董璐+賈紅梅+劉迪+毛洪玉

摘要： 以菊花C008的葉片為試材，分別采用CTAB法、Trizol法、改良Trizol法和試劑盒法等進(jìn)行總RNA提取試驗(yàn)，并對(duì)提取質(zhì)量進(jìn)行分析比較。結(jié)果表明：CTAB法提取的總RNA存在DNA污染。Trizol法提取的總RNA條帶復(fù)雜，有蛋白等雜質(zhì)污染。改良Trizol法提取的總RNA條帶清晰，但RNA存在降解。試劑盒法提取的總RNA條帶清晰，純度更高，D260 nm/D280 nm為1.889，濃度為144.000 μg/mL，是適于菊花葉片總RNA提取的簡(jiǎn)單、高效的方法。

關(guān)鍵詞： 菊花；總RNA；提取方法

中圖分類號(hào)： S682.1+10.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）03-0067-02

菊花（Chrysanthemum morifolium）是中國(guó)十大傳統(tǒng)名花和世界四大切花之一，也是園林綠化中的重要觀賞植物之一，在現(xiàn)代花卉生產(chǎn)中占有重要地位，具有很高的觀賞和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。菊花白色銹病是菊花首要病害之一，在多個(gè)國(guó)家被列為檢疫性病害[1]。尋找菊花中的抗病基因，對(duì)于防治該病具有重要作用。獲得純度高、完整性好的RNA是后期進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、RT-PCR、基因克隆等分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)。菊花的組織器官中含有大量的多糖、酚類、蛋白質(zhì)等次生代謝物質(zhì)，嚴(yán)重干擾了菊花總RNA 的提取質(zhì)量[2]。目前，針對(duì)菊花葉片總RNA的提取有一些報(bào)道[2-5]，但仍不能提取出質(zhì)量好的總RNA。本試驗(yàn)對(duì)4種常用的總RNA提取方法進(jìn)行系統(tǒng)分析比較，發(fā)現(xiàn)試劑盒法對(duì)于菊花葉片總RNA的提取是一種簡(jiǎn)單、高效的方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)花卉基地的菊花C008的葉片為試材，采后立即用錫箔紙包好，用液氮速凍后，在-80 ℃的超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

主要試劑：CTAB緩沖液、10%β-巰基乙醇、氯仿 ∶異戊醇（CI，V ∶V=24 ∶1）、Trizol試劑、異丙醇、無(wú)水乙醇、DECP水、RNA prep Pure Kit試劑盒等。

試驗(yàn)所需的移液槍槍頭、槍頭盒均用0.1%DEPC水浸泡24 h，然后121 ℃高壓滅菌30 min，50 ℃烘干備用。三角瓶、玻璃棒、量筒、研缽、研棒、鑰匙用雙蒸餾水清洗后180 ℃烘烤過(guò)夜。研缽、研棒、藥匙在使用前需放入-20 ℃冰箱預(yù)冷。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 CTAB法 ①取0.2 g菊花葉片于液氮中迅速冷卻充分研磨，將磨好的葉片迅速裝入無(wú)RNase的2 mL離心管中，加入65 ℃預(yù)熱的CTAB緩沖液（含10%的β-巰基乙醇） 1 mL，立即在振蕩器上劇烈振蕩30 s，65 ℃水浴鍋中孵育 10 min，每3～5 min顛倒混勻1次，動(dòng)作不要太劇烈。②加入等體積的氯仿 ∶異戊醇（CI，V ∶V=24 ∶1），用力顛倒混勻，4 ℃ 下12 000 r/min離心10 min。③取上清液于新的離心管中，加入等體積的CI，輕輕顛倒混勻，4 ℃下，12 000 r/min離心10 min。④取上清液于新離心管中，加入二倍體積的異丙醇，輕輕顛倒混勻，-20 ℃沉淀30 min以上，4 ℃下12 000 r/min 離心20 min，去上清。⑤用提前預(yù)冷的75%乙醇洗滌沉淀1次，去上清，在超凈工作臺(tái)中吹干沉淀，加入 40 μL ddH2O水溶解沉淀。

