李佛蓮，魏靈敏，潘躍芝，王仕玉

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園林園藝學(xué)院，云南　昆明650201；2.中國科學(xué)院昆明植物研究所，云南　昆明650201)

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華西小石積種子休眠原因及萌發(fā)初探

李佛蓮1,2，魏靈敏1，潘躍芝2，王仕玉1

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園林園藝學(xué)院，云南昆明650201；2.中國科學(xué)院昆明植物研究所，云南昆明650201)

摘要：通過對華西小石積種子的形態(tài)、吸水性能、發(fā)芽試驗和種子萌發(fā)抑制物的研究，并利用濃硫酸酸蝕和赤霉素處理其種子進(jìn)行發(fā)芽試驗，旨在探尋華西小石積種子休眠的原因并尋求相應(yīng)的破眠方法。結(jié)果表明，華西小石積種子休眠的原因源于其外種皮的機(jī)械阻礙和種子內(nèi)源抑制物的存在。用濃硫酸和不同濃度的赤霉素綜合處理可以打破種子休眠，促進(jìn)種子萌發(fā)，其中以濃硫酸酸蝕20min再以濃度為300mg/L的GA3浸泡24h處理可以使種子的萌發(fā)率達(dá)到50%。研究結(jié)果將為華西小石積種苗繁育提供參考。

關(guān)鍵詞：華西小石積；種子萌發(fā)；休眠原因；破眠方法

華西小石積(Osteomelesschwerinae)俗稱沙糖果，落葉或半常綠灌木,為薔薇科(Rosaceae)小石積屬(Osteomeles)植物，分布于四川、云南、貴州、甘肅等地，生長在海拔1 500～3 000m的山坡灌木叢或向陽干燥地帶。其枝條萌芽力強(qiáng)，生長迅速，根系發(fā)達(dá)，耐旱，耐瘠薄，尤其耐牛羊啃食，是植被恢復(fù)、改良土壤、保持水土、涵養(yǎng)水源的優(yōu)良鄉(xiāng)土樹種[1～2]。同時，其病蟲害少，根和葉具有清熱解毒、收斂止瀉、治療痢疾、風(fēng)濕痹痛等功效。

劉善修等[3]利用華西小石積枝條特性，育種開發(fā)了華西小石積的潛在園藝價值。郭星[2]為增加白龍江干旱河谷脆弱區(qū)植被恢復(fù)的造林樹種，根據(jù)華西小石積耐旱耐貧瘠的特點(diǎn)，對其進(jìn)行采種育苗技術(shù)的探討。然而，華西小石積目前多處于野生狀態(tài)，種子繁殖是其主要的繁殖途徑，現(xiàn)有關(guān)其種子休眠與萌發(fā)的研究尚未見報道。本試驗采用稱重法測定種子的吸水性能[4～6]，用種子的水浸提液對白菜籽萌發(fā)的生物鑒定方法[4,7～10]測定種子內(nèi)源抑制物的存在，采用化學(xué)藥劑濃硫酸的酸蝕作用以及赤霉素處理的方法[4,9～14]來打破種子休眠，旨在探討其種子休眠特性，尋找破除種子休眠的有效方法，以期為華西小石積種苗快繁提供技術(shù)支持，也為打破種子休眠方面的研究提供基礎(chǔ)參考數(shù)據(jù)，并為人工開發(fā)利用野生植物資源奠定理論基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1試驗材料

華西小石積種子采自云南石林，于2014年7月采集其果實經(jīng)水浸泡洗去果肉后晾干得到。供試白菜籽(津綠60)從市場上購買，濃硫酸純度為95.0%～98.0%(西隴化工股份有限公司)，赤霉素由上海生物化學(xué)試劑商店經(jīng)銷。

1.2試驗方法

1.2.1種子的物理特性

以目測法觀察華西小石積果實和種子的外形、色澤、質(zhì)感等，用游標(biāo)卡尺測量種子的縱徑與橫徑，精確至1mm。采用以百粒重?fù)Q算千粒重的方法得出種子的千粒重[15]，精確至0.01g。用手持折光儀測量果肉的含糖量。

