黃迅辰， 楊　維， 戴賢君

(1. 中國計(jì)量學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院， 浙江 杭州 310018; 2. 浙江省海洋食品品質(zhì)及危害物控制技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 浙江 杭州 310018)

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納米銀對熒光假單胞菌生物膜形成的影響

黃迅辰1,2， 楊維1,2， 戴賢君1,2*

(1. 中國計(jì)量學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院， 浙江 杭州 310018; 2. 浙江省海洋食品品質(zhì)及危害物控制技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 浙江 杭州 310018)

摘要：分別以空白和0.4%納米銀乙烯醋酸乙烯酯(EVA)塑料片作為載體培養(yǎng)熒光假單胞菌生物膜，通過菌落計(jì)數(shù)法測定生物膜的變化曲線，分別采用普通顯微鏡觀察生物膜形成并計(jì)算覆蓋率(BCR)，掃描電鏡觀察生物膜的微觀結(jié)構(gòu)，激光共聚焦顯微鏡觀察生物膜中的細(xì)菌狀態(tài)并計(jì)算死亡率.結(jié)果表明，空白、納米銀EVA表面生物膜分別在12和24 h達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，各時(shí)間點(diǎn)的納米銀EVA表面菌數(shù)及BCR均顯著低于空白EVA(p<0.05)；在10 000倍的視野下，空白EVA表面的熒光假單胞菌通過胞外產(chǎn)物和菌體形成致密生物膜，納米銀EVA表面多為分散菌體；在24,48 h時(shí)，納米銀EVA表面的死亡菌體數(shù)顯著高于空白EVA(p<0.05)；納米銀通過抑制熒光假單胞菌生長和減少胞外產(chǎn)物的分泌而影響生物膜的形成.

關(guān)鍵詞：納米銀; 熒光假單胞菌; 生物膜

HUANG Xunchen1,2, YANG Wei1,2, DAI Xianjun1,2

(1.CollegeofLifeSciences,ChinaJiliangUniversity,Hangzhou310018,China; 2.KeyLaboratoryofMarineFoodQualityandHazardControllingTechnologyofZhejiangProvince,Hangzhou310018,China)

熒光假單胞菌是一類革蘭氏陰性桿狀細(xì)菌，具有分布廣泛、營養(yǎng)需求單一、繁殖快、能產(chǎn)生水溶性的黃綠色熒光色素等特點(diǎn)[1].熒光假單胞菌在4 ℃時(shí)繁殖速度快，是導(dǎo)致冷藏食品腐敗的優(yōu)勢菌群[2].

細(xì)菌生物被膜(biofilm,BF)是細(xì)菌在生長過程中,為適應(yīng)生存環(huán)境而吸附于惰性或活性材料表面的一種由細(xì)菌和自身分泌的細(xì)胞外基質(zhì)組成的物質(zhì)[3].與浮游細(xì)菌生長方式不同，生物膜細(xì)菌在形態(tài)結(jié)構(gòu)和生化特性方面亦有顯著差異,不僅能有效逃避宿主免疫作用、抗生素殺傷和產(chǎn)生耐藥性，而且難以從黏附部位徹底清除，是食品安全的重大隱患[4].

銀離子具有廣譜殺菌功能,主要通過與細(xì)菌接觸反應(yīng),干擾肽聚糖的合成并阻礙細(xì)胞壁的形成,也能破壞微生物的電子傳輸系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、物質(zhì)傳輸系統(tǒng),導(dǎo)致細(xì)菌死亡[5].納米粒子是指粒子直徑在1～100 nm的粒子,具有獨(dú)特的納米晶體結(jié)構(gòu)和更大的接觸面積[6].納米銀離子既具有納米材料獨(dú)特的性能又具有銀離子特有的抗菌特性，比普通銀離子具有更好的應(yīng)用效果[7].因此，納米銀作為無機(jī)抗菌劑在食品貯藏保鮮中有潛在的應(yīng)用價(jià)值[8]，但有關(guān)納米銀對生物膜形成影響的研究報(bào)道較少.

本試驗(yàn)以空白和含納米銀的Ethylene-Vinyl Acetate (EVA) 塑料片為黏附載體，通過結(jié)晶紫染色、掃描電鏡、激光共聚焦顯微鏡等方法觀察熒光假單胞菌生物膜的形成過程，以分析生物膜的分布和空間結(jié)構(gòu)，探討納米銀對熒光假單胞菌生物膜形成的影響及可能機(jī)制，旨在為食品生產(chǎn)過程中利用納米銀控制生物膜形成提供依據(jù).

