蔣景龍

摘要： 為揭示H2O2和生長素在山黧豆[Lathyrus quinquenervius （Miq.） Litv.]初生根發(fā)育中的作用，外源性施加H2O2或生長素處理山黧豆初生根，并分析初生根的形態(tài)變化，檢測內(nèi)源H2O2和生長素水平變化。結(jié)果顯示：施加H2O2阻止了初生根向地性生長而誘導(dǎo)其發(fā)生水平方向彎曲；施加吲哚-3-丁酸（IBA）、2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）和α-萘乙酸（α-NAA）能夠完全抑制由外源H2O2引起的初生根水平彎曲；在施加外源H2O2條件下，添加生長素的極性運(yùn)輸抑制劑2，3，5-三碘苯甲酸（TIBA）與1-萘氨甲酰苯甲酸（NPA），不能抑制初生根水平彎曲；外源H2O2處理降低了初生根內(nèi)源的吲哚乙酸（IAA）和H2O2水平。研究結(jié)果表明，外源H2O2影響內(nèi)源H2O2與IAA水平，導(dǎo)致初生根的水平彎曲。

關(guān)鍵詞： 過氧化氫（H2O2）；初生根；彎曲；生長素；山黧豆

中圖分類號： Q945.78 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2016）03-0121-03

過氧化氫（H2O2）作為一種信號分子在植物的生長發(fā)育過程中參與了許多生理活動，如氣孔的運(yùn)動、細(xì)胞壁的木質(zhì)化、根的向地性生長、側(cè)根的發(fā)育、細(xì)胞程序化死亡與花粉和柱頭的相互作用等[1]。此外，當(dāng)遭受輕度生物或非生物脅迫時，植物體內(nèi)產(chǎn)生的H2O2能夠通過參與各種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)節(jié)植物的代謝（如光合作用、呼吸作用、蒸騰作用）和防衛(wèi)系統(tǒng)（如抗氧化脅迫的酶系統(tǒng)與非酶系統(tǒng)），使植物獲得生物或非生物脅迫的抗性[2-3]。因此，H2O2成為當(dāng)今細(xì)胞與分子生物學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)，但大多數(shù)研究主要集中在內(nèi)源H2O2參與植物的生長發(fā)育及對各種環(huán)境刺激的應(yīng)答方面，而外源H2O2如何影響植物生長發(fā)育方面的研究卻鮮有報道[4]。前期研究發(fā)現(xiàn)，外源H2O2處理山黧豆[Lathyrus quinquenervius （Miq.） Litv.]種子能夠抑制初生根向地性生長并誘導(dǎo)發(fā)生水平方向彎曲。在胚根突破種皮后，面對的外部環(huán)境比較復(fù)雜，種子萌發(fā)的后期，其生長發(fā)育會受到一些環(huán)境因子如重力、水分、營養(yǎng)及其他化學(xué)物質(zhì)刺激的影響而發(fā)生根形態(tài)的變化。很多研究表明，初生根的向地性彎曲生長與生長素的不對稱性分布、水平變化和極性運(yùn)輸有關(guān)[5]。當(dāng)植物根被水平放置時，根尖會感受到重力的刺激，然后將這種信號進(jìn)行轉(zhuǎn)化與傳遞，從而影響生長素的極性運(yùn)輸，最終在伸長區(qū)表現(xiàn)出上側(cè)的細(xì)胞中生長素濃度較低，而下側(cè)細(xì)胞內(nèi)的生長素濃度較高，出現(xiàn)了生長素的局部不對稱性分布，最終表現(xiàn)出在伸長區(qū)發(fā)生向重力性的彎曲生長[6-7]。生長素存在獨(dú)特的運(yùn)輸機(jī)制，只能在細(xì)胞與細(xì)胞之間進(jìn)行極性運(yùn)輸。而這一極性運(yùn)輸?shù)倪^程又可被其極性運(yùn)輸抑制劑2，3，5-三碘苯甲酸（TIBA）和1-萘氨甲酰苯甲酸（NPA）所抑制。本研究同時用外源的生長素、H2O2與生長素的極性運(yùn)輸抑制劑組合處理，檢測H2O2與生長素含量變化來研究H2O2誘導(dǎo)的初生根水平彎曲與生長素之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

