屈俊廷+金海強(qiáng)+沈國(guó)娟+楊超博+李熙英

摘要： 研究了解淀粉芽孢桿菌Y-S-Y12菌株液體最佳發(fā)酵條件，旨在為提高其活性次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量提供技術(shù)支持。通過(guò)不同培養(yǎng)條件、營(yíng)養(yǎng)條件、單因素試驗(yàn)和均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)，對(duì)該菌株的最適發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Y-S-Y12菌株的最佳發(fā)酵時(shí)間為3 d，最佳發(fā)酵溫度為28～33 ℃，最佳轉(zhuǎn)速為150 r/min，最佳裝液量為125 mL（培養(yǎng)容器的容量為250 mL），最佳初始pH值為6，供試培養(yǎng)基中Y-S-Y12菌株在NA培養(yǎng)基中的發(fā)酵效果最佳。Y-S-Y12菌株最優(yōu)配方為1.20 g葡萄糖、3.10 g酵母粉、2.00 g磷酸氫二鉀、24.86 g牛肉膏。

關(guān)鍵詞： 解淀粉芽孢桿菌；抑菌率；均勻設(shè)計(jì)；發(fā)酵條件優(yōu)化；人參銹腐病

中圖分類號(hào)： S435.675 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）03-0158-03

解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）廣泛分布在自然界中，如植物體內(nèi)、植物根際、土壤、深海水中均有分布。它們與枯草芽孢桿菌親緣性很高，可以產(chǎn)生對(duì)多種真菌與細(xì)菌具有抑制作用的多種代謝產(chǎn)物。因?yàn)榻獾矸垩挎邨U菌存在廣泛、易分離、易培養(yǎng)，能抑制植物病害，非致病，安全使用對(duì)普通人畜群體無(wú)害，而且不污染環(huán)境，因而特別受重視[1-5]。將解淀粉芽孢桿菌制成生物制劑，植物花部、枝干、葉、根部都可使用，施用方法可以采取對(duì)農(nóng)作物拌種、灌根、噴施等，可廣泛應(yīng)用于作物采收前后的病害防治上，也有研究指出可應(yīng)用于糧食果蔬儲(chǔ)存保鮮上[6]。因此，解淀粉芽孢桿菌在植物病害生物防治方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

Y-S-Y12菌株是金海強(qiáng)等[7-8]從楊樹(shù)枝條中分離出來(lái)的拮抗菌株。結(jié)合形態(tài)學(xué)、培養(yǎng)特征及分子生物學(xué)方法鑒定Y-S-Y12菌株為解淀粉芽孢桿菌，是一種與枯草芽孢桿菌親緣性很高的細(xì)菌，該菌在生長(zhǎng)過(guò)程中可以產(chǎn)生一系列能夠抑制真菌和細(xì)菌活性的代謝物，對(duì)植物病原菌具有強(qiáng)烈抑制作用[3，9]。經(jīng)過(guò)田間防病試驗(yàn)和室內(nèi)抑菌試驗(yàn)，Y-S-Y12菌株對(duì)人參銹腐病（Cylindrocarpon destructans）的抑制作用最強(qiáng)，同時(shí)還有促進(jìn)人參生長(zhǎng)作用。另外，Y-S-Y12發(fā)酵濃縮液對(duì)人參銹腐病菌也具有較強(qiáng)的抑制活性。有關(guān)Y-S-Y12菌株發(fā)酵條件優(yōu)化方面未見(jiàn)報(bào)道。對(duì)此，進(jìn)行Y-S-Y12菌株發(fā)酵條件的優(yōu)化試驗(yàn)，以期為Y-S-Y12菌株的擴(kuò)大培養(yǎng)以及規(guī)?；a(chǎn)菌劑打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法：

1.1 供試菌和培養(yǎng)基

供試菌為人參銹腐病菌和Y-S-Y12菌株，均由延邊大學(xué)植物病理實(shí)驗(yàn)室保存。

供試培養(yǎng)基為NA培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、KB培養(yǎng)液、LB培養(yǎng)液，NA培養(yǎng)液，PDA培養(yǎng)液、基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基[10]。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化及種子菌的制備 將Y-S-Y12菌株轉(zhuǎn)接在NA培養(yǎng)基中，在25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后取2環(huán)接種在NA培養(yǎng)液中，放入恒溫30.6 ℃，轉(zhuǎn)速為120 r/min搖床中振蕩培養(yǎng)48 h，得到種子菌。

1.2.2 發(fā)酵濃縮液 將不同培養(yǎng)條件的發(fā)酵液用 4 000 r/min 離心機(jī)分離20 min，再過(guò)濾，將濾液濃縮到10%，滅菌待用。

