梁友芳，農(nóng)清清，覃健敏，韋宏曠，郭堯平，范 譽(yù)，班彩霞，李慕軍

530021廣西南寧市，廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院(梁友芳，李慕軍)；廣西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院(農(nóng)清清，郭堯平，范譽(yù))；南寧市疾病預(yù)防控制中心(覃健敏)；廣西壯族自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心(韋宏曠)；廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院(班彩霞)

?

·論著·

兒童注意缺陷多動(dòng)障礙與5-羥色胺R2A基因多態(tài)性的相關(guān)性研究

梁友芳，農(nóng)清清，覃健敏，韋宏曠，郭堯平，范 譽(yù)，班彩霞，李慕軍

530021廣西南寧市，廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院(梁友芳，李慕軍)；廣西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院(農(nóng)清清，郭堯平，范譽(yù))；南寧市疾病預(yù)防控制中心(覃健敏)；廣西壯族自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心(韋宏曠)；廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院(班彩霞)

【摘要】目的探討5-羥色胺(5-HT)R2A基因單核苷酸多態(tài)性與兒童注意缺陷多動(dòng)障礙(ADHD)的關(guān)系。方法于2011年12月—2013年1月廣西兒童ADHD流行病學(xué)抽樣調(diào)查篩查出的ADHD患兒中，采用隨機(jī)數(shù)字表法選取158例為病例組，另在與ADHD患兒同一聚居區(qū)非ADHD者中選擇性別、年齡匹配的159例為對(duì)照組。取外周靜脈血5 ml，提取DNA。根據(jù)HapMap提供的存在于中國(guó)人群5-HT R2A基因的單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)(SNPs)數(shù)據(jù)，及國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，選擇14個(gè)SNPs進(jìn)行研究，并設(shè)計(jì)引物序列。PCR擴(kuò)增，于反應(yīng)終點(diǎn)判讀基因型。結(jié)果病例組與對(duì)照組rs2770304、rs985934和rs6311位點(diǎn)的基因型分布不同，病例組CC/CT基因型頻率高于對(duì)照組，TT基因型頻率低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。病例組rs2770304、rs985934、rs4941573、rs2070040、rs6313和rs6311位點(diǎn)關(guān)聯(lián)等位基因頻率高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。rs1745837、rs3742279和rs2296972位點(diǎn)兩兩間存在強(qiáng)連鎖不平衡(D′和r2均大于0.95)，rs2770304、rs985934和rs4941573位點(diǎn)兩兩間存在較強(qiáng)連鎖不平衡，rs2070040與rs6313、rs6311位點(diǎn)存在較強(qiáng)連鎖不平衡。病例組單體型CCA、ACC頻率高于對(duì)照組，單體型TTG、GTT頻率低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論5-HT R2A基因rs2770304、rs985934、rs4941573、rs2070040、rs6313和rs6311位點(diǎn)多態(tài)性及單體型CCA、ACC、TTG、GTT可能與兒童ADHD的發(fā)生有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】注意力缺陷障礙伴多動(dòng)；5-羥色胺；多態(tài)性,單核苷酸；連鎖不平衡

梁友芳，農(nóng)清清，覃健敏，等.兒童注意缺陷多動(dòng)障礙與5-羥色胺R2A基因多態(tài)性的相關(guān)性研究[J].中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2016，19(11)：1287-1291.[www.chinagp.net]

Liang YF,Nong QQ,Qin JM，et al.Association of 5-HT R2A gene polymorphism and attention deficit hyperactivity disorder in children[J].Chinese General Practice，2016，19(11)：1287-1291.

注意缺陷多動(dòng)障礙(ADHD)是一種多見(jiàn)于學(xué)齡期兒童的精神障礙，主要表現(xiàn)為與其同齡兒童相比活動(dòng)過(guò)度、注意力不集中，可伴有學(xué)習(xí)成績(jī)低下和沖動(dòng)行為[1]。目前ADHD的病因及發(fā)病機(jī)制尚不十分明確，但家系研究、雙生子和寄養(yǎng)子研究結(jié)果顯示，遺傳因素是ADHD的重要發(fā)病因素，平均遺傳度約為76%[2]。5-羥色胺(5-HT)系統(tǒng)相關(guān)受體均定位于與學(xué)習(xí)和記憶有關(guān)的腦區(qū)，如前額葉皮質(zhì)、海馬和杏仁核等[3]，20世紀(jì)70年代已有關(guān)于5-HT系統(tǒng)與ADHD關(guān)系的研究[4]，5-HT受體和5-HT轉(zhuǎn)運(yùn)體目前研究較多。有研究認(rèn)為，5-HT系統(tǒng)相關(guān)基因的變異可能是ADHD的病因之一[5]。本研究選擇5-HT R2A基因14個(gè)單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)(SNPs)進(jìn)行研究，探討其基因多態(tài)性與ADHD之間的關(guān)聯(lián)。