山黧豆種子均由蘭州大學(xué)細(xì)胞活動與逆境適應(yīng)教育部重點(diǎn)實驗室的細(xì)胞研究所302實驗室提供。挑選籽粒飽滿、無損壞的定西山黧豆、阿克蘇山黧豆和扁莢山黧豆種子，用自來水沖洗3次，然后將洗凈的山黧豆種子分別用不同濃度的H2O2處理60 h。H2O2的濃度分別為10、20、40 mmol/L。只加蒸餾水而沒有加H2O2的設(shè)為對照組，H2O2處理了60 h后重新放入到水中培養(yǎng)24 h的為恢復(fù)組。以上所有的山黧豆種子均水平放置在培養(yǎng)皿的底部，即胚根的方向與培養(yǎng)皿的底面相平行。

1.2 試驗方法

采用H2O2與生長素、H2O2與生長素極性運(yùn)輸抑制劑的組合處理。

吲哚乙酸（IAA）在空氣中容易氧化，選擇吲哚-3-丁酸（IBA）代替IAA。另外，2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）和α-萘乙酸（α-NAA）均是生長素的類似物。TIBA、NPA均為生長素的極性運(yùn)輸抑制劑，其中只加外源H2O2的組作為對照。

1.3 H2O2與IAA的含量檢測方法

H2O2與IAA的含量檢測分別參照J(rèn)iao等的方法[8]和Dobrev等的方法[9]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用Origin 7.5 SR1和SPSS 16.0軟件進(jìn)行制圖和統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源H2O2抑制向地性生長并誘導(dǎo)初生根的水平彎曲

由圖1-a所示，將定西山黧豆、阿克蘇山黧豆和扁莢山黧豆種子水平放置在盛有少許蒸餾水的培養(yǎng)皿中萌發(fā)，36 h后胚根突破種皮，由于重力的作用，48～60 h初生根開始沿著重力的方向發(fā)生向地性彎曲。將這些種子同樣水平放置在盛有不同濃度H2O2的培養(yǎng)皿中，它們的初生根則不會發(fā)生正常的向地性彎曲，而沿著水平方向發(fā)生彎曲（圖1-a）。這種彎曲的方式不同于向地性彎曲，其彎曲的方向與向地性彎曲相互垂直，因此稱為水平彎曲。僅施加H2O2的初生根會發(fā)生水平彎曲（圖1-b-A）；當(dāng)同時施加IBA和H2O2或2，4-D和H2O2時，初生根既沒有發(fā)生水平彎曲也沒有發(fā)生向地性彎曲（圖1-b-B）；當(dāng)同時施加α-NAA和H2O2時，水平彎曲生長被完全逆轉(zhuǎn)且在胚軸的部位與對照組相比還明顯地發(fā)生了加粗生長（圖1-b-C）。

2.2 H2O2與生長素、H2O2與生長素抑制劑處理對根水平彎曲的影響

IBA抑制初生根水平彎曲存在著劑量關(guān)系，即IBA的濃度越高，抑制水平彎曲的作用就越明顯，低于最低濃度閾值，IBA不能抑制初生根的水平彎曲（表1）。當(dāng)IBA的濃度為 1.0×10-3～1.0×10-2 μmol/L時，初生根的彎曲率達(dá) 79.97% 以上，表明低濃度的IBA對初生根的水平彎曲率的抑制效果不明顯；但當(dāng)IBA的濃度超過1.0 μmol/L時，初生根的水平彎曲率僅為17.77%。這些數(shù)據(jù)表明，施加的IBA濃度越高，抑制作用越明顯。在一些有生長素參與的植物生長發(fā)育中，如果用生長素的特異性極性運(yùn)輸抑制劑如TIBA、NPA處理，會抑制一些正常的生長發(fā)育，例如植物根的向地