1.2.2種子的吸水性能測定

取完整種子和破裂種子(借助外力將種子的外種皮破裂)各20粒，用電子天平稱其干重，即0h的重量；然后將種子置于培養(yǎng)皿中，加入25℃恒溫條件下的蒸餾水40mL，并置于25℃恒溫條件下吸水，分別于2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h時取出種子，用濾紙吸干種子表面的水分后用電子天平稱其濕重[4～6]。直至種子吸水飽和，即其濕重不再增加為止。每個處理3個重復(fù)，計算其平均值，并以此來判斷其種皮透水性。

吸水率(%)=(浸種后重量-浸種前重量)/浸種前重量×100%。

1.2.3種子發(fā)芽試驗

取完整的種子和去除外種皮的種子各60粒，分成3×20，整齊排列在裝有濾紙的培養(yǎng)皿中，加入適量的蒸餾水，置于12h光照、12h黑暗和25℃恒溫環(huán)境下培養(yǎng)。培養(yǎng)期間加蒸餾水保濕，每天定時觀察種子，發(fā)霉的種子取出用蒸餾水洗凈再放回去，若有腐爛的種子要及時去除。以胚根突破種皮約2～3mm為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)，直至連續(xù)3d種子的發(fā)芽數(shù)為0時[16]結(jié)束試驗。

發(fā)芽率(%)=n/N×100%；發(fā)芽勢(%)=Gpt/N×100%。其中，n指正常發(fā)芽的種子數(shù)量，N指播種的種子數(shù)量，Gpt指發(fā)芽達(dá)到高峰時的種子數(shù)量。

1.2.4種子內(nèi)源抑制物的活力測定

種子的休眠可能是由于種子內(nèi)存在著抑制生長的物質(zhì)，如醛類、酚類、有機(jī)酸、脫落酸、生物堿等，而這些物質(zhì)中有易溶于極性溶劑(H2O、乙醇、甲醇)的某些成份[4,7～9]。依據(jù)該原理，分別稱取種子的外種皮和去除外種皮的種子各1g，研磨成粉末，加入5mL蒸餾水，置于4℃的環(huán)境中密封浸泡48h；用離心機(jī)離心得濾液，加蒸餾水反復(fù)離心3次，合并3次得到的濾液[16]，用蒸餾水分別定容為質(zhì)量濃度0.1g/mL、0.2g/mL(每毫升溶液所含浸提物的質(zhì)量)的水浸提液，置于4℃冰箱保存。

用白菜籽測定水浸提液的活性[4,9～10]。設(shè)置0.1g/mL、0.2g/mL 2個濃度梯度，用蒸餾水作對照。分別用不同濃度的水浸提液和蒸餾水室溫下浸泡白菜籽3h，隨后取出整齊排列于加有濾紙的培養(yǎng)皿中，加入2mL不同濃度的水浸提液和蒸餾水，置于25℃恒溫箱中培養(yǎng)。每個處理30粒白菜籽，3次重復(fù)。每隔12h觀察并記錄白菜籽的萌發(fā)情況，以計算不同處理的發(fā)芽勢；培養(yǎng)48h時統(tǒng)計白菜籽的發(fā)芽率。

為使培養(yǎng)皿中萌發(fā)環(huán)境濕潤，要定時觀察，前24h補(bǔ)給同體積的對應(yīng)濃度的水浸提液和蒸餾水，24h后均補(bǔ)給同體積的蒸餾水。

1.2.5不同處理對種子萌發(fā)的影響

濃硫酸酸蝕處理。用濃硫酸處理華西小石積的種子10min、20min和30min，期間用玻璃棒攪拌，隨后流水沖洗24h，洗去表面的碳化物質(zhì)后置于放有2層濾紙的培養(yǎng)皿中于12h光照、12h黑暗和25℃恒溫的環(huán)境萌發(fā)[9]；蒸餾水處理作對照，各處理均3個重復(fù)，每個重復(fù)20粒種子，觀察并記錄萌發(fā)情況。