1對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象于2011年12月—2013年1月廣西兒童ADHD流行病學(xué)抽樣調(diào)查篩查出的ADHD患兒中，采用隨機(jī)數(shù)字表法選取158例為病例組，其中男141例，女17例；年齡6.0～13.5歲，平均年齡7.8歲。病例組納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合《美國(guó)精神障礙診斷與統(tǒng)計(jì)手冊(cè)》第四版(DSM-Ⅳ)[6]中ADHD的診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)3代內(nèi)屬本民族血緣；(3)取得患者及家屬或法定監(jiān)護(hù)人的同意，并簽署知情同意書(shū)。排除患有兒童精神分裂癥、情感障礙、孤獨(dú)癥、精神發(fā)育遲滯及其他器質(zhì)性疾病者。在與ADHD患兒同一聚居區(qū)非ADHD者中選擇性別、年齡匹配的159例為對(duì)照組，其中男139例，女20例；年齡6.0～14.0歲，平均年齡9.0歲。對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)3代內(nèi)屬本民族血緣的健康人；(2)無(wú)嚴(yán)重軀體疾病、藥物依賴史和其他精神疾病史；(3)自愿參加本研究并知情同意。兩組受試者上代均無(wú)族間通婚史，亦無(wú)親緣關(guān)系。

1.2方法

1.2.1基因組DNA提取取外周靜脈血5 ml，置于EDTA試管抗凝,后保存于-20 ℃冰箱。采用DNA提取試劑盒提取DNA，保存于-80 ℃冰箱備用。

1.2.2基因位點(diǎn)選擇及基因分型根據(jù)HapMap提供的存在于中國(guó)人群5-HT R2A基因的SNPs數(shù)據(jù)，及國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)[7-9]，選擇14個(gè)SNPs進(jìn)行研究。采用Assay Designer 3.1軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，由博淼生物科技(北京)有限公司合成。采用 Sequenom Mass Array系統(tǒng)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，于反應(yīng)終點(diǎn)判讀基因型。PCR在384孔板(包含10 ng DNA的5 μl體系)中進(jìn)行。PCR循環(huán)參數(shù)：94 ℃變性20 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共45個(gè)循環(huán)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用Haploview軟件進(jìn)行5-HT R2A基因多態(tài)位點(diǎn)Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)和連鎖不平衡分析；采用SPSS 19.0軟件包進(jìn)行χ2檢驗(yàn)分析5-HT R2A基因多態(tài)性與ADHD的關(guān)聯(lián)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)經(jīng)Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)，病例組和對(duì)照組各SNPs基因型頻率均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡規(guī)律(P>0.05，見(jiàn)表1)，表明選擇的樣本具有群體代表性，基因頻率能代表群體的基因分布。

表1　5-HT R2A基因Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)

注：SNPs=單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)

2.2病例組與對(duì)照組5-HT R2A基因多態(tài)位點(diǎn)基因型和等位基因頻率比較病例組與對(duì)照組rs2770304、rs985934和rs6311位點(diǎn)的基因型分布不同，病例組CC/CT基因型頻率高于對(duì)照組，TT基因型頻率低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；兩組余位點(diǎn)基因型分布比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。病例組rs2770304、rs985934、rs4941573、rs2070040、rs6313和rs6311位點(diǎn)關(guān)聯(lián)等位基因頻率高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；兩組余位點(diǎn)關(guān)聯(lián)等位基因頻率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見(jiàn)表2)。

