趙孝通， 張 園， 劉方舟， 李培華

臨床與基礎(chǔ)研究

Gankyrin蛋白在喉鱗癌中表達(dá)的實驗研究

趙孝通， 張 園， 劉方舟， 李培華

目的 研究Gankyrin蛋白在喉鱗癌組織及喉鱗癌Hep-2細(xì)胞系中的表達(dá)。方法 免疫組織化學(xué)方法檢測24例喉鱗癌組織、相應(yīng)癌旁組織及10例正常組織，免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測Hep-2細(xì)胞系中Gankyrin蛋白的表達(dá)與分布，并計算陽性細(xì)胞率，進(jìn)行統(tǒng)計分析。結(jié)果 喉鱗癌組織及Hep-2細(xì)胞系中，Gankyrin蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞核。喉鱗癌組織中Gankyrin蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞率(58.5%)明顯高于相應(yīng)癌旁組織(11.4%)及正常組織(18.1%)，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01)。結(jié)論 喉鱗癌組織及喉鱗癌Hep-2細(xì)胞系中均有Gankyrin蛋白的表達(dá)，可為Gankyrin在喉鱗癌中表達(dá)的后續(xù)相關(guān)研究提供理論依據(jù)。

喉鱗狀細(xì)胞癌; 免疫組織化學(xué); Gankyrin； 腫瘤標(biāo)記物

喉鱗癌是頭頸部常見的惡性腫瘤，其發(fā)生發(fā)展受體內(nèi)多種基因及蛋白影響。Gankyrin蛋白又名p28GANK，是近年發(fā)現(xiàn)的癌蛋白。2000年， HIGASHITSUJI等人[1]在人肝癌組織cDNA文庫中發(fā)現(xiàn)了Gankyrin基因，并通過對比肝癌組織與正常組織，首次提出Gankyrin mRNA在肝癌組織中高表達(dá)，拉開了人們對Gankyrin研究的序幕?，F(xiàn)有關(guān)Gankyrin的研究多集中于消化系統(tǒng)腫瘤，本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法對Gankyrin蛋白在喉鱗癌組織與喉鱗癌Hep-2細(xì)胞系中的表達(dá)進(jìn)行定位，旨在為進(jìn)一步研究Gankyrin蛋白表達(dá)與喉鱗癌間的關(guān)系做基礎(chǔ)研究，并為后續(xù)臨床診療研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織標(biāo)本 24例喉鱗癌組織及相應(yīng)癌旁組織(腫瘤周邊≤2 cm內(nèi)的組織)、10例正常組織(腫瘤周邊>2 cm外的組織)均取自2013年7月至2014年7月期間在江蘇省腫瘤醫(yī)院頭頸外科住院手術(shù)患者，全為男性,24例，年齡50～82歲，中位年齡63歲。標(biāo)本常規(guī)多聚甲醛固定石蠟包埋，用于免疫組織化學(xué)檢測。所選患者術(shù)前均未施行放療、化療，術(shù)后腫瘤組織經(jīng)病理科兩位副主任醫(yī)師病理確診。

1.1.2 細(xì)胞系 喉鱗癌Hep-2細(xì)胞系由南京市鼓樓醫(yī)院沈曉輝副主任醫(yī)師惠贈。

1.1.3 主要試劑與儀器 兔抗人 Gankyrin單克隆抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司(BIOSS，稀釋比例1∶100)，通用型SP免疫組織化學(xué)試劑盒和DAB顯色試劑盒購自福州市邁新生物技術(shù)開發(fā)公司，10%胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司，不完全DMEM(高糖)培養(yǎng)基購自GIBCO，CO2培養(yǎng)箱(HERA cell 150)購自Thermo，倒置熒光顯微鏡(Axiovert 200)(ZEISS)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 喉鱗癌Hep-2細(xì)胞系在含10%的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(含青霉素80 U/ml；鏈霉素0.08 mg/ml；L-谷氨酰胺和碳酸鈉)中生長，于37 ℃，5%CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，細(xì)胞密度達(dá)80%后傳代。

