林書典，詹 鋒，武 偉，潘楚瑛，張 延，劉 穎，楊 舟，黃艷艷，黃 瑋，王 茹，詹宇威

570311海南省海口市，海南省人民醫(yī)院腎病風(fēng)濕科

?

·論著·

可溶性klotho蛋白與慢性腎臟病患者體內(nèi)氧化應(yīng)激的關(guān)系研究

林書典，詹 鋒，武 偉，潘楚瑛，張 延，劉 穎，楊 舟，黃艷艷，黃 瑋，王 茹，詹宇威

570311海南省?？谑校Ｄ鲜∪嗣襻t(yī)院腎病風(fēng)濕科

【摘要】目的探討慢性腎臟病(CKD)患者體內(nèi)氧化應(yīng)激狀態(tài)，初步明確可溶性klotho蛋白(s-kl)在CKD患者體內(nèi)氧化應(yīng)激中的作用和意義。方法選取2012年1月—2014年12月在海南省人民醫(yī)院腎病風(fēng)濕科門診或住院診治的CKD患者共89例，均符合美國國家腎臟病基金會(huì)制定的腎臟病預(yù)后質(zhì)量倡議(K/DOQI-CKD)診斷標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)CKD分期將入選患者分為CKD1～2組(27例)、CKD3～4組(35例)和CKD5組(27例)。清晨空腹采集患者靜脈血，常規(guī)方法檢測(cè)血常規(guī)和血生化指標(biāo)。采用ELISA法檢測(cè)s-kl，硫代巴比妥酸法檢測(cè)丙二醛(MDA)，羥胺法檢測(cè)總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性，比色法檢測(cè)總抗氧化力(T-AOC)，分光光度法檢測(cè)還原型谷胱甘肽(GSH)。用核素腎動(dòng)態(tài)顯像((99)Tcm-DTPA)檢測(cè)腎小球?yàn)V過率(GFR)。比較組間差異，部分指標(biāo)間的依存關(guān)系采用Pearson相關(guān)分析和直線回歸分析。結(jié)果3組CKD患者s-kl、MDA、T-SOD、T-AOC及GSH水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。其中，CKD3～4組和CKD5組s-kl、T-SOD、T-AOC和GSH水平較CKD1～2組下降，而MDA水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；CKD5組s-kl、T-SOD、T-AOC和GSH水平較CKD3～4組降低，MDA水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。相關(guān)分析顯示，s-kl與T-SOD、T-AOC及GSH呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.428、0.502、0.531，P<0.05)，與MDA呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.434，P<0.05)。線性回歸分析顯示，s-kl與MDA、T-SOD、T-AOC間存在線性依存關(guān)系(P<0.05)，而s-kl與GSH無線性回歸關(guān)系(P>0.05)。結(jié)論CKD患者體內(nèi)存在氧化應(yīng)激，s-kl降低與腎臟氧化損傷密切相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】腎疾?。谎趸詰?yīng)激；Klotho蛋白

林書典，詹鋒，武偉，等.可溶性klotho蛋白與慢性腎臟病患者體內(nèi)氧化應(yīng)激的關(guān)系研究[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2016，19(11)：1297-1300.[www.chinagp.net]

Lin SD,Zhan F,Wu W,et al.Correlation between soluble klotho protein and oxidative stress in patients with chronic kidney diseases[J].Chinese General Practice，2016，19(11)：1297-1300.