濃硫酸預(yù)處理后赤霉素處理。根據(jù)Khan[11]的三因子學(xué)說，先用濃硫酸處理華西小石積的種子10min、20min和30min，期間用玻璃棒攪拌，隨后流水沖洗24h，再用濃度為0mg/L、100mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L的赤霉素溶液浸泡24h[12～14]，流水沖洗10min，裝入培養(yǎng)皿，加適量蒸餾水，置于12h光照、12h黑暗和25℃恒溫的環(huán)境萌發(fā)。每種處理3個重復(fù)，每個重復(fù)20粒種子，觀察并記錄萌發(fā)情況。

1.2.6數(shù)據(jù)分析

本試驗采用Excel 2007和SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析和圖表處理，采用單因素方差比較不同處理對種子萌發(fā)的影響，處理間均值比較采用Duncan多重比較法(P<0.05)。

2結(jié)果與分析

2.1種子的物理特性

華西小石積的果實為梨果，呈卵形或近球形，成熟的果實顯藍(lán)黑色，萼片宿存；果肉的含糖量在22%～27%，每個果實含有5粒種子。種子呈三棱形，外種皮為黃色，堅硬且厚，表面粗糙不光滑。種子長約3.00～4.96mm，平均長度為3.68mm；寬度約1.40～2.52mm，平均寬度為2.52mm；種子的千粒重為8.125g。

2.2種子的吸水性能

完整種子和破裂種子的吸水率變化趨勢基本一致(圖1)。其中，0-4h種子快速吸水；4-6h時，完整種子仍快速吸水，而破裂種子吸水速率變慢，吸水率變化平緩；6-8h完整種子和破裂種子吸水率均表現(xiàn)為下降，完整種子表現(xiàn)更明顯。隨后8-24h，完整種子的吸水率變化不明顯，24h之后，吸水率在36h和48h分別有下降和上升趨勢，之后吸水率變化又不明顯；而破裂種子在8-10h時緩慢增加，10-12h變化不明顯，12-36h吸水率有顯著的下降，由24.51%下降為15.56%，36-60h破裂種子的吸水率再一次快速增加。60-96h完整種子吸水達(dá)到飽和，此時的吸水率為21.79%；而破裂種子吸水率先下降，隨后吸水率變化不明顯，吸水達(dá)到飽和，此時吸水率為14.78%。方差分析表明，華西小石積完整種子與破裂種子的吸水率差異不顯著(F=1.656,P=0.210)。

圖1　華西小石積種子吸水性能

2.3種子萌發(fā)

對比發(fā)現(xiàn)，完整種子始發(fā)芽的時間晚，萌發(fā)率為20%；去除外種皮的種子，經(jīng)蒸餾水處理第5d便開始萌發(fā)，萌發(fā)率為40%(表1)。對種子萌發(fā)進(jìn)行30d的觀察，完整種子和去除外種皮的種子的萌發(fā)分別在培養(yǎng)的第21d和18d時達(dá)到發(fā)芽數(shù)高峰，之后發(fā)芽數(shù)不再增加，萌發(fā)停止。

表1　華西小石積完整種子和去外殼的種子在25℃時萌發(fā)情況

2.4種子內(nèi)源抑制物對白菜籽萌發(fā)的影響

蒸餾水處理的白菜籽在培養(yǎng)12h內(nèi)最先最快萌發(fā)(圖2)，萌發(fā)率明顯地快速增長，且36h完全萌發(fā)，累積萌發(fā)時間短，速度快。種子外種皮水浸提液處理的白菜籽，比去除外種皮的種子水浸提液處理的萌發(fā)要早，前者12h內(nèi)白菜籽萌發(fā)速率緩慢，后者24h內(nèi)萌發(fā)率為0；24h后加蒸餾水補(bǔ)濕，由種子水浸提液處理的白菜籽萌發(fā)速度加快，萌發(fā)率明顯地快速上升。種子水浸提液處理的白菜籽72h后才基本萌發(fā)完全，累積萌發(fā)時間長。