1.2.2 喉鱗癌組織的免疫組織化學(xué)檢測 實驗采用常規(guī)免疫組織化學(xué)方法SP法。組織標(biāo)本經(jīng)多聚甲醛固定，石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟，梯度酒精脫水；于枸櫞酸緩沖液(pH=6.0)中行微波抗原修復(fù)；滴加過氧化氫，室溫孵化；滴加BSA封閉液，37 ℃加熱20 min；滴加兔抗人Gankyrin單抗(1∶100)，4℃過夜， PBS代替一抗作陰性對照；次日，滴加生物素標(biāo)記二抗，置37 ℃加熱30 min；滴加標(biāo)記鏈霉素卵白素工作液，置37 ℃加熱30 min；DAB顯色，蘇木精染色，封片。

1.2.3 喉鱗癌Hep-2細(xì)胞系的免疫細(xì)胞化學(xué)檢測 Hep-2細(xì)胞系經(jīng)常規(guī)消化離心后，取細(xì)胞懸液滴至滅菌的蓋玻片，滴加DMEM培養(yǎng)液，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中行細(xì)胞爬片24 h；PBS清洗，滴加丙酮固定15 min。細(xì)胞爬片制作完成后，余下步驟同SP法免疫組化。

1.3 結(jié)果觀察

喉鱗癌組織和喉鱗癌Hep-2細(xì)胞系中的Gankyrin蛋白經(jīng)染色后呈棕黃色顆粒，于熒光顯微鏡下選取多個×10視野觀察，以已知Gankyrin蛋白陽性表達(dá)的肝癌組織作陽性對照，腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核(少量胞質(zhì))中表達(dá)為陽性細(xì)胞。將組織切片(細(xì)胞爬片)置于鏡下，隨機選取10個不重復(fù)視野，各計100個細(xì)胞中Gankyrin蛋白陽性細(xì)胞數(shù)，取均值后算得陽性細(xì)胞所占比例，即陽性細(xì)胞率=陽性細(xì)胞數(shù)平均值/100×100%。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 Gankyrin蛋白在喉鱗癌組織中的表達(dá)

Gankyrin蛋白在喉鱗癌組織中的免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，Gankyrin蛋白主要定位于喉鱗癌組織的細(xì)胞核內(nèi)，呈棕黃色顆粒，深淺不一。此外，亦有少量腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)中見Gankyrin蛋白表達(dá)。喉鱗癌組織中Gankyrin蛋白表達(dá)水平較高，相應(yīng)的癌旁組織中Gankyrin蛋白的表達(dá)水平較低(圖1、圖2)。喉癌組織與癌旁組織和正常組織間的陽性細(xì)胞率差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，表1)。

圖1 Gankyrin蛋白在喉鱗癌組織中的表達(dá)(SP法 ×200)

圖2 Gankyrin蛋白在癌旁組織中的表達(dá)(SP法 ×200)

癌組織癌旁組織正常組織P陽性細(xì)胞百分率58.5±1.6711.4±1.42*18.1±1.81*<0.01

注：*癌組織組與癌旁組織組(t=89.230，P<0.01)、癌組織組與正常組織組(t=63.310，P<0.01)比較有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2 Gankyrin蛋白在喉鱗癌細(xì)胞系Hep-2中的表達(dá)

Hep-2細(xì)胞中Gankyrin蛋白的陽性染色定位及陽性細(xì)胞率與其在喉鱗癌組織中的檢測結(jié)果基本相符。通過顯色，Gankyrin蛋白陽性染色除主要定位在喉鱗癌Hep-2細(xì)胞系的細(xì)胞核, 部分細(xì)胞質(zhì)同時為陽性染色，陽性細(xì)胞百分率為62.4%(圖3)。

圖3 Gankyrin蛋白在喉鱗癌細(xì)胞系Hep-2中的表達(dá)(SP法 ×200)

