張捷+李勤霞+張萍+余甜

摘要： 利用正交設(shè)計(jì)對新疆野核桃序列相關(guān)擴(kuò)增多態(tài)性PCR（SRAP-PCR）反應(yīng)體系中的5個(gè)因素（模板DNA、Mg2+、引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶濃度）在5水平上進(jìn)行優(yōu)化，對比不同濃度模板DNA對擴(kuò)增結(jié)果的影響，建立了新疆野核桃SRAP最佳反應(yīng)體系。結(jié)果表明，優(yōu)化的新疆野核桃SRAP-PCR最佳反應(yīng)體系為：20 μL的反應(yīng)體系中，2.5 μg/mL模板DNA、0.4 μmol/L引物、2 mmol/L Mg2+、0.2 mmol/L dNTPs、25 U/mL Taq酶U；最佳PCR擴(kuò)增程序的退火溫度為54 ℃。各因素?cái)U(kuò)增結(jié)果表明，Mg2+濃度對擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果影響最大，dNTPs濃度影響最小。運(yùn)用該體系對新疆野核桃樣本進(jìn)行了驗(yàn)證，表明該體系擴(kuò)增穩(wěn)定可靠。用該體系對100個(gè)SRAP引物組合進(jìn)行篩選，篩選出15個(gè)擴(kuò)增條帶清晰且多態(tài)性豐富的引物組合，為新疆野核桃種質(zhì)資源研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： SRAP分子標(biāo)記；新疆野核桃；正交試驗(yàn)；引物篩選；體系優(yōu)化

中圖分類號： S664.103 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）03-0064-03

新疆野核桃（Juglans regia L.）是胡桃科胡桃屬植物，也是栽培核桃（Uuglms regia L.）的野生種之一[1]，在我國僅分布于新疆伊犁鞏留縣（后稱野核桃溝自然保護(hù)區(qū)）內(nèi)，是我國珍貴的天然野生資源[2-4]。

國內(nèi)目前對于新疆野核桃領(lǐng)域的研究薄弱，而分子標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)在核桃的遺傳多樣性分析[5-13]、分子標(biāo)記輔助育種[14]、特異性基因標(biāo)記[15-16]和遺傳圖譜的構(gòu)建[17]等方面普遍應(yīng)用，但其飽和程度不高，不能滿足科研工作發(fā)展的需要。本研究利用正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)對新疆野核桃序列相關(guān)擴(kuò)增多態(tài)性PCR（SRAP-PCR）反應(yīng)體系進(jìn)行了優(yōu)化[18-20]，考察SRAP-PCR反應(yīng)體系中各因素的相互影響[21]，得到最佳優(yōu)化組合。與單因素試驗(yàn)相比，不但可以快速獲得試驗(yàn)結(jié)果，而且減少了試驗(yàn)的成本和工作量。并對100對SRAP引物進(jìn)行了多態(tài)性標(biāo)記篩選，得到一些多態(tài)性較高的SRAP引物組合[22-24]，為進(jìn)一步研究新疆野核桃種質(zhì)資源遺傳多樣性打下了一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 材料 試驗(yàn)材料為從新疆伊犁鞏留縣野核桃溝內(nèi)采集的野核桃葉片。

1.1.2 試劑 根據(jù)Li等已發(fā)表的SRAP引物[25]設(shè)計(jì)10條正向引物、10條反向引物序列（表1），由深圳華大基因科技服務(wù)有限公司合成；10×Taq Buffer（含Mg2+）、Taq DNA聚合酶、dNTPs、DNA Ladder（100 bp）、10×Loading buffer均購于北京全式金生物公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA的提取及檢測 以新疆野核桃的幼嫩葉片為材料，利用改良高鹽低pH值法提取基因組DNA[20]，干燥后加入1× TE溶解沉淀，檢驗(yàn)質(zhì)量后于-20 ℃條件下長期保存。試驗(yàn)所提取的DNA沉淀為白色，經(jīng)風(fēng)干后呈透明黏狀。在0.8%的瓊脂糖凝膠中，于100 V電壓下電泳1 h，經(jīng)0.5 μg/mL EB染色，然后在凝膠成像系統(tǒng)下拍照檢測DNA質(zhì)量。

1.2.2 PCR反應(yīng)體系優(yōu)化的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 利用L25（55）正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)[21]，對模板DNA、引物、Mg2+、dNTPs和Taq聚合酶濃度進(jìn)行5因素5水平篩選試驗(yàn)（表2）。

1.2.3 SRAP-PCR擴(kuò)增程序及擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測 制備總體積為20 μL的PCR 反應(yīng)體系，除變化因素外，其余的用ddH2O補(bǔ)足，所用的引物組合為F2+R3，引物序列見表1。SRAP-PCR的擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性 1 min，35 ℃復(fù)性1 min，72 ℃延伸2 min，5個(gè)循環(huán)；94 ℃變性1 min，54 ℃復(fù)性1 min，72 ℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸8 min，4 ℃保存。擴(kuò)增反應(yīng)在Thermal Cycler S1000型PCR儀上進(jìn)行，擴(kuò)增產(chǎn)物用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離（電泳儀電源為 DYY-10C型，電泳儀為DYCZ-20C型），快速銀染法顯色，清水清洗，裹上保鮮膜，最后在膠片觀察燈上觀察并拍照保存。

1.2.4 多態(tài)性SRAP引物組合的篩選 根據(jù)表2設(shè)計(jì)的正交優(yōu)化試驗(yàn)方案確定新疆野核桃SRAP-PCR的最佳反應(yīng)體系，用10條正向引物和10條反向引物組成的100對引物組合對48份不同區(qū)域的新疆野核桃材料進(jìn)行多態(tài)性SRAP引物組合的篩選。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA的提取