1材料與方法

1.1試劑

熒光假單胞菌由本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并保存；結(jié)晶紫、蛋白胨、葡萄糖、酵母浸出粉、瓊脂、氯化鈉購于杭州百思生物技術(shù)有限公司；24孔板購于杭州米克化工有限公司；LIVE/DEAD?BacLightTMBacterial Viability Kits(L13152)購于life technologies公司；空白及0.4%納米銀EVA塑料片(1 cm×1 cm×0.5 mm)購于北京崇高納米有限公司.

1.2試驗(yàn)器材

GR60DF立式自動壓力蒸汽滅菌器(廈門致薇儀器有限公司)，BJ-2CD超凈工作臺(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)，I3型紫外可見分光光度計(jì)(濟(jì)南荷能儀器股份有限公司)，LT-BIX低溫生化培養(yǎng)箱(上海立德泰勀科學(xué)儀器有限公司)，E200 MVRS型正置顯微鏡和CISI激光共聚焦顯微鏡(日本尼康公司)， SIRION100掃描電鏡(美國FEI公司).

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1材料準(zhǔn)備

將空白和含有0.4%納米銀的EVA片用去離子水沖洗，放在丙酮中超聲15 min，清洗掉表面的油污，然后放在75%的乙醇中浸泡30 min，洗滌劑清洗；蒸餾水沖洗干凈后，放在250 mL的三角瓶中，121 ℃，滅菌20 min.

向無菌24孔培養(yǎng)板的每孔中加入2 mL LB培養(yǎng)基并分成對照組和試驗(yàn)組，對照組培養(yǎng)孔中放入空白EVA片，試驗(yàn)組培養(yǎng)孔中放入納米銀EVA片.

1.3.2納米銀對生物膜菌數(shù)的影響

取培養(yǎng)24 h處于對數(shù)生長期的熒光假單胞菌液稀釋成菌懸液(OD600為0.05)，24孔培養(yǎng)板的每孔接種菌懸液100 μL，25 ℃培養(yǎng)；分別于3,6,9,12,24,36,48,72 h取出空白、納米銀EVA片置于試管，加3 mL無菌水超聲10 min，用紫外可見分光光度計(jì)在OD600時(shí)測定菌液濃度，并在倍比稀釋后進(jìn)行CFU計(jì)數(shù)，平行試驗(yàn)3組，繪制生物膜曲線.

1.3.3納米銀對生物膜覆蓋率的影響

同1.3.2節(jié)培養(yǎng)熒光假單胞菌液生物膜，分別于培養(yǎng)6,12,24,48 h時(shí)取出空白、納米銀EVA片自然干燥，PBS溶液洗滌后95%體積分?jǐn)?shù)的酒精固定處理生物膜，再用0.5%結(jié)晶紫染色5 min后用蒸餾水清洗.處理好后的載體片放在E200正置顯微鏡下放大10×20倍觀測，隨機(jī)選取3個平行視野拍照，用NIS-Element BR 軟件計(jì)算生物膜在EVA表面的覆蓋率(Biofilm coverage rate，BCR).

1.3.4納米銀對生物膜微觀結(jié)構(gòu)的影響

同1.3.2節(jié)培養(yǎng)熒光假單胞菌液生物膜，取培養(yǎng)24 h的空白、納米銀EVA片用無菌水清洗，然后置于2.5%戊二醛PBS溶液固定1 h.由于樣品本身以及EVA不導(dǎo)電，需要經(jīng)過臨界點(diǎn)干燥并噴金，分別在1 000和10 000倍視野下掃描電鏡觀察生物膜的微觀結(jié)構(gòu).

1.3.5納米銀對生物膜中細(xì)菌狀態(tài)的影響

按LIVE/DEAD? BacLightTMBacterial Viability Kits試劑說明配制熒光染液，取一支SYT09溶于2.5 mL去離子水配成溶液，一支PI溶于2.5 mL去離子水配成溶液，再將2種試劑溶液按照V∶V=1∶1加入同一離心管，振蕩混勻，避光4 ℃保存?zhèn)溆?同1.3.2節(jié)培養(yǎng)熒光假單胞菌液生物膜，選取24，48 h的生物膜進(jìn)行試驗(yàn)，每個時(shí)間點(diǎn)選取3組平行.用PBS溶液清洗3次，滴加SYTO9/PI熒光染料，避光孵育20 min，再用PBS溶液清洗3次，50%甘油封片用于激光共聚焦掃描電鏡觀察.選取氬激光(488 nm)激發(fā)，沿Z軸掃描，Image Pro Plus 6.0圖像分析處理得到生物膜中的死菌數(shù)，計(jì)算死亡率.

1.4數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，p<0.05表明差異顯著.

2結(jié)果

2.1納米銀對生物膜菌數(shù)的影響

對生物膜進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)可量化其形成過程，圖1說明空白和0.4%納米銀EVA表面均形成熒光假單胞菌生物膜，且2種載體片表面黏附的生物膜表現(xiàn)出相似的生長趨勢，但納米銀可明顯延遲熒光假單胞菌生物膜的形成.空白EVA表面的生物膜12 h時(shí)已基本達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，納米銀EVA表面在24 h時(shí)才達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，而且穩(wěn)定態(tài)時(shí)的菌數(shù)顯著低于空白載體組(p<0.05)，說明納米銀對熒光假單胞菌生物膜的形成有明顯的抑制效果.