1.2.2 Trizol法 參照呂晉慧等的方法[2]。

1.2.3 改良Trizol法 ①向1.5 mL離心管中加入1 mL Trizol 和20 μL β-巰基乙醇，混勻。稱取0.2 g菊花葉片液氮研磨成粉末，轉(zhuǎn)移至離心管中，混勻后，靜置10 min，4 ℃下 12 000 r/min 離心5 min。②取上清，加入等體積的CI，混勻，4 ℃下12 000 r/min離心5 min。③重復(fù)步驟②2次。④取上清，加入等體積異丙醇，混勻，靜置10 min，4 ℃下 12 000 r/min 離心10 min。⑤棄上清，用75%乙醇洗滌沉淀2次，4 ℃下12 000 r/min離心10 min；棄上清，超凈工作臺(tái)吹干，加入40 μL ddH2O溶解沉淀。

1.2.4 試劑盒法 參照RNA prep Pure Kit試劑盒（天根生化科技有限公司，北京）說(shuō)明書。

1.2.5 總RNA完整性和純度檢測(cè) 取4 μL總RNA樣品在1%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，電壓150 V電泳10～15 min，電泳后用凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄。取1 μL總RNA樣品，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定波長(zhǎng)在260 nm和280 nm下的吸光度（以試驗(yàn)中溶解總RNA的ddH2O作為空白對(duì)照進(jìn)行調(diào)零），計(jì)算總RNA樣品濃度及RNA產(chǎn)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 菊花葉片總RNA的完整性分析

瓊脂糖凝膠電泳是檢測(cè)RNA質(zhì)量的一種重要方法。用1%的瓊脂糖凝膠對(duì)4種不同方法提取的RNA進(jìn)行電泳檢測(cè)，結(jié)果（圖1）表明，采用CTAB法提取的RNA條帶彌散且亮度低，伴有DNA污染，說(shuō)明提取的RNA質(zhì)量不好。Trizol法提取的RNA條帶復(fù)雜并且?guī)в休p微拖尾現(xiàn)象，5S條帶熒光亮度很大，說(shuō)明RNA嚴(yán)重降解；點(diǎn)樣孔有亮斑，說(shuō)明RNA樣品中含有多糖或蛋白質(zhì)污染。改良Trizol法相較于Trizol法，條帶少，拖尾現(xiàn)象不明顯，點(diǎn)樣孔雜質(zhì)少，但該方法還是未能完全去除多糖和酚類物質(zhì)，8S比28S亮度大，說(shuō)明28S有部分降解。試劑盒法提取的RNA，28S和18S條帶清晰，其熒光亮度接近2 ∶1，條帶沒(méi)有拖尾現(xiàn)象，點(diǎn)樣孔無(wú)亮斑，說(shuō)明RNA提取效果好。該方法最適用于菊花總RNA的提取，并用于后續(xù)反轉(zhuǎn)錄、PCR等試驗(yàn)。

2.2 菊花葉片總RNA的純度分析

利用紫外分光光度計(jì)對(duì)4種方法提取的菊花葉片總RNA的純度進(jìn)行檢測(cè)。260 nm和280 nm下的吸光度代表了核酸和蛋白質(zhì)等有機(jī)物含量，D260 nm/D280 nm的值直接反映出RNA中蛋白質(zhì)等有機(jī)物的污染程度。由表1可知，Trizol法的D260 nm/D280 nm值為2.147，產(chǎn)量為39.224 μg/g，改良Trizol法的D260 nm/D280 nm為2.171，產(chǎn)量為57.499 μg/g，說(shuō)明RNA中有少量蛋白質(zhì)等有機(jī)物污染，質(zhì)量較好，對(duì)于RNA質(zhì)量要求不高的試驗(yàn)，不影響后續(xù)使用。雖然CTAB法提取的RNA濃度高產(chǎn)量大，但不排除是因?yàn)槠溆蠨NA污染的影響。高純度RNA的D260 nm/D280 nm值應(yīng)介于1.8～2.0之間，試劑盒法中D260 nm/D280 nm為1.889，濃度和產(chǎn)量分別為144.000 μg/mL、28.080 μg/g。就試驗(yàn)所需時(shí)間來(lái)看，CTAB法所需要的時(shí)間最長(zhǎng)，后期還需要去除DNA。Trizol法和改良Trizol法所需的時(shí)間適中，分別為60 min和70 min。試劑盒法所需時(shí)間最短，僅為45 min。綜上，試劑盒法是菊花C008葉片總RNA提取質(zhì)量最好、效率最高的方法。