3 討論

Gankyrin蛋白是一種在空間結(jié)構(gòu)上高度保守的小分子蛋白，其通過與不同蛋白質(zhì)的結(jié)合，調(diào)控細(xì)胞的增值并產(chǎn)生相應(yīng)的細(xì)胞生命活動[2]。研究表明，Gankyrin蛋白的致瘤性與Rb密切相關(guān)，Gankyrin蛋白可競爭性抑制p16與CDK4結(jié)合，從而釋放CDK4的活性，促進(jìn)Rb的磷酸化，增強細(xì)胞的增殖[3]；Gankyrin蛋白的高表達(dá)還能提高癌基因MDM2/HDM2的活性，進(jìn)而促進(jìn)MDM2對p53泛素化降解，促使細(xì)胞過度增殖及腫瘤細(xì)胞的形成[4];此外，與RelA直接結(jié)合后，Gankyrin蛋白可在轉(zhuǎn)錄水平通過SIRT1調(diào)控乙?；?，抑制NF-κB通路的激活，下調(diào)NF-κB的促凋亡作用[5]。MAN等[6]指出，Gankyrin蛋白能夠促進(jìn)RhoA與RhoGDI(Rho-GDP的解離抑制子)結(jié)合，抑制RhoA活性，影響PI3K-AKT通路的激活。綜上所述，Gankyrin蛋白通過多種途徑使正常細(xì)胞趨向惡化，參與腫瘤的形成過程。

Gankyrin蛋白高表達(dá)最早發(fā)現(xiàn)于肝癌組織中[1]。Gankyrin蛋白的表達(dá)與腫瘤的肝內(nèi)轉(zhuǎn)移與包膜侵犯密切相關(guān)，其表達(dá)程度會隨著肝癌的發(fā)展逐漸增高。此外，Gankyrin蛋白的測定具有一定的預(yù)后判斷參考價值，在Gankyrin高表達(dá)的同時，提示了肝癌術(shù)后患者的低生存率及高復(fù)發(fā)率[7]。近年，Gankyrin蛋白的高表達(dá)不僅在肝癌、食管鱗癌[8]、結(jié)腸癌[9]等消化系統(tǒng)腫瘤中發(fā)現(xiàn),而且在乳腺癌[10]、子宮內(nèi)膜癌[11]等消化系統(tǒng)以外的腫瘤組織中的表達(dá)也逐漸引起國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注，但目前尚未見Gankyrin蛋白在喉鱗癌中表達(dá)的相關(guān)研究的報道。LI等[12]的研究發(fā)現(xiàn)，在口腔鱗癌中，Gankyrin蛋白的陽性表達(dá)在早期即可出現(xiàn)。研究者通過Western-blot和免疫組化的方法，在翻譯水平檢測多種口腔鱗癌組織及細(xì)胞系中Gankyrin基因的表達(dá)情況，指出Gankyrin基因的異常表達(dá)在口腔鱗癌中普遍存在，Gankyrin基因和蛋白表達(dá)水平檢測有助于臨床判斷口腔鱗癌的分化程度及發(fā)展階段。這提示，Gankyrin蛋白在與口腔鱗癌相似且關(guān)系密切的喉鱗癌組織中也存在高表達(dá)的可能，并且具有一定的研究價值與實際臨床意義。本實驗首次運用免疫組織化學(xué)及免疫細(xì)胞化學(xué)的方法,分別對喉鱗癌組織和喉鱗癌Hep-2細(xì)胞系中Gankyrin蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，Gankyrin蛋白在喉鱗癌組織中主要表達(dá)于細(xì)胞核,少量表達(dá)于胞質(zhì)。喉鱗癌組織中Gankyrin蛋白的陽性細(xì)胞率(58.5%)明顯高于相應(yīng)癌旁組織(11.4%)及正常組織(18.1%)(均P<0.01)。喉鱗癌Hep-2細(xì)胞系中的實驗結(jié)果進(jìn)一步驗證，在細(xì)胞水平上Gankyrin蛋白同樣存在很高的表達(dá)率(62.4%)，蛋白的表達(dá)與定位也與喉鱗癌組織基本相符。Gankyrin蛋白在喉鱗癌組織中的高表達(dá)，提示Gankyrin蛋白可能與喉鱗癌的發(fā)生有關(guān)，雖然具體機制有待研究，但為揭示Gankyrin蛋白表達(dá)與喉鱗癌間關(guān)系的后續(xù)研究提供了參考依據(jù)。