華西小石積種子不同部位水浸提液處理的白菜籽的萌發(fā)率明顯低于CK處理(圖3)。其中，外種皮不同濃度的水浸提液對白菜籽的萌發(fā)率影響存在極顯著的差異(F=93.875,P=0.000)，去除外種皮的種子不同濃度的水浸提液對白菜籽萌發(fā)率影響也存在顯著差異(F=56.438,P=0.000)。不同濃度的外種皮水浸提液處理的白菜籽萌發(fā)率均超過60%，而去除外種皮的種子水浸提液處理的白菜籽的萌發(fā)率均未超過50%。

圖2　華西小石積種子水浸提液對白菜籽萌發(fā)的影響

圖3　　　　華西小石積種子不同部位不同濃度的浸提液

2.5不同處理對種子萌發(fā)率的影響

華西小石積的種子經(jīng)濃硫酸處理在相同條件下培養(yǎng)10d，種子均未萌發(fā)，直到第12d，濃硫酸處理30min的種子開始萌發(fā)，隨后2d開始萌發(fā)的是CK對照的種子，而濃硫酸處理20min和10min的種子培養(yǎng)了20d后才陸續(xù)萌發(fā)(圖4)。濃硫酸處理30min的種子萌發(fā)持續(xù)到第17d，之后就停止萌發(fā)，累積萌發(fā)率為25%；蒸餾水CK對照的種子萌發(fā)持續(xù)到第27d，之后停止萌發(fā)，累積萌發(fā)率為20%；后兩者萌發(fā)晚，持續(xù)時間長且萌發(fā)率低。同時，華西小石積種子經(jīng)濃硫酸酸蝕處理10min、20min和30min之間存在顯著差異(F=78.147,P=0.000)。

圖4　　　　濃硫酸處理不同時間的華西小石積

濃硫酸預(yù)處理后赤霉素(GA3)處理。濃硫酸浸泡相同時間再經(jīng)不同濃度的GA3處理，對華西小石積種子萌發(fā)情況存在顯著影響(圖5)，隨著GA3濃度的升高，華西小石積種子的萌發(fā)率普遍形成先升高后下降再升高的趨勢。其中，濃硫酸浸泡10min后，濃度為200mg/L和300mg/L的GA3處理的種子萌發(fā)率顯著高于其他濃度的處理，萌發(fā)率分別為35%和40%；濃硫酸浸泡20min濃度為300mg/L的GA3處理的種子得到最高萌發(fā)率為50%；濃硫酸浸泡30min的情況下，經(jīng)濃度為200mg/L和500mg/L的GA3處理種子萌發(fā)率顯著高于其他處理，發(fā)芽率為40%和30%。

圖5　　　　濃硫酸和赤霉素綜合處理下華西小石積

4結(jié)論與討論

華西小石積的種子吸水過程中種子的吸水率出現(xiàn)下降的現(xiàn)象，這與板藍(lán)根[18]、川續(xù)斷[19]的種子吸水情況相同。這可能與種子內(nèi)含物隨著浸泡時間的延長，發(fā)生一系列的生理生化反應(yīng)而隨水外滲有關(guān)，也表明其胚具有一定吸水性。

種子的發(fā)芽與水分的多少相關(guān)，只有吸收大量水分，氧氣才更易進(jìn)入種子，種子才能實現(xiàn)萌發(fā)所需的各種變化和生理作用[9,17]。而種皮是種子最先接觸到水的結(jié)構(gòu)，種子的外源休眠往往與種皮透性有關(guān)，測定種皮透性是了解種子休眠生理原因的常見方法之一[4]。本研究發(fā)現(xiàn)，華西小石積的種子外種皮堅硬，需借助外力才能使其破裂；完整種子和破裂種子的總吸水量不高，飽和時吸水率分別為21.79%和14.78%，可見華西小石積種子外種皮透水性差，吸水性能弱。這與銀沙槐(Ammodendronargenteum)、青錢柳(Cyclocaryacaliurus)、大果薔薇(Rosevwebbiana)、冬青(Ilexchinensis)[20～23]種子種皮透水性研究結(jié)果一致。在種子發(fā)芽過程中，去除外種皮的種子起始萌發(fā)時間遠(yuǎn)遠(yuǎn)比完整種子要早，且萌發(fā)率是完整種子的2倍。由此可見，華西小石積種子休眠與種皮透性無關(guān)，主要是受到堅硬的外種皮造成的機(jī)械阻礙。