性生長。在本試驗中，同時施加2種生長素的極性運(yùn)輸抑制劑TIBA或NPA與H2O2進(jìn)行處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用5～50 μmol/L TIBA 或NPA處理，均不能抑制由H2O2誘導(dǎo)的初生根的水平彎曲。

2.3 外源H2O2處理影響了初生根內(nèi)源H2O2和生長素水平

通過雙酶法對初生根內(nèi)的H2O2含量進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖2所示。對照組初生根內(nèi)的H2O2含量為0.85 μmol/g，而經(jīng)H2O2處理后初生根內(nèi)的H2O2含量明顯低于對照組，但10、20、40 mmol/L H2O2處理組之間并沒有顯著性的差異。將處理了60 h的山黧豆幼苗重新放回水中恢復(fù)24 h后，內(nèi)源H2O2水平再次升高，但仍低于對照組中的H2O2含量（圖3），這表明外源施加H2O2處理降低了內(nèi)源的H2O2積累。

同時通過高效液相色譜方法檢測初生根內(nèi)的IAA水平。結(jié)果顯示，對照組初生根的生長素鮮質(zhì)量含量達(dá)到了 1.6 μg/g，而20 mmol/L H2O2處理60 h的初生根中的生長素含量不足1.2 μg/g，降低了大約25%（圖4），這表明施加外源H2O2后，初生根內(nèi)源的生長素水平顯著降低。

3 結(jié)論與討論

過氧化氫作為一種信號分子在植物體內(nèi)發(fā)揮了許多重要作用，近幾年越來越多的研究者開始選擇通過施加外源性的H2O2處理植物的方法來研究其對植物生長發(fā)育的影響[10-11]。外源H2O2能夠促進(jìn)大麥、百日草、菠菜、豌豆、樟腦等種子的萌發(fā)[12]。外部環(huán)境因子能影響植物根的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，而植物的根也能在最初感受刺激后作出相應(yīng)的應(yīng)答[13]。在面對各種環(huán)境刺激后，植物的根系能夠表現(xiàn)出一種不對稱的生長模式，例如卷曲、彎曲、螺旋、波浪、傾斜等[14]。Li等的研究表明，施加外源H2O2能與生長素相互作用誘導(dǎo)黃瓜、綠豆的不定根生長[15-16]。Joo 等在玉米初生根的向地性生長研究中發(fā)現(xiàn)，活性氧（主要是H2O2）在生長素的下游參與了向地性應(yīng)答的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[17]。本研究結(jié)果顯示，外源性施加H2O2不僅阻止了山黧豆初生根的向地性生長，還引起了初生根在水平方向上發(fā)生形態(tài)學(xué)的彎曲現(xiàn)象。初生根的彎曲一般由根兩側(cè)的細(xì)胞伸長速率差異引起，而這種差異又往往與生長素的分布和極性運(yùn)輸有關(guān)。當(dāng)同時施加一定濃度的H2O2、生長素的類似物如IBA，2，4-D或α-NAA時，這種水平彎曲明顯地被抑制，而且隨著生長素類似物濃度的提高，幾乎可以完全抑制這種由H2O2引起的水平彎曲。外源的H2O2降低了內(nèi)源生長素的水平，而這可能更有利于植物根細(xì)胞兩側(cè)形成不對稱的生長素分布，從而導(dǎo)致水平彎曲的發(fā)生。至于是否促進(jìn)了生長素的不對稱性分布，如何促進(jìn)根兩側(cè)細(xì)胞形成生長素的不對稱性分布等問題，還需要通過對初生根局部區(qū)域生長素進(jìn)行定位研究。

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