2.35-HT R2A基因14個(gè)SNPs位點(diǎn)連鎖不平衡分析當(dāng)連鎖不平衡系數(shù)(D′)和關(guān)聯(lián)系數(shù)(r2)≥0.80時(shí)，表示兩位點(diǎn)存在強(qiáng)連鎖不平衡[10]。應(yīng)用Haploview軟件對(duì)14個(gè)SNPs位點(diǎn)兩兩間的連鎖不平衡分析表明，rs1745837、rs3742279和rs2296972位點(diǎn)兩兩間存在強(qiáng)連鎖不平衡(D′和r2均大于0.95)，rs2770304、rs985934和rs4941573位點(diǎn)兩兩間存在較強(qiáng)連鎖不平衡，rs2070040與rs6313、rs6311位點(diǎn)存在較強(qiáng)連鎖不平衡，rs6313和rs6311位點(diǎn)存在強(qiáng)連鎖不平衡(D′=1，r2=0.98)。14個(gè)SNPs位點(diǎn)可構(gòu)成3個(gè)單體型塊，其中Block2和Block3兩個(gè)單體塊間存在強(qiáng)連鎖不平衡，連鎖不平衡系數(shù)為0.98(見(jiàn)圖1)。

表2病例組和對(duì)照組5-HT R2A基因多態(tài)位點(diǎn)關(guān)聯(lián)等位基因頻率比較

Table 2Comparison of the frequency of alleles associated with SNPs in 5-HT R2A gene between case group and control group

SNPs關(guān)聯(lián)等位基因關(guān)聯(lián)等位基因頻率病例組(n=158) 對(duì)照組(n=159)χ2值P值OR(95%CI)rs3125C0.1280.1031.0050.3161.29(0.79,2.11)rs7997012-0.6990.69901.0001.00(0.71,1.41)rs1923884C0.5630.5540.0490.8241.04(0.76,1.42)rs1745837C0.5700.5540.1530.6951.07(0.78,1.46)rs3742279G0.5630.5510.0970.7551.05(0.77,1.44)rs2296972T0.5730.5540.2140.6441.08(0.79,1.48)rs2224721A0.2660.2201.8190.1781.29(0.89,1.85)rs1928040C0.1940.1700.5860.4441.17(0.78,1.76)rs2770304C0.2180.1377.1410.0081.76(1.16,2.67)rs985934C0.2370.1566.5840.0101.68(1.13,2.51)rs4941573A0.3060.2284.8890.0271.50(1.05,2.14)rs2070040A0.2630.1914.5990.0321.51(1.04,2.20)rs6313C0.3150.2394.5790.0321.47(1.03,2.09)rs6311C0.3150.2315.6300.0181.54(1.08,2.19)

2.45-HT R2A基因多態(tài)位點(diǎn)構(gòu)建的單體型分析14個(gè)SNPs共發(fā)現(xiàn)7個(gè)主要單體型(頻率>5%)，病例組單體型CCA、ACC頻率高于對(duì)照組，單體型TTG、GTT頻率低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；兩組余單體型頻率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見(jiàn)表3)。

注：方塊中的數(shù)字表示連鎖不平衡系數(shù)D′

圖15-HT R2A基因多態(tài)位點(diǎn)連鎖不平衡分析

Figure 1Linkage disequilibrium analysis of SNPs in 5-HT R2A gene

表3病例組與對(duì)照組5-HT R2A基因多態(tài)位點(diǎn)構(gòu)建的單體型頻率比較

Table 3Comparison of the haplotype frequency of 5-HT R2A SNPs between case group and control group

單體型單體型頻率病例組(n=158) 對(duì)照組(n=159)χ2值P值OR(95%CI)單體型塊1 CGT0.5630.5450.2230.6371.08(0.79,1.47) TAG0.4240.4360.0960.7560.95(0.69,1.30)單體型塊2 TTG0.6940.7735.0250.0250.66(0.46,0.95) CCA0.2170.1376.8400.0091.74(1.15,2.65) TTA0.0670.0710.0340.8530.95(0.51,1.77)單體型塊3 GTT0.6830.7614.7520.0290.68(0.48,0.96) ACC0.2630.1914.5990.0321.51(1.04,2.20)