氧化應(yīng)激是慢性腎臟病(CKD)進(jìn)展及惡化的重要影響因素之一[1]，抗氧化應(yīng)激治療日益成為臨床關(guān)注的熱點(diǎn)[2]。klotho蛋白是一種與腎臟疾病密切相關(guān)的調(diào)控因子，主要表達(dá)于大腦脈絡(luò)膜和腎小管組織中，其表達(dá)上調(diào)可延緩CKD和腎臟纖維化的進(jìn)展[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)，klotho蛋白可作為一種抗氧化調(diào)節(jié)因子參與CKD的抗氧化應(yīng)激損傷[5]，因此，本研究擬在CKD患者中檢測(cè)可溶性klotho蛋白(s-kl)水平，探討其與CKD患者體內(nèi)氧化應(yīng)激的關(guān)系。

1資料與方法

1.1臨床資料選取2012年1月—2014年12月海南省人民醫(yī)院腎病風(fēng)濕科門診或住院的CKD患者共89例，均符合美國國家腎臟病基金會(huì)制定的腎臟病預(yù)后質(zhì)量倡議(Kidney Disease Outcome Quality Initiative，K/DOQI-CKD)診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]。根據(jù)CKD分期將入選患者分為CKD1～2組(27例)、CKD3～4組(35例)和CKD5組(27例)。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡≥18歲，入選前2周內(nèi)未服用具有抗氧化作用的藥物、心肺功能穩(wěn)定及肝功能基本正常者。病例排除標(biāo)準(zhǔn)：有透析(腹膜透析或血液透析)史、有腫瘤及自身免疫性疾病史、1個(gè)月內(nèi)患有感染性疾病、輸血、創(chuàng)傷和手術(shù)史、半年內(nèi)服用中等量以上激素(相當(dāng)于潑尼松 0.5 mg·kg-1·d-1以上)超過30 d、C反應(yīng)蛋白水平升高者。本研究獲得海南省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均知情同意。

1.2常規(guī)血清學(xué)指標(biāo)檢測(cè)患者清晨空腹采集靜脈血(2×10 ml)，提取血清置-80 ℃低溫冰箱中保存?zhèn)錂z測(cè)。采用全自動(dòng)血液細(xì)胞學(xué)分析儀檢測(cè)血常規(guī)，全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血生化指標(biāo)等。采用核素腎動(dòng)態(tài)顯像(99Tcm-DTPA)檢測(cè)腎小球?yàn)V過率(GFR)。

1.3s-kl、丙二醛(MDA)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)、總抗氧化力(T-AOC)和還原型谷胱甘肽(GSH)檢測(cè)采用ELISA法檢測(cè)s-kl(Immune-Biological Laboratories Co.Ltd,Gunma,Japan)。采用硫代巴比妥酸(TBA)法檢測(cè)MDA，羥胺法檢測(cè)T-SOD活性，比色法檢測(cè)T-AOC，分光光度法檢測(cè)GSH；試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，按照產(chǎn)品試劑盒說明書操作。

2結(jié)果

2.1臨床資料比較3組患者原發(fā)疾病構(gòu)成比比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.088，P=0.581，見表1)。

3組CKD患者的平均動(dòng)脈壓(MAP)、血紅蛋白(Hb)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、血鈣(Ca2+)、血磷(P)、堿性磷酸酶(ALP)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)水平、GFR比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；余指標(biāo)間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見表2)。

表13組CKD患者原發(fā)疾病構(gòu)成比比較〔n(%)〕

Table1Comparisonofprimarydiseaseconstitutionamongthethreegroups

組別例數(shù)CGNDNHNTINON其他CKD1～2組2711(40.8)3(11.1)4(14.8)2(7.4)5(18.5)2(7.4)CKD3～4組3514(40.0)7(20.0)6(17.1)5(14.3)2(5.7)1(2.9)CKD5組279(33.3)4(14.8)5(18.6)3(11.1)3(11.1)3(11.1)

注：CKD=慢性腎臟病，CGN=慢性腎小球腎炎，DN=糖尿病腎病，HN=高血壓腎小動(dòng)脈硬化癥，TIN=腎小管間質(zhì)性腎病，ON=梗阻性腎病

2.23組s-kl、MDA、T-SOD、T-AOC和GSH水平比較3組CKD患者s-kl、MDA、T-SOD、T-AOC及GSH水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。其中，CKD3～4組和CKD5組s-kl、T-SOD、T-AOC和GSH水平較CKD1～2組降低，而MDA水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；CKD5組中s-kl、T-SOD、T-AOC和GSH水平較CKD3～4組降低，MDA水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表3)。