1.2.3 不同培養(yǎng)條件對(duì)Y-S-Y12菌株發(fā)酵的影響 以溫度為30.6 ℃，種子菌的接種量為1%，轉(zhuǎn)速120 r/min，培養(yǎng)48 h為基本條件。在基礎(chǔ)條件不變的情況下，不同培養(yǎng)時(shí)間（1、2、3、4、5、6、7 d），不同培養(yǎng)溫度（23、28、33、38、43、48、53 ℃），不同轉(zhuǎn)速（70、90、110、130、150、170、190 r/min），不同裝液量（在250 mL的三角瓶中加入培養(yǎng)基量為50、75、100、125、150、175、200 mL），不同的起始pH值（4、5、6、7、8、9、10）及不同培養(yǎng)基（LB、NA、KB、PDA），測(cè)定發(fā)酵液在580 nm處的吸光值及發(fā)酵濃縮液對(duì)人參銹腐病菌的抑菌率，根據(jù)不同處理的菌體生長(zhǎng)量和抑菌活性的大小確定最佳發(fā)酵條件。

抑菌活性測(cè)定采用雙層培養(yǎng)基打孔法。先在PDA平板中間放入直徑8 mm的人參銹腐病菌的菌碟1片，在菌碟兩邊1.5 cm處將第2層培養(yǎng)基打孔放置滴200 μL發(fā)酵濃縮液（2邊對(duì)稱），以只放置人參銹腐病菌菌碟的為對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3個(gè)培養(yǎng)皿，放入20 ℃恒溫箱培養(yǎng)6 d，測(cè)人參銹腐病菌菌落直徑，計(jì)算抑菌率。

[JZ]抑菌率=[SX（]對(duì)照病菌菌落寬度-處理病菌菌落寬度 對(duì)照病菌菌落寬度-接種時(shí)菌碟寬度[SX）]×100%。

1.2.4 不同碳源對(duì)Y-S-Y12菌株發(fā)酵的影響 在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中氮源含量和其他培養(yǎng)條件不變的情況下[11-13]，分別用蔗糖、檸檬酸鈉、乙酸鈉、乳糖、麥芽糖、淀粉等量替換基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖，以基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基作對(duì)照，測(cè)定不同碳源的發(fā)酵無(wú)菌液對(duì)人參銹腐病菌抑菌活性的影響，抑菌活性大小和菌量測(cè)定方法同“1.2.3”節(jié)。

1.2.4 不同氮源對(duì)Y-S-Y12菌株發(fā)酵的影響 在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源含量和其他培養(yǎng)條件不變的情況下，分別用牛肉膏、硝酸鈉、硝酸鉀、氯化銨、尿素等量替換基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的胰蛋白胨，以基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基作對(duì)照，測(cè)定不同氮源的發(fā)酵無(wú)菌液對(duì)人參銹腐病菌抑菌活性的影響，抑菌活性大小和菌量測(cè)定方法同“1.2.3”節(jié)。

1.2.5 無(wú)機(jī)鹽對(duì)發(fā)酵液抑菌活性的影響 在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源含量、氮源含量和其他培養(yǎng)條件不變的情況下，用硫酸鎂、硫酸鐵、硫酸鋅、磷酸二氫鉀等量替換培養(yǎng)基中的碳酸鈣，以基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基作對(duì)照，測(cè)定不同無(wú)機(jī)鹽對(duì)人參銹腐病菌抑菌活性的影響，抑菌活性大小和菌量測(cè)定方法同“1.2.3”節(jié)。

1.2.6 均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn) 在確定主要碳、氮源的基礎(chǔ)上，對(duì)葡萄糖、牛肉膏、酵母粉、磷酸氫二鉀進(jìn)行單因子試驗(yàn)，采用不同濃度梯度（葡萄糖0～2 g，依次增加0.4 g；酵母粉0～0.1 g，依次增加0.02 g；磷酸氫二鉀0.1～0.2 g，依次增加0.02 g；牛肉膏1.5～2.5 g，依次增加0.2 g）。本研究采用DPS 7.05數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，在以上試驗(yàn)的基礎(chǔ)上選擇均勻設(shè)計(jì)法[14-15] U46的均勻設(shè)計(jì)表，用均勻設(shè)計(jì)使用表設(shè)計(jì)方案進(jìn)行了多水平試驗(yàn)，并結(jié)合偏最小二乘回歸分析[16]對(duì)其營(yíng)養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)條件對(duì)Y-S-Y12菌株發(fā)酵的影響

2.1.1 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)Y-S-Y12菌株發(fā)酵的影響 隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，D值和抑菌率均有增加的趨勢(shì)，其中培養(yǎng) 3 d 時(shí)D值和抑菌率達(dá)到了高峰，隨后D值和抑菌率均有下降趨勢(shì)（表1）。結(jié)果表明，Y-S-Y12菌株的最佳發(fā)酵時(shí)間為3 d。

