馬欣燕+王國正+郭成金

摘要： 為篩選出印度塊菌（Tuber indicum）最適用的液體培養(yǎng)基，以印度塊菌菌絲體生物量為測量指標(biāo)，采用L9（34）正交試驗方法對各配比的印度塊菌液體培養(yǎng)基進(jìn)行研究。結(jié)果表明，印度塊菌最適液體培養(yǎng)基為20.00 g/L葡萄糖，15.00 g/L麥芽糖，1.50 g/L蛋白胨，2.50 g/L酵母浸粉，3.00 g/L KH2PO4，1.50 g/L MgSO4·7H2O，0.008 g/L維生素B1，pH值自然。25 ℃、120 r/min搖瓶培養(yǎng)120 h，其菌絲生物量干質(zhì)量可達(dá)9.58 g/L。

關(guān)鍵詞： 印度塊菌；正交試驗；液體培養(yǎng)基；菌絲體；生物量

中圖分類號： S646.04 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2016）03-0200-03

印度塊菌（Tuber indicum）屬子囊菌門（Ascomycota）盤菌綱（Pezizomycetes）盤菌目（Pezizales）塊菌科（Tuberaceae）塊菌屬（Tubera）[1]，是一種極為珍貴的菌根食用菌。印度塊菌主要分布在中國西南地區(qū)的云南省、四川??；云南省主要分布在昆明、曲靖、麗江、玉溪、保山、楚雄州、大理州、迪慶州、怒江州等地，四川省主要分布在攀枝花地區(qū)、涼山州[2]。印度塊菌常生長于云南松、華山松林及高山櫟下[3]。據(jù)報道，我國出產(chǎn)的印度塊菌所含糖、蛋白質(zhì)、氨基酸、礦物質(zhì)、維生素等成分很高，可與黑孢塊菌（Tuber melonosporum）相媲美[4]。此外，印度塊菌所含有的活性成分如塊菌多糖、α-雄烷醇等具有提高免疫力、抗氧化、抗腫瘤及調(diào)節(jié)女性月經(jīng)等功效[5-9]。

至今，國內(nèi)外對印度塊菌的研究報道主要是在活性物質(zhì)特性、提取純化[5-10]、人工栽培[11-12]等方面，未見印度塊菌液體培養(yǎng)基篩選方面的相關(guān)研究報道。筆者試圖通過碳、氮源單因素試驗并結(jié)合L9（34）正交試驗方法的研究，篩選出印度塊菌最適液體培養(yǎng)基，旨在為印度塊菌菌種生產(chǎn)、原生質(zhì)體融合、紫外誘變育種以及液體發(fā)酵活性物質(zhì)提取等研究提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 菌種

印度塊菌（Tuber indicum），由天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院蕈菌研究室提供。

1.2 試驗試劑

葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、蛋白胨、酵母浸粉、KH2PO4、 MgSO4·7H2O、維生素B1、瓊脂，均為分析純，購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 試驗儀器

YXQG02手提式壓力蒸汽消毒器，山東新華醫(yī)療器械廠；Sartorius BS/BT系列電子天平，德國賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；SW-CJ-2超凈工作臺，上海錦屏儀器儀表有限公司；SPX型生化培養(yǎng)箱，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；101型電熱鼓風(fēng)干燥箱，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司。

1.4 培養(yǎng)基

1.4.1 活化培養(yǎng)基 200.00 g/L馬鈴薯（浸提液）、20.00 g/L 葡萄糖、3.00 g/L KH2PO4、1.50 g/L MgSO4·7H2O、0.004 g/L維生素B1、20.00 g/L瓊脂。

1.4.2 碳源初選培養(yǎng)基 分別以20.00 g/L葡萄糖、20.00 g/L 蔗糖、20.00 g/L麥芽糖、200.00 g/L馬鈴薯（浸提液）、2.00 g/L乳糖為供試碳源。其他成分為：2.00 g/L蛋白胨、3.00 g/L KH2PO4、1.50 g/L MgSO4·7H2O、0.004 g/L維生素B1，pH值自然。