抑制物的存在是引起種子休眠的重要因子，它們以極微量的濃度來影響細(xì)胞的分裂、分化、伸長和發(fā)育，最終推遲或抑制同種或異種植物種子發(fā)芽[7,24]。華西小石積種子各部位的水浸提液對白菜籽的萌發(fā)產(chǎn)生了明顯的抑制作用，表明華西小石積種子存在抑制物，這與王艷華等[26]對大山櫻種子各部水浸提液的白菜籽萌發(fā)試驗結(jié)果相符。不同水浸提液處理的白菜籽萌發(fā)到24h均出現(xiàn)拐點(diǎn)(圖2)，蒸餾水在一定程度上可以稀釋抑制物。但是，華西小石積種子的抑制物種類、含量尚未見報道，還有待進(jìn)一步的研究。

植物種子的內(nèi)源激素和種子萌發(fā)環(huán)境共同調(diào)控種子的休眠及萌發(fā)。打破種子的休眠，促使種子萌發(fā)，除了要提供種子萌發(fā)所需要的水分、氧氣、溫度等環(huán)境條件，還要打破種子硬實，改變內(nèi)源激素的比例[25]。而且王家源[25]、王艷華等[26]研究也發(fā)現(xiàn)，在許多情況下，種子休眠不單因為種子存在抑制物，而是取決于種子萌發(fā)促進(jìn)物和抑制物的相對平衡。華西小石積種子不同濃度的水浸提液對白菜籽的萌發(fā)存在明顯的影響，導(dǎo)致華西小石積種子休眠的原因有兩大方面：種皮的機(jī)械阻礙和種子內(nèi)源抑制物的存在。其中，用濃硫酸處理種子可使種皮軟化和破裂，加快水分的吸收和氣體的交換，尤其對無透性的硬粒樹種非常有效[4]。本文選用濃硫酸的酸蝕作用處理種子外種皮，在一定程度可以提高種子的萌發(fā)率。而經(jīng)濃硫酸酸蝕后赤霉素處理的種子，通過對處理后的種子萌發(fā)率的分析得到，濃硫酸酸蝕20min后濃度為300mg/L的GA3浸泡24h，可以使種子的萌發(fā)率達(dá)到50%，是此次試驗中萌發(fā)率最高的處理組合。但濃硫酸本身具有強(qiáng)烈的腐蝕性，操作上存在危險性，不能滿足生產(chǎn)要求，需進(jìn)一步尋找能快捷地解除華西小石積種子休眠，提高萌發(fā)率的方法。

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Seed Dormancy Characteristics and Germination Physiology of Osteomeles schwerinae C.K.Schneid

Li Fo-lian1,2,Wei Ling-min1,Pan Yue-zhi2，Wang Shi-yu1

(1.College of Horticulture and Landscape Architecture,Yunnan Agricultural University,Kunming Yunnan 650201,P.R.China;2.Kunming Institute of Botany,Chinese Academy of Science,Kunming Yunnan 650201,P.R.China)

Abstract:To improve the seed germination rate of Osteomeles schwerinae C.K.Schneid,the causes of seed dormancy and the methods for breaking dormancywere studies.The results showed that the seed dormancy of Osteomeles schwerinae C.K.Schneid could be attributed to the mechanical obstruction of the seed coat and the inhibitory substance.Sulfuric acid and GA(3 )treatment could overcome the seed dormancy and improve germination rate.Soaking the seeds in sulfuric acid for 20minutes and then 300mg/L GA3 for 24h could improve its seed germination rate to 50%.

Key words:Osteomeles schwerinae C.K.Schneid;seed germination;cause of dormancy;dormancy breaking methods

中圖分類號：Q 945

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1672-8246(2016)02-0089-06

通訊作者簡介：王仕玉(1965-)，女，副教授，主要從事園藝植物種質(zhì)資源教學(xué)與科研。Email:wsygfg@aliyun.com

第一作者簡介：李佛蓮(1991-)，女，碩士生，主要從事野生植物資源保護(hù)與利用研究。Email: m15198779795@163.com

*收稿日期：2015-07-01