利用改良高鹽低pH值法所提取的新疆野核桃基因組DNA，經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示DNA條帶清晰，無拖尾現(xiàn)象，表明DNA完整（圖1）。通過UV2000紫外分光光度計(jì)對DNA濃度進(jìn)行檢測，測得D260 nm/D280 nm的比值在1.8～2.0之間。由此可知，經(jīng)上述方法提取的新疆野核桃DNA的質(zhì)量較高，能夠滿足SRAP反應(yīng)對DNA的要求。

2.2 正交設(shè)計(jì)優(yōu)化SRAP-PCR的結(jié)果分析

依據(jù)“1.2.2”節(jié)中設(shè)定的正交試驗(yàn)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)和聚丙烯酰胺凝膠電泳，根據(jù)電泳結(jié)果（圖2），統(tǒng)計(jì)擴(kuò)增條帶數(shù)量，將結(jié)果輸入SPSS 19.0軟件進(jìn)行方差分析（表3）。

從電泳結(jié)果可以看出，第6、10、15泳道電泳條帶多且清晰，都可作為新疆野核桃正交試驗(yàn)組合，但從經(jīng)濟(jì)性考慮，最后選擇第15個(gè)組合為新疆野核桃SRAP-PCR最佳反應(yīng)組合。

從方差分析中能夠看出，5種PCR因子的F值大小依次為：Mg2+濃度>引物濃度>Taq酶濃度>模板DNA濃度>dNTPs濃度，這表明Mg2+濃度對新疆野核桃SRAP-PCR的反應(yīng)體系有最大的影響。

依據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果，確定新疆野核桃SRAP-PCR的最優(yōu)反應(yīng)體系為：2.5 μg/mL模版DNA、2 mmol/L Mg2+、0.4 μmol/L 引物、0.2 mmol/L dNTPs、25 U/mL Taq酶，剩余體積用去離子水補(bǔ)齊至20 μL；最佳PCR擴(kuò)增程序的退火溫度為 54 ℃，相應(yīng)SRAP-PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃ 4 min；94 ℃ 45 s，35 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，5個(gè)循環(huán)；94 ℃ 45 s，54 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 8 min，4 ℃保存。

2.3 SRAP-PCR反應(yīng)體系的驗(yàn)證

從不同引物組合中隨機(jī)選取引物分別對48個(gè)樣品DNA進(jìn)行擴(kuò)增驗(yàn)證（圖3）。結(jié)果表明該反應(yīng)體系能得到較好的結(jié)果，且在不同的引物組合之間和不同的DNA樣品之間帶型有明顯差異，擴(kuò)增出的譜帶較清晰且多態(tài)性較豐富。

2.4 SRAP-PCR多態(tài)性引物組合的篩選

應(yīng)用“2.2”節(jié)建立的新疆野核桃SRAP-PCR的反應(yīng)體系，用由10個(gè)上游引物、10個(gè)下游引物組成的100對 SRAP-PCR的引物組合對48份新疆野核桃樣品進(jìn)行SRAP擴(kuò)增，每個(gè)擴(kuò)增試驗(yàn)都重復(fù)3次，并選取條帶清晰且重復(fù)性較好的結(jié)果進(jìn)行分析。最后篩選出15對條帶清晰，多態(tài)性好的引物組合：F1/R2、F1/R5、F1/R7、F2/R2、 F2/R3、F2/R4、F3/R2、F3/R3、F3/R4、F5/R1、F5/R2、F5/R5、F6/R8、F6/R9、F6/R10。其中F3/R2擴(kuò)增結(jié)果見圖4。

3 結(jié)論與討論

SRAP作為一種新型的分子標(biāo)記技術(shù)，不但具有多態(tài)性高、擴(kuò)增穩(wěn)定、引物通用和產(chǎn)量中等的特點(diǎn)，而且重復(fù)性較好，操作簡易。然而，SRAP分子標(biāo)記的擴(kuò)增結(jié)果容易受PCR反應(yīng)條件（比如DNA、dNTPs、Mg2+濃度、引物和Taq聚合酶用量等）和基因組的影響，并且不同的植物對SRAP-PCR反應(yīng)體系的要求也各不相同[21]。所以，對反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化是進(jìn)行SRAP分析的前提條件。

試驗(yàn)結(jié)果表明：Mg2+濃度對SRAP-PCR反應(yīng)體系的結(jié)果影響最大，而模板濃度和退火溫度的變化對SRAP-PCR反應(yīng)體系影響相對較為輕微。本試驗(yàn)建立了適合新疆野核桃的SRAP-PCR優(yōu)化體系，模版DNA濃度為2.5 μg/mL、Mg2+濃度為2.0 mmol/L、引物濃度為0.4 μmol/L、dNTPs濃度為 0.2 mmol/L、Taq酶濃度為25 U/mL，剩余體積用去離子水補(bǔ)齊至 20 μL。利用該體系篩選出15對擴(kuò)增產(chǎn)物條帶清晰并且多態(tài)性較豐富的引物組合。新疆野核桃SRAP-PCR優(yōu)化體系的建立和引物組合的篩選為野核桃種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析研究奠定了良好的基礎(chǔ)。

利用本研究的反應(yīng)體系，能擴(kuò)增出條帶清晰、多態(tài)性豐富的譜帶，且重復(fù)性好、穩(wěn)定性強(qiáng)，這為今后新疆野核桃在SRAP這種新型分子標(biāo)記方面的研究提供了依據(jù)，也為新疆野核桃通過SRAP分子標(biāo)記技術(shù)在種質(zhì)資源遺傳多樣性和野核桃遺傳圖譜的構(gòu)建方面提奠定了基礎(chǔ)。

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