; identification

Li Chun-jie E-mail: chunjie@ lzu.edu.cn; Gao Wen-na E-mail: gaown@ bjciq.gov.cn

S432.4+4

A

1001-0629(2016) 1-0046-08*

10.11829/j.issn.1001-0629.2015-0146

雷婭紅，況衛(wèi)剛，鄭春生，汪萬春，李春杰，高文娜.進(jìn)境草種種帶真菌的檢測與初步鑒定.草業(yè)科學(xué)，2016，33(1) : 46-53.

Lei Y H，Kuang W G，Zheng C S，Wang W C，Li C J，Gao W N.Detection and identification of seed-borne fungi isolated from imported grass seeds.Pratacultural Science，2016，33(1) : 46-53.

2015-03-13 接受日期: 2015-07-08

國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局科技計(jì)劃項(xiàng)目——進(jìn)境牧草種子真菌篩查技術(shù)研究初探(2015IK225) ;國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局科技計(jì)劃項(xiàng)目“進(jìn)境種子攜帶植物病原細(xì)菌篩查技術(shù)初探”(2014IK005) ;國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局公益性課題——應(yīng)用SiRNA測序技術(shù)篩查重要檢疫性植物病毒方法研究(201310068) ;進(jìn)境牧草種子有害生物風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估(2015BK024)

雷婭紅(1991-)，女，甘肅定西人，在讀碩士生，主要從事禾草內(nèi)生真菌研究。E-mail: leiyh14@163.com

李春杰(1968-)，男，甘肅鎮(zhèn)原人，教授，博士，主要從事禾草內(nèi)生真菌研究。E-mail: chunjie@ lzu.edu.cn;高文娜(1978-)，女，北京人，高級(jí)農(nóng)藝師，博士，主要從事植物檢疫工作。E-mail: gaown@ bjciq.gov.cn