圖1　納米銀和空白EVA表面熒光假單胞菌生物膜的形成曲線Fig.1　The curve of Pseudomonas fluourcens biofilms onthe control and EVA contained 0.4% silver nanoparticles

2.2納米銀對生物膜覆蓋率的影響

圖2　納米銀和空白EVA表面不同培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)的熒光假單胞菌生物膜Fig.2　Pseudomonas fluourcens biofilms on the control and EVA piece contained 0.4% silver nanoparticlesat the different culture times(a) 0.4%納米銀EVA(6 h)；(b) 0.4%納米銀EVA(12 h)；(c) 0.4%納米銀EVA(24 h)；(d) 0.4%納米銀EVA(48 h);(e) 空白EVA(6h)；(f) 空白EVA(12 h)；(g) 空白EVA(24 h)；(h) 空白EVA(48 h).(a) EVA of 0.4% silver nanoparticles(6 h)；(b) EVA of0.4% silver nanoparticles(12 h)；(c) EVA of 0.4% silvernanoparticles(24 h)；(d) EVA of 0.4% silver nanoparticles(48 h)；(e) Control EVA(6 h)；(f) Control EVA(12 h)；(g) Control EVA(24 h)；(h) Control EVA(48 h).彩圖詳見http://www.journals.zju.edu.cn/sci

圖3　空白和納米EVA不同培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)的熒光假單胞菌生物膜BCRFig.3　BCR of Pseudomonas fluourcens biofilms on the control and EVA piece contained 0.4% silver nanoparticles at the different culture time

圖2是熒光假單胞菌黏附在EVA上形成生物膜的結(jié)晶紫染色狀態(tài).從圖2(e)、(f)、(g)、(h)可見，熒光假單胞菌可黏附到EVA上逐漸形成致密的生物膜，在12 h時(shí)EVA表面已布滿生物膜，24～48 h時(shí)已非常致密，這同2.1節(jié)中生物膜的形成曲線一致.比較圖2(a)～(d)與相同時(shí)間點(diǎn)的圖2(e)～(h)，納米銀EVA表面的生物膜在各時(shí)間點(diǎn)均較為稀疏，在24～48 h時(shí)的成熟期，其覆蓋范圍明顯低于空白EVA上的生物膜.圖3熒光假單胞菌生物膜BCR的柱狀圖顯示，在各個時(shí)間點(diǎn)上空白和納米銀EVA表面生物膜的BCR均差異顯著(p<0.05)，其中48 h時(shí)空白EVA表面的熒光假單胞菌生物膜BCR達(dá)到91.8%，而納米銀EVA表面的生物膜BCR為46.8%，說明納米銀在生物膜形成過程中具有持續(xù)抑制效果.

2.3納米銀對生物膜微觀結(jié)構(gòu)的影響

圖4(a)、(b)和(c)、(d)分別是培養(yǎng)24 h時(shí)納米銀EVA和空白EVA表面的生物膜在放大1 000倍和10 000倍的掃描電鏡照片.對比圖4(a)和(b)，發(fā)現(xiàn)空白EVA表面的熒光假單胞菌生物膜更為明顯、清晰、完整.由圖4(d)可見，空白EVA表面的完整生物膜形態(tài)，熒光假單胞菌通過自身分泌的黏性胞外產(chǎn)物將其連接成一片，菌體包裹在胞外分泌物中，整個生物膜呈片狀，無規(guī)則覆蓋在載體表面，形成形態(tài)不規(guī)則的多層結(jié)構(gòu)，圖4(c)中納米銀EVA表面的菌體生物膜不及空白EVA表面致密，熒光假單胞菌基本處于分散狀態(tài).

圖4　空白和納米EVA表面24 h的熒光假單胞菌生物膜掃描電鏡圖Fig.4　SEM images of Pseudomonas fluourcens biofilms on the control and EVA contained0.4% silver nanoparticles at 24 h

2.4納米銀對生物膜中細(xì)菌狀態(tài)的影響

圖5中(a)、(c)和(b)、(d)分別是在24 ，48 h時(shí)空白和納米銀EVA表面的死亡熒光假單胞菌菌體染色結(jié)果，染色較淺的為死亡菌體.從圖中可見納米銀EVA表面的死亡菌體數(shù)量明顯高于空白EVA.在24，48 h時(shí)空白和納米銀EVA上熒光假單胞菌的死亡率分別為15.1%，52.4%和37.7%，70.1%，同一時(shí)間點(diǎn)的菌體死亡數(shù)量差異顯著(p<0.05).