初期，人們通過分析肝癌組織中Gankyrin的表達(dá)情況與臨床病理參數(shù)間的關(guān)系，探索將Gankyrin的基礎(chǔ)研究應(yīng)用于臨床工作的可能性。如今，研究者們發(fā)現(xiàn)[13]，Gankyrin蛋白的高表達(dá)與多種腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展、臨床表現(xiàn)以及預(yù)后情況密切相關(guān)，并有人嘗試將Gankyrin作為新的腫瘤標(biāo)志物運用于臨床，Gankyrin也有望成為新的腫瘤基因治療靶點。喉鱗癌的早期發(fā)現(xiàn)與治療能明顯提高患者的生存率和治愈率，Gankyrin蛋白在喉鱗癌中的高表達(dá)提示了其可能在喉癌發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色。通過單獨檢測Gankyrin的表達(dá)情況或與其他已知喉癌相關(guān)基因聯(lián)合檢測，或許可為喉鱗癌的早期診斷、早期干預(yù)及預(yù)后判斷提供參考。Gankyrin和喉鱗癌病理及臨床分期間的關(guān)系是我們進(jìn)一步研究的方向。

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The experimental study of the expression of Gankyrin proteins in laryngeal carcinoma tissues and cell lines Hep-2

ZHAOXiaotong1,ZHANGYuan2,LIUFangzhou2,LIPeihua3.

(1.GraduateSchool,XuzhouMedicalCollege,Xuzhou221000,China; 2.DepartmentofHeadandNeckSurgery,JiangsuCancerHospital,Nanjing210009,China;3.DepartmentofOtolaryngology,HospitalAffiliatedtoXuzhouMedicalCollege，Xuzhou221000,China)

Corresponding author:LIPeihua,E-mail：Lipeihua000@126.com

Objective To investigate the expression of Gankyrin proteins in laryngeal carcinoma tissues and cell lines Hep-2. Methods The expression of Gankyrin proteins in laryngeal carcinoma tissues ，para- carcinoma tissues(n=24)and normal tissues(n=10)were assessed by immunohistochemical technique，and in cell lines Hep-2 by immunocytochemistry technique.The positive cells were counted and located under the microscope. Results The Gankyrin proteins expressed mainly in the cell nucleus. The expression of Gankyrin protein in laryngeal carcinoma(58.5%) is significantly higher than in para-cacinoma tissues(11.4%) and normal tissues(18.1%),and the difference was statistically significant(P<0.01). Conclusions Gankyrin proteins expressed both in laryngeal carcinoma tissues and Hep-2 cell lines, which give the basic function for the study of Gankyrin in laryngeal carcinoma.

Laryngeal cell carcinoma; Immunohistochemistry; Gankyrin； Tumor marker

221000 江蘇 徐州，徐州醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院(趙孝通)；210009 江蘇 南京，江蘇省腫瘤醫(yī)院

頭頸外科(張 園，劉方舟)；221000 江蘇 徐州，徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 耳鼻喉科(李培華)

趙孝通，男，在讀碩士研究生，研究方向：喉癌的基礎(chǔ)與臨床研究，E-mail：sszsxkdb@sina.com

李培華，男，主任醫(yī)師，碩導(dǎo)，研究方向：頭頸部腫瘤的基礎(chǔ)與臨床研究，E-mail：Lipeihua000@126.com

10.3969/j.issn.1674-4136.2016.01.008

1674-4136(2016)01-0026-04

2015-10-13][本文編輯：文 心]