3討論

研究表明，5-HT系統(tǒng)功能降低與攻擊、沖動(dòng)、ADHD等破壞性行為的發(fā)生有關(guān)[11]，目前關(guān)于5-HT在ADHD中的分子遺傳學(xué)研究主要集中在5-HT受體和5-HT轉(zhuǎn)運(yùn)體。5-HT R2A是人體中重要的中樞神經(jīng)遞質(zhì)，與人類行為、情緒調(diào)控等多種精神活動(dòng)密切相關(guān)。5-HT R2A是一種抑制性受體，其T102C由T到C突變，可使5-HT2A的表達(dá)降低，從而使5-HT R2A結(jié)合力下降，神經(jīng)元的興奮性提高[12]。研究發(fā)現(xiàn)，5-HT R2A的T102C突變與ADHD發(fā)生有關(guān)[13]。5-HT R2A基因可影響認(rèn)知功能，其啟動(dòng)子區(qū)-1438A/G多態(tài)性能夠調(diào)節(jié)5-HT R2A啟動(dòng)子的活性，進(jìn)而影響5-HT R2A基因的表達(dá)水平[14]。-1438A/G多態(tài)性與重型抑郁癥、沖動(dòng)行為相關(guān)[15-16]。錢(qián)秋謹(jǐn)?shù)萚17]報(bào)道5-HT R2A基因-1438A/G多態(tài)性是中國(guó)漢族ADHD患兒智商的影響因素。

人類5-HT R2A定位于第13號(hào)染色體長(zhǎng)臂14～21區(qū)(13q14～21)，是由1 413個(gè)核苷酸開(kāi)放閱讀框架編碼的471個(gè)氨基酸組成，基因跨度范圍為20 kb，擁有3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子。目前共發(fā)現(xiàn)5-HT R2A基因存在6種多態(tài)性，包括2種靜息多態(tài)性T102C和C516T，3種結(jié)構(gòu)多態(tài)性Thr25Asn、His452Thr和Ala447Val，此外，5-HT R2A基因啟動(dòng)子區(qū)1 438位有A或G堿基變化，形成A1438G多態(tài)性[18]。本研究選擇了14個(gè)SNPs位點(diǎn)，其中包括rs6313(T102C)和rs6311(G1438A)。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，病例組rs6311(T102C)位點(diǎn)CC/CT基因型頻率較高，TT基因型頻率較低，提示CC/CT可能是ADHD發(fā)病的危險(xiǎn)因素，TT可能是ADHD的保護(hù)因素，與侯雪等[13]報(bào)道的一致。病例組rs2770304、rs985934、rs4941573、rs2070040、rs6313和rs6311位點(diǎn)的關(guān)聯(lián)等位基因頻率均較高，提示上述位點(diǎn)可能與ADHD有關(guān)。

rs6313(T102C)多態(tài)性是位于外顯子上的靜息多態(tài)性，該位點(diǎn)的突變并不改變氨基酸序列，但可能影響mRNA的次級(jí)結(jié)構(gòu)，且與其他多態(tài)性位點(diǎn)存在連鎖不平衡。許多針對(duì)不同人群的研究證實(shí)，rs6313位點(diǎn)與啟動(dòng)子區(qū)的rs6311(G1438A)存在完全的連鎖不平衡[19]。連鎖不平衡分析是研究位點(diǎn)間關(guān)聯(lián)性的一種方法，通過(guò)連鎖不平衡分析可能有助于發(fā)現(xiàn)與研究?jī)?nèi)容關(guān)聯(lián)的核苷酸多態(tài)性。本研究發(fā)現(xiàn)rs6313與rs6311、rs2070040位于同一單體型塊，且與rs6311存在強(qiáng)連鎖不平衡(D′=1，r2=0.98)，與rs2070040存在較強(qiáng)連鎖不平衡。rs1745837、rs3742279和rs2296972位點(diǎn)位于同一單體型塊，且兩兩間也存在很強(qiáng)的連鎖不平衡(D′和r2均大于0.95)，rs2770304、rs985934和rs4941573位點(diǎn)位于同一單體型塊，且兩兩間存在強(qiáng)連鎖不平衡。但Heiser等[20]在102個(gè)家系的229例ADHD患者中未發(fā)現(xiàn)5-HT R2A rs6313、rs6314、rs6311多態(tài)性位點(diǎn)傳遞不平衡。同一單體型塊中的SNPs間連鎖不平衡，提示位點(diǎn)間沒(méi)有發(fā)生重組，所有的SNPs有共同一并遺傳的趨勢(shì)。