1.4.3 氮源初選培養(yǎng)基 分別以2.00 g/L蛋白胨、2.00 g/L酵母浸粉、20.00 g/L麥麩（取浸提液）、2.00 g/L硫酸銨、2.00 g/L 硝酸銨為供試氮源。其他成分為：20.00 g/L葡萄糖、3.00 g/L KH2PO4、1.50 g/L MgSO4·7H2O、0.004 g/L維生素B1，pH值自然。

1.5 試驗方法

1.5.1 菌種活化與提純復(fù)壯 在無菌條件下，將菌種用活化培養(yǎng)基提前5 d活化，挑取強(qiáng)壯菌絲尖端，接種于斜面培養(yǎng)基上復(fù)壯，于25 ℃培養(yǎng)5～7 d備用。

1.5.2 轉(zhuǎn)接液體培養(yǎng)基 采用100 mL錐形瓶，裝液量為 50 mL，每瓶接種5塊0.5 cm2菌塊，于25 ℃靜置培養(yǎng)48 h，然后于25 ℃、120 r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng)120 h，每個水平設(shè)3組重復(fù)。

1.5.3 菌絲體干質(zhì)量測量 濾紙分別編號后置電子天平上稱質(zhì)量，后將培養(yǎng)120 h的印度塊菌菌絲體培養(yǎng)物分別用相對應(yīng)編號濾紙抽濾，蒸餾水洗滌3次后，置于80 ℃烘箱烘干至恒質(zhì)量、稱量。

1.5.4 碳源、氮源培養(yǎng)基正交試驗 依據(jù)碳、氮源單因素試驗結(jié)果，以菌絲體干質(zhì)量均值為標(biāo)準(zhǔn)，分別選擇2個均值較高的碳源、氮源，按L9（34）設(shè)計4因素3水平正交試驗進(jìn)行復(fù)選，與3.00 g/L KH2PO4、1.50 g/L MgSO4·7H2O、0.004 g/L維生素B1 組成9組試驗配方，正交試驗因素與水平設(shè)計見表1。

1.5.5 無機(jī)鹽及維生素水平試驗 根據(jù)混合碳、氮源正交試驗結(jié)果，選出最佳碳源、氮源組合為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，再向其中添加不同濃度配比的KH2PO4 、 MgSO4·7H2O和維生素B1，具體處理見表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同碳素營養(yǎng)對印度塊菌菌絲體生長的影響

碳源是蕈菌培養(yǎng)基的主要營養(yǎng)成分之一，也是蕈菌菌絲細(xì)胞碳架結(jié)構(gòu)、生長以及代謝的重要能量物質(zhì)來源[13]。一些蕈菌相關(guān)研究表明，碳源主要對細(xì)胞生長和活性生物成分的合成有較大影響[14-15]。從表3可以看出，印度塊菌對5種碳源均有不同程度的利用，以菌絲生物量為標(biāo)準(zhǔn)來看，其中麥芽糖的利用率最高，葡萄糖次之，乳糖最差。由表4可見，統(tǒng)計學(xué)方差分析F值為11.242，F(xiàn)>F4，10，0.01=5.994[16]，表明不同碳源培養(yǎng)基對印度塊菌菌絲體生物量的影響在α=0.01水平上差異顯著，依據(jù)印度塊菌菌絲生物量大小，選擇麥芽糖、葡萄糖進(jìn)行碳氮源正交試驗。