2.3s-kl與MDA、T-SOD、T-AOC及GSH相關(guān)性分析相關(guān)性分析顯示，s-kl與MDA呈負(fù)相關(guān),與T-SOD、T-AOC及GSH呈正相關(guān)(P<0.05，見表4)。

表2　3組CKD患者基本臨床資料比較

注：與CKD1～2組比較，aP<0.05；與CKD3～4組比較，bP<0.05；c為χ2值；MAP=平均動(dòng)脈壓，Hb=血紅蛋白，ALT=丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶，AST=天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶，Alb=清蛋白，Ca2+=血鈣，P=血磷，ALP=堿性磷酸酶，TC=總膽固醇，TG=三酰甘油，LDL-C=低密度脂蛋白膽固醇，BUN=尿素氮，Scr=血肌酐，GFR=腎小球?yàn)V過率

2.4s-kl與MDA、T-SOD、T-AOC及GSH線性回歸分析以s-kl為自變量，以MDA、T-SOD、T-AOC和GSH為因變量，分別進(jìn)行線性回歸分析，結(jié)果顯示s-kl與MDA、T-SOD、T-AOC間存在線性依存關(guān)系(P<0.05)，而s-kl與GSH無線性回歸關(guān)系(P>0.05,見表5)。

Table 3Comparison of the levels of s-kl,MDA,T-SOD,T-AOC and GSH among the three groups

組別例數(shù)s-kl(ng/L)MDA(nmol/ml)T-SOD(U/ml)T-AOC(U/ml)GSH(mg/L)CKD1～2組27717.7±144.93.66±0.9891.2±20.912.7±3.238.9±8.5CKD3～4組35521.7±135.7a7.02±2.01a76.6±16.2a8.2±1.2a29.1±7.2aCKD5組27401.7±90.5ab7.33±2.07ab66.0±15.2ab7.0±2.0ab25.2±5.9abF值43.02035.64014.19050.02025.630P值<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001

注：與CKD1～2組比較，aP<0.05；與CKD3～4組比較,bP<0.05；s-kl=可溶性klotho蛋白，MDA=丙二醛，T-SOD=總超氧化物歧化酶，T-AOC=總抗氧化力，GSH=還原型谷胱甘肽

表4　s-kl與MDA、T-SOD、T-AOC及GSH的相關(guān)性分析

表5s-kl與MDA、T-SOD、T-AOC和GSH關(guān)系的線性回歸分析

Table 5Linear regression analysis on correlation between s-kl and MDA,T-SOD,T-AOC and GSH

因變量bSEt值P值MDA-0.0230.0043.0440.012T-SOD0.6140.1123.2450.001T-AOC0.2590.0982.4900.016GSH0.2080.1320.8370.254

3討論

氧化應(yīng)激是由于機(jī)體內(nèi)氧化物質(zhì)增多，抗氧化防御能力下降或缺陷引起氧化/抗氧化失衡，導(dǎo)致細(xì)胞組織損傷的過程，其作為腎損害的非傳統(tǒng)因素日益受到關(guān)注并逐漸成為研究的熱點(diǎn)。氧化應(yīng)激貫穿CKD的發(fā)生發(fā)展全過程，是多種病理損傷的共同途徑。氧化物質(zhì)可直接攻擊腎組織細(xì)胞膜蛋白、脂質(zhì)及核酸，抑制線粒體內(nèi)呼吸鏈生物酶活性，影響細(xì)胞的正常功能。研究發(fā)現(xiàn)，CKD發(fā)展惡化與體內(nèi)氧化物質(zhì)活性氧(ROS)的增多，抗氧化物質(zhì)的減少密切相關(guān)[7]。