單體型是指一條染色體上緊密連鎖的多個(gè)等位基因的線性排列。大多數(shù)染色體區(qū)域只有少數(shù)幾個(gè)常見(jiàn)的單體型(每個(gè)具有至少5%的頻率)，代表了一個(gè)群體中的大部分多態(tài)性，多態(tài)性位點(diǎn)單體型的構(gòu)建則是這種遺傳關(guān)聯(lián)的體現(xiàn)，單體型的研究能夠揭示多個(gè)SNPs與疾病等的關(guān)聯(lián)[10]。本研究在病例組和對(duì)照組中發(fā)現(xiàn)了7個(gè)主要單體型(頻率>5%)，其中病例組單體型CCA、ACC的頻率高于對(duì)照組，單體型TTG、GTT的頻率低于對(duì)照組，提示單體型CCA、TTG、GTT和ACC可能與ADHD存在一定的關(guān)聯(lián)性。

綜上所述，本研究結(jié)果提示5-HT R2A基因6個(gè)SNPs及4個(gè)單體型與ADHD的發(fā)生可能存在一定相關(guān)性。但ADHD是多基因遺傳的復(fù)雜疾病，是多個(gè)基因交互作用的結(jié)果，而每個(gè)基因只發(fā)揮微效作用[21]，該結(jié)論尚需在其他地區(qū)、不同人群中進(jìn)一步驗(yàn)證。

作者貢獻(xiàn)：梁友芳、農(nóng)清清、覃健敏進(jìn)行課題設(shè)計(jì)與實(shí)施、資料收集整理、撰寫(xiě)論文、成文并對(duì)文章負(fù)責(zé)；韋宏曠、郭堯平、范譽(yù)、班彩霞進(jìn)行課題實(shí)施、評(píng)估、資料收集；李慕軍進(jìn)行質(zhì)量控制及審校。

本文無(wú)利益沖突。

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(本文編輯：吳立波)

Association of 5-HT R2A Gene Polymorphism and Attention Deficit Hyperactivity Disorder in Children

LIANGYou-fang,NONGQing-qing,QINJian-min，etal.

TheFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the association between 5-HT R2A gene single nucleotide polymorphisms and attention deficit hyperactivity disorder(ADHD) in children.MethodsBy random number table method,we enrolled 158 ADHD children as case group,from ADHD children found in the ADHD epidemiological sampling survey among children in Guangxi Province conducted from December 2011 to January 2013.We also enrolled 159 children without ADHD with matching genders and ages among normal population in the same residential areas of children with ADHD as control group.From each subject,5 ml peripheral venous blood was sampled,and DNA was extracted.According to the data about SNPs in the 5-HT R2A gene of Chinese provided by HapMap and relevant literature published at home and abroad,we selected 14 SNPs and designed primer sequence.After PCR amplification,genotypes were determined at the reaction endpoint.ResultsCase group and control group were significantly different in the genotype distribution of rs2770304,rs985934 and rs6311 locus;case group was higher in the frequency of CC/CT genotype and lower in the frequency of TT genotype than control group(P<0.05).Case group was higher than control group in the frequency of alleles associated with rs2770304,rs985934,rs4941573,rs2070040,rs6313 and rs6311 locus(P<0.05).Strong linkage disequilibrium existed among rs1745837,rs3742279 and rs2296972 locus (D′ and r2 were both larger than 0.95),among rs2770304,rs985934 and rs4941573 locus,among rs2070040,rs6313 and rs6311 locus.Case group was higher in the haplotype frequency of CCA and ACC and lower in the frequency of haplotype TTG and GTT than control group (P<0.05).ConclusionThe polymorphism of rs2770304,rs985934,rs4941573,rs2070040,rs6313 and rs6311 locus and haplotype CCA,ACC,TTG and GTT of 5-HT R2A gene may be correlated with ADHD in children.

【Key words】Attention deficit disorder with hyperactivity；5-Hydroxytryptamine；Polymorphism,single nucleotide；Linkage disequilibrium

(收稿日期：2015-10-15；修回日期：2016-03-04)

【中圖分類號(hào)】R 742.89

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

doi：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.11.012

通信作者：農(nóng)清清，530021廣西南寧市，廣西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院；E-mail：nnqq26@163.com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81360420)；廣西自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(2011GXNSFA018294)；廣西高等學(xué)校重點(diǎn)資助科研項(xiàng)目(201202ZD020)