2.2 不同氮素營養(yǎng)對印度塊菌菌絲體生長的影響

氮源是食用菌細(xì)胞合成蛋白質(zhì)和核酸必不可少的主要原料[17]。經(jīng)前人試驗表明，蕈菌對有機(jī)氮和無機(jī)氮均可利用且對前者的利用率高于后者[18-19]。為了全面詳細(xì)地研究氮源對印度塊菌菌絲體的影響，筆者對有機(jī)氮和無機(jī)氮的使用都進(jìn)行了探索。試驗結(jié)果表明，氮源對印度塊菌菌絲體生物量的影響有一定差異。以酵母浸粉為氮源的培養(yǎng)基生物量最大，以硝酸銨為氮源的培養(yǎng)基生物量最小。有機(jī)氮源中以酵母浸粉為氮源的培養(yǎng)基菌絲體生物量最高，蛋白胨次之，麥麩最差；而無機(jī)氮源中以硫酸銨為氮源的培養(yǎng)基菌絲體生物量要高于硝酸銨氮源的。一般的NH4+鹽比NO3-鹽優(yōu)先被利用，NO3-進(jìn)入細(xì)胞后需要還原成NH4+后才能參與細(xì)胞物質(zhì)合成[20]。方差分析（表5、表6）表明，印度塊菌對氮源的利用存在顯著差異，且酵母浸粉、蛋白胨要優(yōu)于其他3種氮源，因此選擇酵母浸粉、蛋白胨進(jìn)行碳氮源正交試驗。

2.3 正交試驗結(jié)果與分析

由正交試驗結(jié)果和極差分析（表7）可知，影響印度塊菌菌絲生物量的大小關(guān)系為A>B>C>D。極差越大，各因素在水平變動時對生物量變化的影響就越大[21-22]。因此可知，葡萄糖是影響印度塊菌菌絲生物量的主要因素。k1、k2、k3之間的差異是由因素取不同水平所引起，且k值相對較大的因素水平是較好的培養(yǎng)條件[23]。依據(jù)水平之間k值大小可知，印度塊菌最佳液體培養(yǎng)基組合為A3B3C3D1，即20.00 g/L葡萄糖，15.00 g/L麥芽糖，1.50 g/L蛋白胨，2.50 g/L酵母浸粉。

2.4 不同無機(jī)鹽和維生素B1濃度對印度塊菌菌絲生物量的影響

無機(jī)鹽中礦質(zhì)元素、維生素B1的存在及濃度均對新陳代謝過程起著重要作用[13]，兩者比例大小會對于菌絲生長起到促進(jìn)或延緩的作用[23-24]。為了完善培養(yǎng)基，使其營養(yǎng)均衡，對無機(jī)鹽、維生素B1的濃度也進(jìn)行了篩選，結(jié)果見表8。表9方差分析結(jié)果表明，不同處理間差異極顯著。其中無機(jī)鹽、維生素B1濃度的最佳組合為處理3，即 3.00 g/L KH2PO4、1.50 g/L MgSO4·7H2O、0.008 g/L維生素B1。

通過對最終所獲得的印度塊菌最佳液體培養(yǎng)基配方進(jìn)行3次重復(fù)試驗，結(jié)果所得菌絲平均生物量干質(zhì)量為9.58 g/L。

2.5 搖瓶培養(yǎng)前后印度塊菌菌絲量和形態(tài)對比

以最終獲得的印度塊菌最佳液體培養(yǎng)基配方進(jìn)行驗證試驗，從圖1、圖2可以看出，印度塊菌在搖瓶培養(yǎng)前后菌絲量對比差異明顯。搖瓶培養(yǎng)前，靜置48 h后的培養(yǎng)基清澈透亮，印度塊菌菌片漂于培養(yǎng)上或沉于瓶底，菌片上有絨狀、極短的新生菌絲（圖1）。搖瓶培養(yǎng)120 h后，培養(yǎng)基渾濁，可觀察到有大小不一的菌絲球和絮狀菌絲，瓶壁內(nèi)側(cè)有白色絨狀氣生菌絲（圖2）。

3 結(jié)論

通過單因素試驗、正交試驗相結(jié)合的研究方法得出印度

塊菌最適液體培養(yǎng)基，為今后印度塊菌液體發(fā)酵活性物質(zhì)提取提供理論依據(jù)，從而更加有效地利用這一珍貴的蕈菌資源。最終獲得的印度塊菌最適液體培養(yǎng)基配方：20.00 g/L葡萄糖，15.00 g/L麥芽糖，1.50 g/L蛋白胨，2.50 g/L酵母浸粉，3.00 g/L KH2PO4、1.50 g/L MgSO4·7H2O，0.008 g/L維生素B1，pH值自然。25 ℃、120 r/min培養(yǎng)120 h，其生物量可達(dá)9.58 g/L。

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