3.1CKD患者體內(nèi)氧化應(yīng)激Vostalova等[8]在腎移植患者中發(fā)現(xiàn)，晚期氧化蛋白產(chǎn)物(AOPP)較腎移植前下降，而GSH水平升高，提示終末期腎病(ESRD)患者體內(nèi)氧化/抗氧化失衡，存在氧化應(yīng)激。在本研究中同樣發(fā)現(xiàn)，隨著GFR的下降，氧化物質(zhì)MDA逐漸升高，而抗氧化物質(zhì)T-SOD和GSH逐漸降低，氧化/抗氧化失衡與腎功能惡化呈并行趨勢(shì)，表明氧化應(yīng)激是CKD持續(xù)進(jìn)展的可能性因素[9-10]。與其他研究[11]不同的是，在本研究中，T-AOC隨著腎功能的惡化而下降，是否與整體抗氧化物質(zhì)減少所致仍不明確，但T-AOC被認(rèn)為是CKD患者氧化應(yīng)激的關(guān)鍵標(biāo)志物[12]，其在CKD患者體內(nèi)的變化仍有爭(zhēng)議。有學(xué)者認(rèn)為，T-AOC的升高可能與CKD患者高尿酸以及體外以過氧化氫(H2O2)為底物的T-AOC檢測(cè)有關(guān)[13]，而確切機(jī)制仍有待研究闡明。

3.2klotho蛋白及其抗氧化機(jī)制klotho蛋白是一種影響CKD發(fā)生發(fā)展的重要跨膜蛋白，腎臟是其表達(dá)的主要器官。klotho蛋白以兩種形式存在，即膜結(jié)合性klotho(m-kl)和s-kl，s-kl以酶切裂解的方式從細(xì)胞膜表面與m-kl分離，直接釋放至血液循環(huán)中。通過檢測(cè)血液中s-kl水平，可反映出klotho蛋白的表達(dá)水平。目前已證實(shí)，klotho蛋白隨著GFR的下降而表達(dá)減少，腎臟纖維化逐漸加重[14]，在本研究中也再次證明了這一點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，Kl-/-小鼠出現(xiàn)嚴(yán)重的氧化應(yīng)激損傷，而在H2O2干預(yù)下，轉(zhuǎn)染klotho基因的IMCD3細(xì)胞凋亡明顯減少，klotho蛋白預(yù)處理的HeLa細(xì)胞脂質(zhì)過氧化受到抑制，這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果均提示klotho具有抗氧化和抗凋亡的功能，其機(jī)制可能是激活FOXO轉(zhuǎn)錄信號(hào)途徑和刺激SOD生成增多的結(jié)果[15]。Oh等[16]研究表明，ESRD患者循環(huán)血中s-kl水平的下降與氧化應(yīng)激的增強(qiáng)密切相關(guān)。同樣，本研究顯示，s-kl與T-SOD、T-AOC及GSH呈正相關(guān)，而與MDA呈負(fù)相關(guān)，并且線性回歸分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)s-kl與MDA、T-SOD和T-AOC存在線性依存關(guān)系。有研究發(fā)現(xiàn)，klotho蛋白表達(dá)上調(diào)可抑制腎組織中MDA水平的增高，提高T-SOD、T-AOC及GSH活性水平[15]，其機(jī)制可能是通過活性氧敏感性凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶信號(hào)復(fù)合物，調(diào)控p38-MAPK以及cAMP-PKA通路從而影響體內(nèi)氧化應(yīng)激狀態(tài)[17-18]，因此提示klotho蛋白在CKD患者體內(nèi)水平的變化與氧化/抗氧化失衡有密切聯(lián)系，其表達(dá)水平的下降可能是腎臟氧化損傷加重的原因之一。