圖5　納米和空白EVA表面24，48 h死亡熒光假單胞菌的共聚焦顯微鏡圖Fig.5　CLSM images of dead Pseudomonas fluourcens on the control and EVA contained 0.4% silver nanoparticles at 24 and 48 h彩圖詳見http://www.journals.zju.edu.cn/sci

3討論

生物膜是由菌體和菌分泌的胞外多糖等基質(zhì)組成的具有高度結(jié)構(gòu)性、協(xié)調(diào)性的功能型組織群體[9].生物膜內(nèi)菌體結(jié)構(gòu)緊密，代謝、運(yùn)輸結(jié)構(gòu)完整，能有效阻止大分子酶類和小分子抗生素進(jìn)入菌體，較于浮游菌體，其對環(huán)境的適應(yīng)能力、抗性都有增強(qiáng)，因此生物膜難以清除[10].

納米銀具有廣譜殺菌、不易產(chǎn)生抗藥性、安全性高等優(yōu)點(diǎn)，已有較多有關(guān)納米銀抑制菌株及其作用原理的報(bào)道[11].在本試驗(yàn)中，納米銀EVA表面形成的熒光假單胞菌生物膜形成明顯滯后于空白EVA，各時(shí)間點(diǎn)均差異顯著；結(jié)晶紫染色圖也表明，納米銀EVA表面的熒光假單胞菌生物膜更為稀疏，生物膜覆蓋率僅為空白對照的50%左右.掃描電鏡能較好呈現(xiàn)生物膜的微觀結(jié)構(gòu)，在本試驗(yàn)中，空白EVA表面的生物膜完整、致密，有明顯的層次結(jié)構(gòu)，而納米銀EVA表面的生物膜中的菌體呈單個分散狀態(tài)，菌體數(shù)量明顯低于空白EVA，說明納米銀在熒光假單胞菌生物膜形成過程中對菌體生長和分泌胞外產(chǎn)物能力產(chǎn)生了明顯的抑制作用，而胞外產(chǎn)物的缺乏進(jìn)一步影響了生物膜的內(nèi)部微觀結(jié)構(gòu)和外部形態(tài).共聚焦顯微鏡圖的結(jié)果表明，納米銀EVA表面生物膜死亡菌株顯著多于空白EVA，說明納米銀可通過殺菌抑制生物膜的形成.

通過對生物膜的觀察及定性、定量分析，發(fā)現(xiàn)納米銀通過抑制熒光假單胞菌的生長，減少其胞外分泌產(chǎn)物，從而影響生物膜的形成.納米銀材料在細(xì)菌生物膜控制中具有較大的應(yīng)用價(jià)值.

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Effect of silver nanoparticles on biofilm formation ofPseudomonasfluourcens. Journal of Zhejiang University(Science Edition), 2016,43(2):195-199

Abstract:To explore the effect of silver nanoparticles on the formation of Pseudomonas fluourcens biofilms on ethylene-vinyl acetate(EVA) pieces, the curve of bacterial biofilm is determined by colony counts, and the morphology, microstructure and bacterial status of the biofilm are respectively observed through crystal voilet staining, scanning electron microscopy(SEM) and confocal laser scanning microscope(CLSM)．The biofilm stained by crystal violet is examined with a digital microscope to calculate the biofilm coverage rate (BCR) by NIS-Element BR soft ware. Then the mortality of bacterial is calculated by image structure analyzer (ISA) software．Results show that the bacteria can aggregate on the control EVA and EVA contained 0.4% silver nanoparticles, and forms the grown biofilm after 12 and 48 h culture, respectively. But the biofilm on the control EVA has more bacterial count and BCR than that of silver nanoparticles(p<0.05). At 24 h, the bacteria interacting with its extracellular products can form the dense film in the microscope vision of 10 000 times on the control EVA, while there are only dispersive bacteria on silver nanoparticle EVA. The bacterial mortality in the film on silver nanoparticle EVA is significantly higher than that of control group at 24, 48 h (p<0.05). Silver nanoparticles have great inhibiting effect on biofilm formation of Pseudomonas fluourcens through inhibiting the growth of the bacterial and its extracellucar products.

Key Words:silver nanoparticles; Pseudomonas fluourcens; biofilms

中圖分類號：R 378.11

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1008-9497(2016)02-195-05

DOI:10.3785/j.issn.1008-9497.2016.02.013

作者簡介：黃迅辰(1990-)，男，碩士研究生，主要從事食品微生物研究.*通信作者，ORCID:http://orcid.org/0000-0002-8361-5187,E-mail:xjdai@cjlu.edu.cn.

基金項(xiàng)目：浙江省重大科技專項(xiàng)資助項(xiàng)目(2012C03009-2).

收稿日期：2015-03-31.