2.1.2 不同溫度處理對(duì)Y-S-Y12菌株發(fā)酵的影響 隨著溫度的增加，Y-S-Y12菌株的D值和抑菌率均有增加的趨勢(shì)。當(dāng)培養(yǎng)溫度為28 ℃時(shí)D值最高，其次為33 ℃時(shí)的D值；培養(yǎng)溫度為33 ℃時(shí)的抑菌率最高，其次為28 ℃時(shí)的抑菌率。之后隨著溫度的增高D值和抑菌率均有下降的趨勢(shì)（表2）。結(jié)果表明，Y-S-Y12菌株的最佳發(fā)酵溫度為28～33 ℃。

2.1.3 不同轉(zhuǎn)速處理對(duì)Y-S-Y12菌株發(fā)酵的影響 隨著轉(zhuǎn)速的增加，Y-S-Y12菌株的D值和抑菌率均有增加的趨勢(shì)。當(dāng)轉(zhuǎn)速為150 r/min時(shí)D值和抑菌率達(dá)到了高峰 （表3）。結(jié)果表明，Y-S-Y12菌株最佳發(fā)酵轉(zhuǎn)速為 150 r/min。

2.1.4 不同裝液量處理對(duì)Y-S-Y12菌株發(fā)酵濃縮液的影響 隨著裝液量的增加，Y-S-Y12的D值和抑菌率均有增加的趨勢(shì)。當(dāng)裝液量為125 mL時(shí)D值和抑菌率達(dá)到了高峰，其次是100 mL的D值和抑菌率（表4）。結(jié)果表明，Y-S-Y12 菌株最佳發(fā)酵裝液量為125 mL。

2.1.5 不同pH值處理對(duì)Y-S-Y12菌株發(fā)酵的影響 隨著pH值的增加，Y-S-Y12的D值和抑菌率均有增加的趨勢(shì)。當(dāng)pH值=6時(shí)D值和抑菌率達(dá)到了高峰，之后隨著pH值的增加D值和抑菌率有下降趨勢(shì)（表5）。結(jié)果表明，Y-S-Y12 菌株最佳發(fā)酵pH值為6。

2.1.6 不同培養(yǎng)基處理對(duì)Y-S-Y12菌株發(fā)酵的影響 在NA培養(yǎng)基上Y-S-Y12菌株的D值和抑菌率最高，其次為KB培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基上的D值和抑菌率（表6）。結(jié)果表明，Y-S-Y12菌株在NA培養(yǎng)基上發(fā)酵較好。

2.2 不同營(yíng)養(yǎng)條件對(duì)Y-S-Y12菌株發(fā)酵的影響

不同碳源對(duì)Y-S-Y12菌株發(fā)酵的影響較大。其中以葡萄糖為碳源時(shí)的D值和抑菌率最高，其次為蔗糖，再次為麥芽糖（表7）。結(jié)果表明，Y-S-Y12菌株最佳發(fā)酵碳源為葡萄糖。

不同氮源對(duì)Y-S-Y12菌株發(fā)酵的影響較大。其中以牛肉膏為氮源時(shí)的D值和抑菌率最高，其次為胰蛋白胨，再次為硝酸鈉（表8）。結(jié)果表明，Y-S-Y12菌株最佳發(fā)酵氮源為牛肉膏。

不同無(wú)機(jī)鹽對(duì)Y-S-Y12菌株發(fā)酵的影響較大。其中磷酸氫二鉀為無(wú)機(jī)鹽時(shí)的D值和抑菌率最高，其次為硫酸鎂和硫酸鐵，再次為碳酸鈣（表9）。結(jié)果表明，Y-S-Y12菌株最佳發(fā)酵無(wú)機(jī)鹽為磷酸氫二鉀。

2.3 碳、氮源單因素試驗(yàn)和均勻設(shè)計(jì)法優(yōu)化

均勻設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表10。采用偏最小二乘回歸[CM（25]法對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸建模分析，得到如下二次多項(xiàng)式回

3 結(jié)論

Y-S-Y12菌株的單因素培養(yǎng)條件優(yōu)化結(jié)果表明，培養(yǎng)時(shí)間為 3 d，培養(yǎng)溫度為28～33 ℃，轉(zhuǎn)速為150 r/min，裝液量為 125 mL（培養(yǎng)容器的容量為250 mL），初始pH值為6時(shí)的發(fā)酵效果最好；供試培養(yǎng)基中Y-S-Y12菌株在NA培養(yǎng)基中的發(fā)酵效果最佳。

通過(guò)不同碳源、氮源及無(wú)機(jī)鹽對(duì)Y-S-Y12菌株發(fā)酵的影響研究，以葡萄糖為碳源，牛肉膏為氮源，磷酸氫二鉀為無(wú)機(jī)鹽時(shí)的發(fā)酵效果最好。進(jìn)一步使用均勻設(shè)計(jì)法尋找最佳培養(yǎng)基配方，結(jié)果表明，最優(yōu)配方為1.20 g葡萄糖、3.10 g酵母粉、2.00 g磷酸氫二鉀、24.86 g牛肉膏，此時(shí)抑菌率為51.10%。

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