本文創(chuàng)新點(diǎn)：

探討可溶性klotho蛋白在CKD患者體內(nèi)水平與氧化應(yīng)激的關(guān)系，為今后進(jìn)一步研究klotho蛋白對(duì)CKD進(jìn)展的影響提供基礎(chǔ)理論支撐。

本文不足：

本研究結(jié)果僅初步揭示了可溶性klotho蛋白在CKD患者氧化應(yīng)激中可能存在的促進(jìn)作用，但其確切機(jī)制仍有待進(jìn)一步的研究以闡明。

作者貢獻(xiàn)：林書典負(fù)責(zé)試驗(yàn)設(shè)計(jì)、撰寫論文并對(duì)論文負(fù)責(zé)；詹鋒負(fù)責(zé)試驗(yàn)質(zhì)控、指導(dǎo)及論文審校；武偉、潘楚瑛、張延負(fù)責(zé)收集臨床病例；劉穎、楊舟、黃艷艷、黃瑋負(fù)責(zé)標(biāo)本收集、臨床資料收集和匯總；王茹、詹宇威負(fù)責(zé)臨床標(biāo)本檢測(cè)。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：趙躍翠)

Correlation Between Soluble Klotho Protein and Oxidative Stress in Patients With Chronic Kidney Diseases

LINShu-dian,ZHANFeng,WUWei,etal.

DepartmentofNephrology&Rheumatology,HainanGeneralHospital,Haikou570311,China

【Abstract】ObjectiveTo study the oxidative stress in patients with chronic kidney disease (CKD),and to clarify the role of soluble klotho(s-kl) protein in the oxidative stress of CKD patients.MethodsWe enrolled 89 CKD patients or inpatients from the Department of Nephrology & Rheumatology of Hainan General Hospital from January 2012 to December 2014.All patients were consistent with the K/DOQI-CKD criteria.According to CKD staging,the patients were divided into three groups:CKD1-2 group(n=27),CKD3-4 group(n=35)and CKD5 group(n=27).Morning fasting venous blood was sampled,and routine blood indexes and biochemical indexes were detected using conventional methods.S-kl was measured using ELISA;malondialdehyde (MDA) was detected by thiobarbituric acid method;total superoxide dismutase (T-SOD) activity;total antioxidant capacity (T-AOC) was measured by colorimetry and reduced glutathione (GSH) were determined by hydroxylamine method and spectrophotometry respectively.Glomerular filtration rate(GFR) was detected by radionuclide renal dynamic imaging ((99)Tcm-DTPA).Intergroup differences were analyzed and Pearson correlation analysis and linear regression were applied to reveal the correlation among the parameters.ResultsThe three groups were significantly different in the levels of s-kl,MDA,T-SOD,T-AOC and GSH (P<0.001).CKD3-4 group and CKD5 group were lower in the levels of s-kl,T-SOD,T-AOC and GSH but were higher in the level of MDA than CKD1-2 group (P<0.05).CKD5 group was lower in the levels of s-kl,T-SOD,T-AOC and GSH and higher in the level of MDA than CKD3-4 group (P<0.05).Correlation analysis showed that s-kl had positive correlation with T-SOD,T-AOC and GSH (r=0.428,0.502,0.531；P<0.05),and had negative correlation with MDA (r=-0.434，P<0.05).Linear regression analysis showed that s-kl had linear regression relationship with MDA,T-SOD and T-AOC(P<0.05),but had no linear regression relationship with GSH(P>0.05).ConclusionOxidative stress exists in CKD patients,and the reduction of s-kl protein level is closely correlated with kidney oxidative damage.

【Key words】Kidney diseases；Oxidative stress；Klotho protein

(收稿日期：2015-09-15；修回日期：2015-12-20)

【中圖分類號(hào)】R 692

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

doi：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.11.014

通信作者：詹鋒，570311海南省?？谑?，海南省人民醫(yī)院腎病風(fēng)濕科；E-mail：renal@126.com

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81360118)；海南省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(309087)