3 結(jié)論與討論

獲得高質(zhì)量無(wú)污染的RNA是進(jìn)行基因表達(dá)分析等后續(xù)分子試驗(yàn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，但是從植物組織中提取出高質(zhì)量的RNA是有一定難度的。由于植物組織中含有多糖、多酚、蛋白質(zhì)和其他次生代謝物質(zhì)，給高純度RNA的提取帶來(lái)一定難度。并且RNase廣泛存在且穩(wěn)定，使RNA的提取相較于DNA變得更加困難。不同植物采用的提取方法不同，同種植物的不同組織或相同組織在不同生長(zhǎng)階段所用的提取方法也不同[6-12]。所以，合適的總RNA提取方法的選擇，是轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、RT-PCR、基因克隆等分子生物學(xué)方面研究的根本保證。

菊花為多年生草本植物，其組織或器官中含有大量的多糖和酚類物質(zhì)，較多的次生代謝物質(zhì)經(jīng)常會(huì)對(duì)總RNA的產(chǎn)量和純度造成影響[2]。多糖的理化性質(zhì)和RNA相似，容易與RNA形成難溶的膠狀物[13-14]，然而在去除多糖干擾的過(guò)程中，也會(huì)去除一些RNA，使RNA產(chǎn)量減少。酚類物質(zhì)在材料勻漿時(shí)釋放出來(lái)被氧化，使其與RNA產(chǎn)生不可逆的褐化反應(yīng)，導(dǎo)致勻漿呈褐色[15-16]。CTAB法、改良Trizol法和試劑盒法均使用β-巰基乙醇作為強(qiáng)還原劑，目的是防止酚類物質(zhì)被氧化[17]。CTAB法是一種傳統(tǒng)的總RNA提取方法，但其提取的總RNA中有DNA污染，需要進(jìn)一步用DNase Ⅰ消除，由于DNase Ⅰ價(jià)格較貴，不適用于大量提取RNA。本試驗(yàn)Trizol法和改良Trizol法所提取的總RNA條帶均不只有5S、18S和28S這3條帶，在5S和18S之間還有條帶，可能是葉綠體RNA。改良Trizol法相較于Trizol法，用氯仿-異戊醇（V ∶V=24 ∶1）代替氯仿并進(jìn)行多次抽提，更加充分地沉淀多糖、酚類物質(zhì)等，這與王舒藜等的結(jié)論[18]相一致。試劑盒法所提取的總RNA雖然由于洗脫柱和過(guò)濾柱的作用導(dǎo)致濃度及產(chǎn)量不高[7]，但還是能夠滿足試驗(yàn)需要，而且試劑盒法所提取的總RNA完整性好、操作簡(jiǎn)單、所用時(shí)間短。綜上，試劑盒法是一種簡(jiǎn)單、高效的提取菊花葉片總RNA的方法。

對(duì)于植物總RNA的提取還應(yīng)該注意以下幾個(gè)方面：（1）試驗(yàn)材料盡量采用新鮮樣品，長(zhǎng)時(shí)間冷凍的樣品對(duì)植物總RNA的提取有一定影響。（2）采集新鮮樣品后應(yīng)立即用液氮速凍，如采集地距離實(shí)驗(yàn)室較遠(yuǎn)，應(yīng)在采集后立即放入冰盒，防止離體組織的RNA降解。（3）試驗(yàn)前將研缽和研棒于 -20 ℃ 冰箱內(nèi)預(yù)冷。如天氣炎熱，應(yīng)在磨樣前向研缽中先加入液氮再一次快速預(yù)冷。藥匙在液氮中快速預(yù)冷后可防止藥匙上有樣品殘留，減少樣品損失。（4）在抽提吸取上清液過(guò)程中，采用小量程多次吸取的方法，緩慢吸取上清，可減少多糖、酚類物質(zhì)等大分子與RNA作用一起沉淀。

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